一种利用抗生素处理蚊子的细菌口服喂养实验方法

摘要

本文介绍了一种研究单个蚊虫肠道细菌作用的实验方案，包括蚊虫中肠可培养微生物的分离与鉴定、使用抗生素清除蚊虫肠道细菌，以及重新引入一种特定的细菌物种。

摘要

蚊子的中肠含有一个高度动态的微生物组，该微生物组影响宿主的代谢、繁殖、适应性以及传播病原体的能力。已有研究探讨了肠道微生物整体对宿主的影响；然而，不同的微生物可能对宿主产生不同的作用。本文提供了研究每种特定蚊子肠道微生物及其潜在作用机制的方法学。

本实验方案包含两个部分。第一部分介绍如何解剖蚊子中肠、分离可培养的细菌菌落并鉴定细菌种类。第二部分提供制备抗生素处理的蚊子以及重新引入特定细菌种类的操作步骤。

引言

蚊子被认为是人类病原体疾病最重要的传播媒介，可传播包括寨卡病毒、登革病毒以及疟原虫（Plasmodium）在内的上百种病原体¹。当蚊子吸食血液以获取产卵所需的营养时，可能通过消化道从感染宿主意外摄入病原体²。值得注意的是，蚊子的中肠在血液消化和病原体入侵过程中均起着关键作用，其内部定植着一个高度动态的微生物组³。

多项研究采用依赖培养的方法或细菌测序分析，对实验室饲养和野外采集的蚊虫微生物群进行了表征^4,5,6。在不同研究中，常从蚊虫体内分离出包括泛菌属（Pantoea）、沙雷氏菌属（Serratia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、伊丽莎白金菌属（Elizabethkingia）和肠球菌属（Enterococcus）在内的菌种^5,7,8,9。有趣的是，蚊虫肠道微生物群在群落多样性及细菌种类数量上均呈现动态波动，受发育阶段、蚊种、地理来源和取食行为的影响⁴。研究表明，吸血行为会显著增加总细菌负荷，导致肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌迅速扩增，同时整体多样性下降^10,11。此外，蚊虫幼虫阶段的肠道微生物群通常在化蛹和羽化期间经历变态过程时被清除；因此，新羽化的成蚊需要重新定植其微生物群⁴。

肠道微生物群在多个方面调节昆虫的生理功能，包括营养吸收、免疫、发育、繁殖以及媒介能力¹²。无菌的蚊子幼虫无法发育至一龄之后，而通过口服补充细菌可恢复其发育，表明蚊子肠道微生物对幼虫发育至关重要^13,14。此外，肠道细菌的耗竭会延缓血液餐的消化和营养吸收，影响卵母细胞成熟，并减少产卵量¹⁵。另外，与经抗生素处理的蚊子相比，具有肠道菌群的蚊子表现出更强的免疫应答，其抗菌肽的表达持续升高，从而增强对其他病原体感染的抵抗能力¹⁶。在这些研究中，通常通过口服给予抗生素以清除蚊子肠道中的全部细菌，随后开展实验，比较无菌蚊子与携带共生微生物的蚊子之间的差异。然而，蚊子中肠栖息着多种多样的微生物群落，每种细菌物种可能对宿主生理产生独特的影响。

蚊虫微生物群以不同的效应调节媒介能力。定植由 变形杆菌属 源自登革热流行区野外蚊虫的分离物可上调抗菌肽表达并增强对登革病毒侵染的抗性¹⁶. 昆虫病原真菌 球孢白僵菌 激活Toll和JAK-STAT免疫通路以抵抗节肢动物传播病毒的感染¹⁷相比之下，该真菌 Talaromyces 分离自 埃及伊蚊 中肠通过调控肠道胰蛋白酶活性促进登革病毒的感染¹⁸此外， 粘质沙雷氏菌 通过一种名为分泌蛋白促进虫媒病毒传播 Sm增强素, 可消化蚊子肠上皮上的黏蛋白层¹⁹.

本实验提供了一种系统且直观的方法，用于蚊子中肠的解剖、可培养细菌菌落的分离、细菌种类的鉴定以及通过口服喂养进行回补。该方法展示了以共生细菌Chryseobacterium meningosepticum进行血液喂养后，对蚊子卵巢发育及产卵行为的代表性实验结果。

方案

1. 中肠解剖与可培养细菌的分离

1. 准备蚊虫以进行解剖。
   1. 在蚊虫羽化后7–9天，使用吸虫器收集蚊虫。将收集的蚊虫置于4 °C环境中处理3–5分钟以进行麻醉，并将麻醉后的蚊虫保存在冰冷的培养皿中，直至开始解剖。
2. 对实验器械及蚊虫体表进行灭菌。
   1. 使用75%乙醇喷洒实验台、解剖显微镜、镊子和载玻片，以对这些器具进行灭菌，防止环境中的细菌造成污染。
   2. 准备一个含有75%乙醇的无菌培养皿，以及两个含有无菌1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）的培养皿。
   3. 将蚊虫浸入75%乙醇中并轻轻振荡3分钟，以实现体表灭菌；随后用1× PBS缓冲液冲洗两次，以防残留乙醇影响解剖后肠道菌群的活性。
3. 解剖蚊虫中肠。
   1. 将完成体表灭菌的蚊虫转移至载玻片上，加入一滴无菌1× PBS缓冲液，并在解剖显微镜下进行解剖操作。
   2. 在解剖显微镜较低放大倍数下，小心去除蚊虫的足、翅和头部，以防其移动。通过直接剪断而非拉扯的方式去除蚊虫最后一节腹节，以避免消化道断裂。
   3. 用镊子夹住蚊虫的胸部和腹部末端，轻柔地拉出其消化道。所获得的消化道通常包含嗉囊、前肠、中肠、后肠以及马氏管。
   4. 将解剖显微镜调至较高放大倍数，从已解剖的消化道中去除嗉囊、前肠、后肠及马氏管，从而分离出蚊虫中肠。
   5. 去除嗉囊时需格外小心，因蚊虫摄取糖餐后，嗉囊会膨胀并形似中肠。马氏管是一组细长的排泄管，位于中肠与后肠交界处。
4. 分离肠道细菌。
   1. 将解剖所得的中肠转移至含有200 µL无菌1× PBS缓冲液的无菌1.5 mL离心管中。
   2. 在无菌操作台中，使用无菌研杵充分研磨中肠，使肠道细菌完全释放至缓冲液中。
   3. 将匀浆液进行连续10倍梯度稀释，共稀释三个浓度梯度。取每种稀释液各50 µL接种于LB（Luria肉汤）琼脂平板上，并均匀涂布。若中肠内肠道菌群浓度较高，则需进行更多梯度稀释，以便获得单菌落。
   4. 将平板置于37 °C培养1–2天，直至可见单菌落形成。
5. 物种鉴定
   1. 挑取单菌落，分别接种至含有50 mL LB液体培养基的150 mL三角瓶中。
   2. 在37 °C条件下振荡培养过夜。
   3. 使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，并通过聚合酶链式反应（PCR）扩增16S rDNA。
      注：16S rDNA中存在多个保守区域。基于这些保守区域可设计通用引物，用于扩增所有细菌的16S rDNA片段。这些引物具有细菌特异性，而16S rDNA可变区的序列差异可用于区分不同细菌。因此，16S rDNA被广泛应用于细菌鉴定。
   4. 通过琼脂糖凝胶电泳及商业化凝胶回收试剂盒，从PCR产物中回收并纯化DNA片段。
   5. 对纯化的DNA片段进行测序，获得细菌基因序列。
   6. 将16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的细菌序列进行比对，选择“Bacteria and Archaea”数据库。
      注：当待测序列与GenBank中最接近的序列相似度≥99%时，可鉴定至物种水平；若相似度<99%但≥95%，则归入相应属。

2. 抗生素处理与细菌重新引入

1. 配制抗生素溶液。
   1. 称取适量蔗糖、青霉素和链霉素，配制含10%蔗糖的溶液，其中每毫升含有20单位青霉素和20 µg链霉素。
2. 用抗生素溶液喂食蚊子。
   1. 将蚊子置于4 °C下麻醉3–5分钟。将蚊子转移至纸杯中。用纱布覆盖杯口，并用胶带将纱布固定，防止蚊子逃逸。
   2. 将无菌棉球浸入抗生素溶液中，小心地放置在蚊子杯上。使用前轻轻挤压棉球，避免蚊子因滴落的液体而溺亡。
   3. 用一个10 cm的培养皿覆盖棉球，防止水分蒸发。连续三天，每天更换棉球两次。
3. 确认抗生素处理的效果。
   1. 根据上述方法，解剖经抗生素处理的蚊子的中肠。
   2. 将解剖得到的中肠转移至含有200 µL无菌1×PBS缓冲液的无菌1.5 mL离心管中。
   3. 在无菌操作台中，使用无菌研杵充分研磨中肠，使肠道细菌完全释放到缓冲液中。
   4. 使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取肠道微生物DNA。
   5. 利用通用真细菌引物（16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT 和 R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT），对基因组DNA进行实时定量PCR（qPCR）以定量细菌。
4. 细菌悬液的制备
   1. 使用分光光度计测定细菌溶液浓度。取1 OD（OD600）的细菌悬液加入1 mL离心管中，在4 °C下以5,000 × g离心5分钟。
   2. 弃去上清液，向1.5 mL离心管中加入1 mL无菌1×PBS缓冲液用于 悬浮沉淀。
   3. 在4 °C下以5,000 × g离心5分钟；弃去上清液。
   4. 重复步骤2.4.2和2.4.3。
   5. 向细菌沉淀中加入200 µL无菌1×PBS缓冲液。
   6. 向无菌1.5 mL离心管中加入600 µL 10%蔗糖溶液、200 µL 10 mm ATP（作为促食剂）和200 µL细菌悬液，涡旋混匀。或者，将细菌沉淀重悬于热灭活的血液中。
   7. 热灭活血液的制备
      1. 使用抗凝管采集新鲜血液。
      2. 取2–3 mL新鲜血液，在4 °C下以1,000 × g离心10分钟，分离血浆和血细胞。注意：在离心和洗涤过程中会有血液损失，需预先计算用量。
      3. 将血浆收集至新的1.5 mL离心管中，在56 °C下热灭活1小时。
      4. 向1.5 mL离心管中加入500 µL无菌1×PBS缓冲液用于 悬浮血细胞，在4 °C下以1,000 × g离心10分钟，然后弃去上清液。
      5. 重复步骤2.4.7.4两次。
      6. 用热灭活的血浆重悬血细胞，获得热灭活血液。
      7. 按照步骤2.4.1至2.4.4操作，获得1 OD的细菌沉淀。
      8. 用1 mL热灭活血液重悬细菌沉淀。
5. 用细菌悬液喂食蚊子。
   1. 在喂食细菌前，将蚊子饥饿处理24小时，以便抗生素充分代谢。
   2. 组装膜饲系统。
   3. 用Parafilm密封无菌饲喂装置，也可使用 胶原膜替代。
   4. 套上塑料环，并用Parafilm固定，以防因取食过程中的摩擦导致破损。
   5. 缓慢将制备好的细菌溶液加入饲喂装置中。注意：双孔饲喂装置中仅能填充其中一个孔，且仅从试剂滴加侧覆盖饲喂装置。
   6. 将饲喂装置连接至预热至37 °C的饲喂系统（模拟人体温度以吸引蚊子）。将饲喂装置置于装有蚊子的纸杯上，饲喂90分钟。
   7. 饲喂结束后，将蚊子置于4 °C下麻醉3–5分钟，并将麻醉后的蚊子保持在冰冻的培养皿中。
   8. 挑选完全吸血的蚊子用于后续研究。

结果

用抗生素处理和未用抗生素处理的蚊子中肠被取出用于DNA提取，并使用通用细菌引物进行qPCR检测。图1显示了对照组和抗生素处理组中细菌16S rRNA的表达情况。结果显示，约98%的肠道细菌已被清除，青霉素和链霉素的肠道灭菌效果成功。

通过所述方法，分离并鉴定了细菌菌株。C. meningosepticum 是一种不发酵、氧化酶阳性、革兰氏阴性的好氧杆菌，属于Chryseobacterium属。图 2展示了用含C. meningosepticum的血液饲喂经抗生素处理的蚊子后，每只蚊子平均产卵数。图 3展示了摄入含C. meningosepticum血液餐后24小时，卵巢发育相关基因的表达情况。卵巢发育相关基因及其引物序列概览列于表1中。

从肠道细菌中分离出的菌株，在去除肠道细菌后，将完全吸血的蚊子分为三组。第一组和第二组各...

讨论

关于宿主-微生物相互作用的研究发现，不同的肠道微生物通过不同的机制影响宿主的生理功能。本文介绍了研究蚊子肠道微生物各自作用的方法，包括蚊子中肠的解剖、可培养肠道细菌的培养、抗生素处理以及重新引入目标细菌。

为了确保抗生素治疗的成功，进行实验时必须考虑以下细节。在本方案中，蚊虫通过使用含有10%蔗糖溶液的棉球进行处理，该溶液每毫升包含20单位的青霉素和20 µg的链霉素，持续处理3天^11,16。青霉素作为广谱抗生素，主要针对革兰氏阳性菌；链霉素则作为广谱抗生素，主要针对革兰氏阴性菌²⁰。抗生素的正确保存对于实现有效的抗生素治疗至关重要²¹。青霉素G在-18 °C下保存时，其稳定性至少可达3个月；链霉素在4 °C下保存时，稳定性至少可达12个月²²。尽管抗生素品牌或保存时间的差异可能导致微生物清除效果出现轻微差异，但仍有必要在每...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物	Sigma	A2383	腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物已被用于配制腺苷三磷酸（ATP）标准溶液
Aedes aegypti			雌性蚊子
抗凝管	BD Vacutainer	363095	采集新鲜血液
离心管	生工生物	F601620-0010	1.5 ml，无色透明，带刻度，无菌
棉球
一次性组织研磨杵	生工生物	F619072-0001	70 mm 长，锥形，蓝色，无菌
无水乙醇	Paini		稀释为 75% 乙醇使用
镊子	RWD	F11029	用于解剖
Hemotek 膜饲系统	Hemotek		饲喂系统组件，包括  Hemotek 温度控制器、饲喂器外壳组件、金属饲喂器组件
摇床培养箱		ZQZY-78AN
接种环	生工生物	F619312-0001	10 μl，黄色
LB 琼脂粉	生工生物	A507003	胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂 15.0 g
LB 液体培养基粉	生工生物	A507002	胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g
显微镜	蔡司	Stemi508
纸杯			放置蚊子
封口膜	生工生物	F104002	4 英寸 × 125 英尺
培养皿	生工生物	F611203
普鲁卡因青霉素 G 盐水合物	生工生物	A606248	白色粉末，溶于水，溶于甲醇，微溶于水、乙醇
单通道移液器	Gilson
硫酸链霉素	生工生物	A610494	硫酸链霉素是一种氨基葡萄糖类抗生素，可干扰原核生物蛋白质的合成
蔗糖	生工生物	A502792	溶于水、乙醇和甲醇，微溶于甘油和吡啶
TIANamp 细菌DNA提取试剂盒	天根	DP302	用于提取DNA
实用型织物-白色蚊帐网
涡旋混合器	Scintic Industries	S1-0246
1.5 ml EP管	生工生物	F600620
10X PBS缓冲液	生工生物	E607016	本产品为10X溶液，使用前需稀释10倍，pH值为7.4