一种利用抗生素处理蚊子的细菌口服喂养实验方法

摘要

本文介绍了一种研究单个蚊虫肠道细菌作用的实验方案，包括蚊虫中肠可培养微生物的分离与鉴定、使用抗生素清除蚊虫肠道细菌，以及重新引入一种特定的细菌物种。

摘要

蚊子的中肠含有一个高度动态的微生物组，该微生物组影响宿主的代谢、繁殖、适应性以及传播病原体的能力。已有研究探讨了肠道微生物整体对宿主的影响；然而，不同的微生物可能对宿主产生不同的作用。本文提供了研究每种特定蚊子肠道微生物及其潜在作用机制的方法学。

本实验方案包含两个部分。第一部分介绍如何解剖蚊子中肠、分离可培养的细菌菌落并鉴定细菌种类。第二部分提供制备抗生素处理的蚊子以及重新引入特定细菌种类的操作步骤。

引言

蚊子被认为是人类病原体疾病最重要的传播媒介，可传播包括寨卡病毒、登革病毒以及疟原虫（Plasmodium）在内的上百种病原体¹。当蚊子吸食血液以获取产卵所需的营养时，可能通过消化道从感染宿主意外摄入病原体²。值得注意的是，蚊子的中肠在血液消化和病原体入侵过程中均起着关键作用，其内部定植着一个高度动态的微生物组³。

多项研究采用依赖培养的方法或细菌测序分析，对实验室饲养和野外采集的蚊虫微生物群进行了表征^4,5,6。在不同研究中，常从蚊虫体内分离出包括泛菌属（Pantoea）、沙雷氏菌属（Serratia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、伊丽莎白金菌属（Elizabethkingia）和肠球菌属（Enterococcus）在内的菌种^5,7,8,<....

方案

1. 中肠解剖与可培养细菌的分离

1. 准备蚊虫以进行解剖。
   1. 在蚊虫羽化后7–9天，使用吸虫器收集蚊虫。将收集的蚊虫置于4 °C环境中处理3–5分钟以进行麻醉，并将麻醉后的蚊虫保存在冰冷的培养皿中，直至开始解剖。
2. 对实验器械及蚊虫体表进行灭菌。
   1. 使用75%乙醇喷洒实验台、解剖显微镜、镊子和载玻片，以对这些器具进行灭菌，防止环境中的细菌造成污染。
   2. 准备一个含有75%乙醇的无菌培养皿，以及两个含有无菌1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）的培养皿。
   3. 将蚊虫浸入75%乙醇中并轻轻振荡3分钟，以实现体表灭菌；随后用1× PBS缓冲液冲洗两次，以防残留乙醇影响解剖后肠道菌群的活性。
3. 解剖蚊虫中肠。
   1. 将完成体表灭菌的蚊虫转移至载玻片上，加入一滴无菌1× PBS缓冲液，并在解剖显微镜下进行解剖操作。
   2. 在解剖显微镜较低放大倍数下，小心去除蚊虫的足、翅和头部，以防其移动。通过直接剪断而非拉扯的方式去除蚊虫最后一节腹节，以避免消化道断裂。
   3. 用镊子夹住蚊虫的胸部和腹部末端，轻柔地拉出其消化道。所获得的消化道通常包含嗉囊、前肠、中肠、后肠以及马氏管。
   4. 将解剖显微镜调至较高放大倍数，从已解剖的消化道中去除嗉囊、前肠、后肠及马氏管，从而分离....

结果

用抗生素处理和未用抗生素处理的蚊子中肠被取出用于DNA提取，并使用通用细菌引物进行qPCR检测。图1显示了对照组和抗生素处理组中细菌16S rRNA的表达情况。结果显示，约98%的肠道细菌已被清除，青霉素和链霉素的肠道灭菌效果成功。

通过所述方法，分离并鉴定了细菌菌株。C. meningosepticum 是一种不发酵、氧化酶阳性、革兰氏阴性的好氧杆菌，属于Chryseobacterium属。图 2展示了用含C. meningosepticum的血液饲喂经抗生素处理的蚊子后，每只蚊子平均产卵数。图 3展示了摄入含C. meningosepticum血液餐后24小时，卵巢发育相关基因的表达情况。卵巢发育相关基因及其引物序列概览列于表1中。

从肠道细菌中分离出的菌株，在去除肠道细菌后，将完全吸血的蚊子分为三组。第一组和第二组各.......

讨论

关于宿主-微生物相互作用的研究发现，不同的肠道微生物通过不同的机制影响宿主的生理功能。本文介绍了研究蚊子肠道微生物各自作用的方法，包括蚊子中肠的解剖、可培养肠道细菌的培养、抗生素处理以及重新引入目标细菌。

为了确保抗生素治疗的成功，进行实验时必须考虑以下细节。在本方案中，蚊虫通过使用含有10%蔗糖溶液的棉球进行处理，该溶液每毫升包含20单位的青霉素和20 µg的链霉素，持续处理3天^11,16。青霉素作为广谱抗生素，主要针对革兰氏阳性菌；链霉素则作为广谱抗生素，主要针对革兰氏阴性菌²⁰。抗生素的正确保存对于实现有效的抗生素治疗至关重要²¹。青霉素G在-18 °C下保存时，其稳定性至少可达3个月；链霉素在4 °C下保存时，稳定性至少可达12个月²²。尽管抗生素品牌或保存时间的差异可能导致微生物清除效果出现轻微差异，但仍有必要在每.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物	Sigma	A2383	腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物已被用于配制腺苷三磷酸（ATP）标准溶液
Aedes aegypti			雌性蚊子
抗凝管	BD Vacutainer	363095	采集新鲜血液
离心管	生工生物	F601620-0010	1.5 ml，无色透明，带刻度，无菌
棉球
一次性组织研磨杵	生工生物	F619072-0001	70 mm 长，锥形，蓝色，无菌
无水乙醇	Paini		稀释为 75% 乙醇使用
镊子	RWD	F11029	用于解剖
Hemotek 膜饲系统	Hemotek		饲喂系统组件，包括  Hemotek 温度控制器、饲喂器外壳组件、金属饲喂器组件
摇床培养箱		ZQZY-78AN
接种环	生工生物	F619312-0001	10 μl，黄色
LB 琼脂粉	生工生物	A507003	胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂 15.0 g
LB 液体培养基粉	生工生物	A507002	胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g
显微镜	蔡司	Stemi508
纸杯			放置蚊子
封口膜	生工生物	F104002	4 英寸 × 125 英尺
培养皿	生工生物	F611203
普鲁卡因青霉素 G 盐水合物	生工生物	A606248	白色粉末，溶于水，溶于甲醇，微溶于水、乙醇
单通道移液器	Gilson
硫酸链霉素	生工生物	A610494	硫酸链霉素是一种氨基葡萄糖类抗生素，可干扰原核生物蛋白质的合成
蔗糖	生工生物	A502792	溶于水、乙醇和甲醇，微溶于甘油和吡啶
TIANamp 细菌DNA提取试剂盒	天根	DP302	用于提取DNA
实用型织物-白色蚊帐网
涡旋混合器	Scintic Industries	S1-0246
1.5 ml EP管	生工生物	F600620
10X PBS缓冲液	生工生物	E607016	本产品为10X溶液，使用前需稀释10倍，pH值为7.4