Method Article

将伽马改性肽核酸自组装成有机溶剂混合物中复杂的纳米结构

DOI:

10.3791/61351

⸱

June 26th, 2020

 ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Department of Biomedical Engineering, Carnegie Mellon University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Carnegie Mellon University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文为有机溶剂混合物中伽马改性肽核酸寡聚物的纳米结构设计和自组装提供了方案。

Abstract

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DNA 和 RNA 纳米技术中的当前策略使各种核酸纳米结构在水性或基本水合介质中自组装。在这篇文章中，我们描述了详细的协议，通过独特的可处理、单链、伽马改性肽核酸 （+PNA） 瓷砖的自组装，在有机溶剂混合物中构建纳米纤维结构。每个单链瓦 （SST） 是一个 12 基 +PNA 寡聚物，由两个串联的模块化域组成，每个模块有 6 个基。每个域都可以绑定到相邻链上的相互互补域，使用编程的互补性来形成纳米纤维，可以长到微米的长度。SST 图案由 9 个总寡聚物组成，能够形成 3 螺旋纳米纤维。与形成直径单分散结构的DNA纳米结构相比，这些αPNA系统形成纳米纤维，在有机溶剂混合物自组装过程中沿宽度捆绑。因此，此处描述的自组装协议还包括传统的表面活性剂，硫酸钠 （SDS），以减少捆绑效应。

Introduction

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成功建造许多复杂的纳米结构1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12在水性或实质水合介质中使用 天然存在的核酸，如DNA1、2、3、4、5、6、7、8、9、10

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Protocol

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1. [PNA 序列设计]

  1. 下载由加州理工学院23 Winfree 实验室开发的 DNA 设计工具箱 22 下载到包含用于设计序列的编程脚本的文件夹中。
  2. 在该序列设计文件夹中，打开与文件扩展名".m"兼容的第四代编程语言，然后使用以下命令将以前下载的"DNAdesign"文件夹添加到路径中:
    >> 附加路径 DNAdesign
  3. 随后使用以下命令运行以下名为"PNA3naofiber.m"（参见附加图 1）:
    >> PNA3nanofiber
  4. 运行此脚本以创建名为"thisSeqs"和"thisScore"的变量。变量"thisSeqs"包含设计的寡聚物的序列，"thisScore"是惩罚分数。
  5. 多次运行脚本以获得最少的分数。表 1 中显示了 20 个 此类运行的示例。
  6. 手动确认指定 SST 结构图案生成的序列的每个域所需的 Watson-Crick 互补性。表2中显示了3螺旋纳米纤维结构 的序列规格。
  7. 验证生成的序列的以下内容。
    1. 避免使用连续的四个 C 和 G 基座。
    2. 手动选择使用荧光染料和生物素分子进行N-终端功能化的特定序列，以便进行荧光显微镜研....

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Results

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上述各节中讨论的协议描述了DNA纳米纤维的经过调整的SST图案的设计，用于使用多种不同αPNA寡聚物的自组装纳米纤维结构的强健生成。本节介绍对从成功娱乐所述协议中获得的数据的解释。

按照第5节所述的TIRF对75%DMSO中退火的αPNA寡聚物样本的TIRF成像方案，H2O （v/v） 最容易提供在微观观察下组织良好的结构的证据，如图4A所示。75% DMF: H2O （v/v） 溶剂条件导致尖刺状或针状纳米结构 （图 4B）， 根据我们的经验， 40% 1，4 二氧烷: H2O （v/v） 条件显示使用 TIRF 显微镜 （图4C）时细长纳米结构的稀疏装饰 （ 图 4C ）.此外，在 75% DMSO 中形成的 +PNA 纳米管的样品:H2O （v/v） 演示了在 TEM 成像期间以高放大率或纳米分辨率捆绑的纳米纤维.......

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Discussion

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本文重点介绍对有机溶剂混合物的现有核酸纳米技术方案的适应和改进。此处介绍的方法侧重于在选择极性有机溶剂的固定实验空间内进行修改和故障排除。其他已建立的核酸纳米技术方案尚未在此空间内加以调整，目前尚有未探索的潜力。这可以通过整合在其他领域，如聚合物和肽合成，通常执行在类似的有机溶剂25，26的潜在应用。此外，我们在此重点介绍在练习上述协议时要遵守的关键步骤。

在准备自组装样品时，对于 DMSO 和 DMF 条件，保持水的体积百分比在 25% （v/v） 非常重要。因此，必须认识到用于自组装的有机溶剂也应该来自无水库存。纳米纤维结构具有疏水性，在增加的含水量中聚集。

与能够创建离散长度结构的脚手架DNA折纸方法不同，目前为+PNA纳米纤维和其他先前建立的DNA SST纳米管设计的SST图案不会产生离散长度的结构。纳米管聚合，实现一系列多微米长度（高达11μm）。出于同样的原因，无法量化与结构形成相关的产量。

.......

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Disclosures

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提交人声明没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgements

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这项工作得到了国家科学基金会赠款1739308、NSF CAREER1944130和空军科研办公室赠款F9550-18-1-0199的部分支持。•PNA序列是特鲁科德基因修复公司的图穆尔·斯里瓦斯塔瓦博士的慷慨礼物。我们要感谢埃里克·温弗里博士和里扎尔·哈里阿迪博士就DNA设计工具箱MATLAB代码进行有益的对话。我们还要感谢约瑟夫·苏汉、马拉·沙利文和生物成像中心在收集TEM数据方面提供的援助。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PNA 链/寡聚体Trucode Gene Repair， Inc.第 2.1 节
外-可见分光光度计AgilentVarian Cary 300第 3.1.2 节
石英比色皿Starna29-Q-10第 3.1.1 节
循环仪Bio RadC1000 touch第 4.1 节
0.2 mL PCR 管VWR53509-304第 4.5 节
无水 DMFVWREM-DX1727-6节4.6
无水 DMSOVWREM-MX1457-6第 4.6 节
无水 1,4-二恶烷Fisher ScientificAC615121000第 4.6 节
10X 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）VWR75800-994第 3.1.1
节显微镜载玻片VWR89085-399第 5.2 节
盖玻片VWR48382-126部分5.2
2%火棉胶在乙酸戊酯中Sigma-Aldrich9817第5.2
乙酸异戊酯VWR200001-180第5.2节
生物素化牛血清白蛋白（生物素-BSA）Sigma-AldrichA8549第5.3节
血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA2153第5.4节
链霉亲和素Sigma-Aldrich189730第 5.5 节
TroloxSigma-Aldrich238813第 5.7 节
内反射荧光显微镜尼康Nikon Ti2-E第 5.8
节透射电子显微镜JoelJEM 1011第 6.6 节
镊子Dumont0203-N5AC-PO第 6.3 节
酸铀酰电子显微镜科学22400第 6.1 节
Formvar，300 目，铜网格Ted Pella Inc.1701-F第 6.2 节
Formvar-一氧化硅 A 型，300 目，铜网格Ted Pella Inc.1829第 6.2 节
DNA 寡聚体/链IDT第 7.1 节
烷基硫酸钠 （SDS）VWR97064-860第 8.1 节
紫热玻璃节 牛全乙十二

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  3. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G.

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