本文提供了在有机溶剂混合物中利用γ修饰的肽核酸寡聚体设计和自组装纳米结构的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
目前，DNA 和 RNA 纳米技术的策略能够在水相或高度水合介质中实现多种核酸纳米结构的自组装。本文中，我们描述了详细的实验方案，可通过具有独特可寻址性的单链γ修饰肽核酸（γPNA）瓦片在有机溶剂混合物中实现纳米纤维结构的自组装。每个单链瓦片（SST）是由两个串联的6碱基模块化结构域组成的12碱基γPNA寡聚体。每个结构域可通过程序化互补性与相邻链上的互补结构域结合，从而形成可生长至微米长度的纳米纤维。SST结构单元由总共9种寡聚体组成，以实现三螺旋纳米纤维的形成。与形成直径均一的类似DNA纳米结构不同，这些γPNA体系在有机溶剂混合物中自组装时，会在宽度方向上发生纳米纤维的束化。因此，本文所述的自组装方案还包括使用常规表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS），以减少束化效应。
引言
先前的研究已表明，使用天然存在的核酸（如DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10和RNA11,12）在水相或高度水合介质中成功构建了多种复杂的纳米结构1,2,3,4,5,
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方案
1. γPNA 序列设计
- 从加州理工学院 Winfree 实验室开发的 DNA 设计工具箱22 下载至用于设计序列的编程脚本所在文件夹中23。
- 在该序列设计文件夹中，打开一个支持扩展名为“ .m”的第四代编程语言环境，然后使用以下命令将先前下载的“DNAdesign”文件夹添加到路径中：
>> addpath DNAdesign - 随后使用以下命令运行名为“PNA3nanofiber.m”的脚本（见补充图1）：
>> PNA3nanofiber - 运行此脚本以生成名为“thisSeqs”和“thisScore”的变量。“thisSeqs”变量包含所设计的寡核苷酸序列，“thisScore”为惩罚评分。
- 多次运行该脚本以获得最低评分。20次此类运行的示例见表1。
- 手动确认所生成序列各结构域与指定的 SST 结构基序之间的 Watson-Crick 互补性。3-螺旋纳米纤维结构的序列设计规范见表2。
- 对生成的序列进行以下验证：
- 避免使用四个连续的 C 和 G 碱基。
- 手动选择特定序列，用于在 N 端功能化修饰荧光染料和生物素分子，....
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结果
上述章节中讨论的方案描述了如何从DNA纳米纤维设计一种改良的SST基序，以利用多种不同的γPNA寡聚体稳健地生成自组装纳米纤维结构。本节描述了对成功重复上述方案所获得数据的解读。
按照第5节所述方案，在75% DMSO:H2O（v/v）中退火的γPNA寡聚体样品，经显微观察可最清晰地显示结构有序的组装形态，如图4A所示。在75% DMF:H2O（v/v）溶剂条件下，形成针状或棘状纳米结构（图4B）；根据我们的经验，40% 1,4-二氧六环:H2O（v/v）条件下，使用TIRF显微镜观察时仅可见稀疏分布的丝状纳米结构（图4C）。此外，在75% DMSO:H2O（v/v）中形成的γPNA纳米管样品，经第6节所述步骤处理后，在透射电子显微镜（TEM）的高倍率或纳米级分辨率下观察，可发现纳米纤维存在束状聚集现象（
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讨论
本文重点介绍将现有的核酸纳米技术方案改进并适配于有机溶剂混合体系的方法。文中所述方法主要针对特定极性非质子有机溶剂实验条件下的方案修改与问题排查。该领域尚存大量未开发的潜力，其他已建立的核酸纳米技术方案亦有望在此类溶剂环境中实现适配。这将有助于推动其在聚合物合成和多肽合成等领域的应用整合，而这些领域通常使用类似的有机溶剂25,26。此外，本文还着重强调在实施上述方案时需特别注意的关键步骤。
在制备自组装样品时，需注意将DMSO和DMF条件下的水体积百分比保持在25%（v/v）。因此，用于自组装的有机溶剂也应使用无水溶剂。纳米纤维结构具有疏水性，在水含量增加时会发生聚集。
与能够形成特定长度结构的支架式DNA折纸方法不同，当前用于γPNA纳米纤维及其他已建立的DNA SST纳米管的SST基序设计无法产生具有特定长度的结构。这些纳米管可发生聚合，形成长度范围达数微米（最长可达11 µm）的结构。由于同样的原因，无法.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作部分得到了美国国家科学基金会资助项目1739308、NSF CAREER资助项目1944130以及美国空军科学研究办公室资助项目FA9550-18-1-0199的支持。γPNA序列由Trucode Gene Repair, Inc.的Tumul Srivastava博士慷慨惠赠。我们感谢Erik Winfree博士和Rizal Hariadi博士在DNA设计工具箱MATLAB代码方面提供的有益讨论。我们还要感谢Joseph Suhan、Mara Sullivan以及生物成像中心在TEM数据采集方面提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| γPNA 链/寡聚物 | Trucode Gene Repair Inc. | 第 2.1 节 | |
| 紫外-可见分光光度计 | Agilent | Varian Cary 300 | 第 3.1.2 节 |
| 石英比色皿 | Starna | 29-Q-10 | 第 3.1.1 节 |
| PCR 仪（热循环仪） | Bio Rad | C1000 touch | 第 4.1 节 |
| 0.2 mL PCR 管 | VWR | 53509-304 | 第 4.5 节 |
| 无水 DMF | VWR | EM-DX1727-6 | 第 4.6 节 |
| 无水 DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | 第 4.6 节 |
| 无水 1,4-二氧六环 | Fisher Scientific | AC615121000 | 第 4.6 节 |
| 10× 磷酸盐缓冲液（PBS） | VWR | 75800-994 | 第 3.1.1 节 |
| 显微镜载玻片 | VWR | 89085-399 | 第 5.2 节 |
| 玻璃盖玻片 | VWR | 48382-126 | 第 5.2 节 |
| 2% 火棉胶乙酸戊酯溶液 | Sigma-Aldrich | 9817 | 第 5.2 节 |
| 乙酸异戊酯 | VWR | 200001-180 | 第 5.2 节 |
| 生物素化牛血清白蛋白（Biotin-BSA） | Sigma-Aldrich | A8549 | 第 5.3 节 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A2153 | 第 5.4 节 |
| 链霉亲和素 | Sigma-Aldrich | 189730 | 第 5.5 节 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | 第 5.7 节 |
| 全内反射荧光显微镜 | Nikon | Nikon Ti2-E | 第 5.8 节 |
| 透射电子显微镜 | Joel | JEM 1011 | 第 6.6 节 |
| 镊子 | Dumont | 0203-N5AC-PO | 第 6.3 节 |
| 醋酸铀酰 | Electron Microscopy Sciences | 22400 | 第 6.1 节 |
| Formvar 包被铜网（300 目） | Ted Pella Inc. | 1701-F | 第 6.2 节 |
| Formvar-一氧化硅 A 型铜网（300 目） | Ted Pella Inc. | 1829 | 第 6.2 节 |
| DNA 寡聚物/链 | IDT | 第 7.1 节 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | VWR | 97064-860 | 第 8.1 节 |
参考文献
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G.
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重印与许可
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