本方案详细阐述了通过聚焦超声开放血脑屏障（BBB）进行基因递送的必要步骤，以及通过组织学检测评估基因表达水平和化学遗传受体神经调控活性的方法。
本文内容
摘要
摘要
声学靶向化学遗传学（ATAC）可实现对特定神经环路的无创调控。ATAC通过聚焦超声（FUS）诱导的血脑屏障开放（FUS-BBBO）、腺相关病毒（AAV）载体介导的基因递送，以及工程化化学遗传蛋白受体与其对应配体激活细胞信号通路的联合作用，实现上述调控。利用ATAC，仅需一次无创超声处理，即可在自由活动的动物中以毫米级精度转导大脑的大范围或小范围区域。这种转导后续可通过药物实现长期、无创且无需植入装置的神经调控。由于FUS-BBBO、AAV和化学遗传学技术已在多种动物中应用，ATAC也应可扩展应用于其他动物物种。本文在先前已发表的实验方案基础上进行了拓展，详细阐述了如何在磁共振成像（MRI）引导下优化FUS-BBBO对小脑区的基因递送，且无需使用复杂的MRI兼容FUS设备。该实验方案还描述了可用于小鼠靶向与固定装置的设计，这些组件可由任何实验室通过3D打印制备，并可根据不同物种或定制设备进行简便修改。为提高实验可重复性，本方案详细说明了在ATAC开发过程中微泡、AAV及静脉穿刺的具体使用方法。最后，提供示例数据以指导采用ATAC技术的研究进行初步探索。
引言
回路特异性神经调控技术（如光遗传学1,2和化学遗传学3,4,5）的应用推动了我们对精神疾病作为神经环路障碍的理解。由于神经环路通常由特定的细胞类型、脑区、分子信号通路以及激活的时间特性共同定义，因此其研究难度较大，在治疗脑部疾病时更难以实现有效调控。理想情况下，无论是在科研还是临床应用中，这种调控都应以非侵入性方式实现，但要同时达到精确性和非侵入性神经调控仍具挑战性。例如，神经活性药物虽可非侵入性地进入大脑，但其作用遍布全脑，缺乏空间特异性；而深部脑刺激虽能调控特定脑区，却难以针对特定细胞类型，且需要手术及植入设备6。
声学靶向化学遗传学7（ATAC）可实现具有空间、细胞类型和时间特异性的神经调控。该技术结合了三种方法：利用聚焦超声诱导血脑屏障开放（FUS-BBBO）实现空间靶向；使用腺相关病毒载体（AAVs）在细胞类型特异性启动子控制下无创递送基因；以及通过给药选择性调控转染的神经环路的工程化化学遗传受体。聚焦超声（FUS）是一项经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的技术，可利用超声波在组织深部（包括人脑）实现毫米级空间精度的聚焦。在高功率下，FUS可用于非侵入性靶向消融，其中包括一项FDA批准用于治疗原发性震颤的疗法8。FUS-BBBO将低强度超声与系统性给予的微泡相结合，微泡在超声焦点处的血管内发生振荡，导致血脑屏障（BBB）出现局部、短暂（6–24小时）且可逆的开放9。这种开放使得蛋白质9,10、小分子11以及病毒载体7,12,13,14能够在不造成显著组织损伤的情况下递送至啮齿类动物10和非人灵长类动物15的脑内。目前已有针对FUS-BBBO的临床试验正在进行中16,17，表明该技术具有潜在的治疗应用前景。
使用腺相关病毒（AAV）进行病毒基因递送也正在迅速推进至中枢神经系统（CNS）疾病临床应用，近期获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧盟监管机构的批准是其重要里程碑。最后，化学遗传受体18，例如仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs），已被神经科学家广泛用于在转基因或转染动物中实现对神经元兴奋性的药理学调控19,20。DREADDs 是经过基因工程改造的G蛋白偶联受体（GPCRs），可特异性响应人工合成的化学遗传分子，而非内源性配体，因此系统性给予这些配体可增强或降低表达DREADD的神经元的兴奋性。当这三种技术整合为ATAC时，即可实现对特定神经环路的非侵入性调控，具有空间、细胞类型和时间上的精确性。
本文在先前发表的FUS-BBBO11方案基础上进行了扩展和更新，增加了利用简易3D打印定位装置在小鼠中精确靶向脑区的FUS-BBBO操作方法。此外，我们还展示了FUS-BBBO在ATAC中的应用。文中详细描述了递送携带化学遗传受体的腺相关病毒（AAV）、并通过组织学手段评估基因表达和神经调控效果所需的关键步骤。该技术特别适用于需要在大范围或多个脑区实现基因表达或神经调控的研究。例如，利用FUS-BBBO可轻松实现大脑皮层广泛区域的基因转导，并结合化学遗传学进行功能调控；而若采用颅内注射等替代技术，则需进行大量侵入性注射和开颅手术。FUS-BBBO及其应用技术ATAC可推广至不同体型的动物模型，尤其适用于脑区更大、难以通过侵入方式精准靶向的物种。
方案
所有实验均在加州理工学院机构动物护理和使用委员会批准的协议下进行，数据最初由 J.O.S. 获得。
1. 动物背带和图像引导硬件的设计与3D打印
- 使用 Szablowski 实验室网站（https://www.szablowskilab.org/downloads）提供的文件进行组件的 3D 打印。
- 确保打印材料在磁共振成像（MRI）中具有低磁化率，但配备可被 MRI 检测到的支撑结构。具体材料信息请参见材料与试剂部分。
- 考虑到材料在多次使用后可能发生降解，需反复测试材料并观察磨损部位，必要时进行加固。确保打印的壁厚至少为 2 mm。
- 使用高精度 3D 打印机以提高靶向精度。
- 通过沿组件长度方向提供支撑，并在观察到弯曲时增加 3D 打印壁的厚度，以抵消重力及其他外力导致的塑料组件偏移。
- 需考虑多轴方向上的精度，包括前/后、内侧/外侧、背侧/腹侧，以及偏航、俯仰和倾斜角度。
- 通过执行聚焦超声-血脑屏障开放（FUS-BBBO）并记录相对于目标位置的偏差，来测试靶向准确性。
- 若使用电动立体定位系统，应通过视频记录 FUS-BBBO 靶向过程，评估动态运动对材料弹性的影响，并通过增加 3D 打印材料壁厚来校正任何偏差。
2. 超声系统描述
- 使用配备八元素环形阵列换能器的超声系统（直径 = 25 mm，自然焦点 = 20 mm；孔径 (F) = 0.8），并通过将脱气超声凝胶涂抹于剃毛的小鼠头部，将换能器外壳耦合至头部。
注意：先前一项研究7中所用换能器的中心频率为 1.5 MHz，脉冲持续时间为 10 ms，脉冲重复频率在 120 s 内为 1 Hz。声压通过光纤水听器进行校准，并维持在 0.36–0.45 MPa 之间。假设在 1.5 MHz 频率下，经顶骨颅骨传播时声学衰减率为 18%21。有关安全进行血脑屏障开放和 AAV 递送的适宜条件，已在其他文献中详细描述7,14,22。
3. 动物准备
- 使用2%异氟烷与医用级空气混合气体对一只小鼠进行吸入麻醉。通过轻捏检查麻醉深度，确认无反应。然后使用一次性无菌棉签涂抹眼膏，防止角膜干燥，避免药膏管交叉污染。
注意：FUS-BBBO 的典型操作时间在30分钟至2小时之间，整个过程中必须维持麻醉状态。 - 小鼠麻醉后，用肝素化生理盐水（10 U/ml）冲洗清洁的导管。
注意：适用于25–35 g小鼠的合适导管应配备30 G针头和PE10管。 - 随后用70%乙醇棉片对小鼠尾巴进行消毒。将尾静脉导管插入尾侧静脉，并用组织胶固定。观察血液从尾静脉回流至导管内，以确认导管位置正确。
- 剃除小鼠头部毛发，待组织胶干燥后，使用 脱毛膏，以减少在超声辐照过程中超声凝胶下产生气泡的可能性。
- 将小鼠置于3D打印的MRI载具中，将其门齿固定在咬合杆上，头部置于鼻罩内（图1a）。
- 在钝性耳杆接触部位皮下注射最多10 µL利多卡因。然后将钝性耳杆固定于颅骨，并施加安全压力，注意避免压迫气管，以免影响呼吸。观察呼吸30秒，确认动物自由呼吸，频率约为每秒1次。
- 将定位导引装置连接至耳杆，参照步骤3.6检查呼吸情况（图1b），并在整个操作过程中每分钟目视监测呼吸。呼吸频率超过每秒1次是麻醉深度不足的指征之一。当小鼠未处于MRI扫描仪内或呼吸频率高于每秒1次时，应每5分钟检查一次脚趾夹捏反应。
- 将MRI载具转移至MRI支架中，再置入磁体孔内。
注意：该硬件设计针对7T MRI中使用的72 mm线圈进行了优化。 - 获取MRI序列图像，以确定小鼠在扫描仪中的位置。
- 选择三维快速低角度激发（FLASH）序列，按照仪器制造商的具体说明，完整采集全脑图像。回波时间：3.9 ms，重复时间：15 ms，激发脉冲角度：15°，矩阵大小：130 × 130 × 114，分辨率：每体素350 × 200 × 200 µm，平均次数：1，采集时间：3分42秒。
- 将MRI系统中的文件传输至控制FUS系统的计算机。
- 在软件中打开影像序列，进行MRI引导下的靶点定位，图像应如图1c所示。
4. MRI引导下的靶向定位
注意：使用定制设计的定位导板后，无需将超声换能器置于磁共振成像设备内，也无需通过切开皮肤并以颅骨冠状缝与人字缝为基准进行立体定位来完成靶点定位。请按照以下步骤执行定位操作。
- 将载具放入立体定位仪中，并使用带有双面胶的金属块将其固定，同时将载具紧贴立体定位仪的两个支撑柱以确保稳固。
- 在装有FUS引导软件的计算机上，通过数据管理器选择MRI图像文件，右键点击以调出菜单选项，然后选择“立即传输”以完成图像传输。
- 打开FUS引导软件，点击“打开序列”并加载成像序列的全部文件。
- 通过右键点击并选择“重新格式化”，将图像重新排列为三个轴向视图。
- 通过右键点击，在软件中将换能器定位至圆形靶向引导装置（图1c）。
- 在矢状面视图中，调整虚拟换能器的垂直位置，以校正水浴和换能器外壳的厚度（本例中向上调整8.2 mm，图1d）。
- 在轨迹规划器中指定需要靶向的区域，并在电子表格中记录相应坐标（本例中为中脑，如图1d所示）。
- 在电子轨迹系统中输入所需的靶向深度（z值，图2），并在电子表格中记录坐标。
- 点击“发送轨迹”和“执行”以逐个靶向各目标点（图2）。
注意：此操作在将小鼠载具置于电机内部时进行。然而，使用立体定位仪亦可实现同等精度的靶向。 - 为建立MRI坐标与立体定位框架之间的对应关系，将定制安装的换能器置于靶向引导装置上方，并进行平移，直至三个靶向螺栓（图3，部件A）均可同时穿过换能器支架（图3，部件B）和靶向引导装置（图3，部件C）。确保螺栓无张力或倾斜。
- 将换能器在前后方向上向前平移10.56 mm，直至其位置与MRI图像中靶向引导装置中心所处位置一致。
- 测定虚拟换能器中心（图3a，部件A）至目标区域（图3a，部件B）之间的距离，并利用立体定位框架将换能器移动至该坐标位置。
- 继续进行注射溶液的配制。
5. 注射溶液的制备
注意：微泡溶液对压力非常敏感。因此，剧烈混合或通过细针快速注射可能导致微泡破裂，从而降低血脑屏障开放的效果。此外，微泡的密度低于水，在试管、导管或注射器（如自动注射装置）中可能上浮至顶部（图4）。强烈建议在每次注射前立即重新混匀微泡溶液。
- 使用注射器吸取 0.8 mL 生理盐水至 1.5 mL 离心管中。
- 使用注射器将 0.1 mL MRI 对比剂加入同一 1.5 mL 离心管中，并混匀。
- 将未激活的微泡23,24 溶液恢复至室温。
- 在超声辐照前，立即使用微泡激活装置激活微泡 45 秒。
- 使用 1 mL 结核菌素注射器和 21 G 针头，缓慢（约 3 秒）从液体中层深度吸取 0.1 mL 微泡。
- 将 0.08 mL 微泡加入第 5.3 步制备的对比剂与生理盐水溶液中，用手轻弹混匀 15 秒。
- 以 AAV 载体终浓度为每克体重 0.5–2 × 1010 病毒颗粒（VP/g）为准，通过 30 G 针头将待递送的载体（本例为 AAV9）注入尾静脉导管；若为 ATAC 实验，则使用携带化学遗传学受体的 AAV，或使用相同启动子驱动 GFP 的 AAV 作为阴性对照。
- 再次用手混匀微泡溶液 15 秒，以防止微泡上浮（图 4）。
- 随后立即通过未安装针头的注射器吸取 200 µL 微泡溶液，不使用针头可减少对微泡的剪切力。
- 将注射器倒置，通过反复推动活塞进行混匀。
- 安装 30 G 针头，保持注射器倒置状态，缓慢推出微泡，直至针头末端出现液滴为止。
6. 超声辐照程序
- 设置超声辐照参数：脉冲持续时间为10 ms，重复120次，每秒一次，颅骨处压力为0.30–0.45 MPa。
- 移除定位导板，并在小鼠头部涂抹脱气的超声耦合剂，确保不产生气泡。
- 降低换能器，将其直接放置在耳杆支架的平面上，并将坐标值输入立体定位仪中（图5）。
- 注射AAV溶液（0.5–2 × 1010 VP/g）。
- 将微泡与MRI对比剂溶液混合15秒，并按每30 g小鼠注射80 µL的剂量进行注射。
- 立即按下“发送”和“执行”按钮，进行持续120秒的超声处理。
- 若需靶向多个位点，将换能器移至下一个位点，并根据步骤4.7–4.9中电子表格内的数值调整深度定位。随后对每个超声辐照位点重复步骤6.5–6.6。
7. 血脑屏障开放的MRI评估
注意：血脑屏障开放的磁共振成像评估已在其他文献中详细描述11。在接受了T1加权钆对比剂注射的小鼠中，血脑屏障开放的位置可表现为更亮的区域。
- 超声处理后，按照步骤 3.10 记录 MRI 序列。
- 将小鼠从 MRI 扫描仪中取出，并置于恢复笼中，使其从麻醉状态中恢复。每天监测小鼠是否有痛苦迹象、体重减轻或其他人道终点指标。如发生意外不良事件，应咨询兽医人员并依据机构 IACUC 指南进行相应处理。
8. 使用化学遗传配体进行DREADD刺激
- 选择一种化学遗传学受体。对于DREADDs，选择hM3Dq受体以通过Gq偶联通路实现神经元激活19，用于通过 Gi/o 耦合通路抑制神经元活动的 hM4Di 受体20，或使用Salvinorin-B配体通过Gs偶联通路激活神经元的KORD受体25.
- 将氯氮平-N-氧化物（CNO）溶解于无菌生理盐水中，配制成浓度为1 mg/mL的溶液。将分装的CNO储存于-20 °C。
- 给予CNO19，或其他化学遗传配体26,27,28, 通过腹腔注射途径，浓度为 0.3 – 10 mg/kg。
- 若需记录CNO对行为的影响，应在给药后15–45分钟内开始记录行为活动，以实现DREADDs的最大激活19.
- 若需分析神经元激活情况，应在注射后60-120分钟内取小鼠进行组织学评估。
- 通过心脏灌注实施安乐死（参见第9节）。
9. 基因表达与化学遗传学激活的组织学评估
注意：一旦达到实验终点（例如行为学研究结束、基因表达所需时间），必须确认基因表达的位置和存在情况。
- 使用化学遗传学配体激活后，进行心脏灌注以保存组织。
- 通过腹腔注射将 Ketamine（100 mg/kg）/Xylazine（10 mg/kg）混合液溶于无菌生理盐水中，对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏法确认麻醉状态，并确保呼吸频率降至约每秒1次。在确认安乐死前，持续通过加热垫提供保温支持。
- 准备4 °C的10%中性缓冲甲醛（NBF）和每毫升含10单位肝素的PBS溶液。
注：溶液应保持在4 °C。 - 将每种缓冲液分别倒入50 mL离心管中，并连接至蠕动泵，使用PBS/肝素溶液对连接25 G蝶形针头的管路进行预充。
- 用胶带将四肢固定在吸水蓝色垫上，确保动物仰卧于垫上。对毛发进行消毒，以防在需要采集外周器官时造成交叉污染。
- 通过横向切口打开腹腔，暴露膈肌。
- 沿前后轴方向用手术剪进行两次剪切，打开胸腔。
- 暴露心脏，将针头插入左心室（仰视时心脏的右侧），并连接步骤9.1.3中的蝶形针头。
- 在右心室做一小切口，以允许血液流出。
- 启动蠕动泵，开始用PBS/肝素溶液冲洗血液。
注：若此步骤操作不充分，血液将在甲醛固定过程中凝固，从而阻碍适当的灌注。 - 当所有血液被冲洗干净且右心室开始流出清澈的PBS时，将蠕动泵的进液管切换至NBF溶液，并以每只小鼠25 mL的量开始灌注。
- 取出脑组织，置于至少4 mL的NBF中，在4 °C下后固定24小时。
- 使用振动切片机对脑组织进行冠状面切片，切片厚度为50 µm。
- 将每一片切片放入24孔板的孔中，按脑区顺序保存各切片。
- 在荧光显微镜下观察融合荧光蛋白（如mCherry或mCitrine）的化学遗传学受体表达情况，识别有表达的切片以确认定位。表达信号可能较弱。
- 按照以下方案对荧光标记物进行免疫染色：
- 将3片切片置于0.5 mL含有10%次级抗体宿主血清的溶液中，孵育30分钟。
- 将切片转移至一抗溶液中，稀释比例为1:250 – 1:1,000，建议起始稀释比例为1:500。
- 在4 °C下，用石蜡膜密封微孔板，将切片与一抗共同孵育过夜。
- 用PBS洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。
- 每孔加入0.5 mL含10%血清的次级抗体溶液。
- 在室温下孵育4小时。
- 用PBS洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。
- 使用含核染料（如DAPI）的水性封片剂将切片封固于载玻片上。
- 使用共聚焦显微镜对整张切片进行拼接扫描，评估表达的定位与扩散范围。
- 通过测量目标脑区的荧光像素强度，并与颅内注射对照组比较，评估表达强度。
- 或者，通过计数针对化学遗传学受体染色的阳性细胞数量，与DAPI阳性细胞或细胞特异性标志物进行比较，评估阳性神经元百分比。
- 通过在50 µm切片上进行苏木精染色并成像，观察细胞丢失、细胞碎片积聚及其他明显组织损伤迹象，评估组织损伤情况。
- 为评估细胞靶向特异性，参照以下步骤对化学遗传学受体和细胞特异性标志物进行双重免疫染色，随后按步骤9.8进行阳性细胞计数。
- 将3片切片置于0.5 mL含10%次级抗体宿主血清的溶液中，孵育30分钟。
- 将切片转移至一抗溶液中，该溶液包含针对化学遗传学受体荧光标记物的一抗（稀释比例1:250 – 1:1,000，起始比例建议为1:500），并加入来自不同宿主物种的第二种针对目标细胞特异性标志物（如CamkIIa）的一抗。
- 在4 °C下，用石蜡膜密封微孔板，将切片与两种一抗共同孵育过夜。
- 用PBS洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。
- 每孔加入0.5 mL含10%血清的次级抗体溶液，两种次级抗体应分别对应其宿主物种。
注：每种抗体应带有不同的荧光标记，且能特异性识别步骤9.10.2中的相应一抗。 - 在室温下孵育4小时。
- 用PBS洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。
- 使用含核染料的水性封片剂将切片封固于载玻片上。
10. 使用 c-Fos 免疫染色评估神经元激活
- 使用c-Fos一抗和与核染料荧光标记不同的荧光二抗，按照本方案第9.5条进行c-Fos染色。
- 计数在化学遗传受体靶向区域中同时对c-Fos和核染料呈阳性的细胞百分比。
- 分析表达化学遗传受体并接受化学遗传配体或载体对照处理的小鼠组，以及接受化学遗传配体或载体对照处理的野生型小鼠组中c-Fos阳性细胞核的百分比。
结果
执行ATAC方案的第一步是将FUS-BBBO靶向至目标脑区。例如，按照所述方案，海马体被FUS-BBBO靶向，随后向小鼠体内注射造影剂和携带DREADDs的AAV9，并进行FLASH 3D MRI序列扫描以获取小鼠脑部图像。在海马区域（图6）及其他脑区（图7）观察到T1信号增强。数周后，DREADDs在目标脑区内成功表达。尽管许多DREADDs与荧光报告蛋白（如mCherry）融合表达，但灌注和甲醛固定过程被发现会显著降低这些蛋白的荧光强度。根据以往经验，针对mCherry或DREADD进行免疫染色可更可靠地检测其表达情况（图8）。在先前的实验中，约85%的小鼠在FUS-BBBO处理后显示出DREADD表达7。一种判断DREADD表达水平是否足够的简单方法是在细胞水平上检测其功能活性。例如，可通过给予化学遗传配体或生理盐水对照（如CNO19、去氯氯氮平28或其他配体29），给药2小时后进行心脏灌注和组织固定。随后对脑切片进行c-Fos蛋白30（神经元活动增强的标志）与DREADD的共免疫染色。若接受化学遗传配体的小鼠组中，靶向脑区c-Fos阳性神经元核的数量显著高于接受生理盐水的对照组7，或高于未经FUS-BBBO处理的对侧脑区，则认为实验成功。需要注意的是，部分此类配体可能在无DREADD表达的情况下非特异性激活神经元。例如，CNO在小鼠体内可代谢为低水平的氯氮平，后者能够穿过血脑屏障并高效激活DREADDs27；但同时也有研究表明其可结合非特异性位点。因此，如同所有实验一样，在化学遗传学研究中必须设置完整的对照组31。一种可能的对照是向未进行任何处理的野生型小鼠给予化学遗传配体，以排除药物本身对目标行为学或组织学检测的影响。另一种对照策略是设置四组实验：DREADD + 配体、DREADD + 载体、EGFP + 配体、EGFP + 载体，从而分别评估FUS-BBBO介导的基因递送和化学遗传配体可能产生的影响。
图1：ATAC中MRI引导FUS靶向的过程。（a）小鼠固定装置，包括耳杆、鼻部固定器以及可置于MRI扫描仪内部的平台。（b）一个在MRI中可见的3D打印导向装置（蓝色），其连接在耳杆框架的末端，并通过表面MRI线圈的支架固定，该支架包含四个卡扣式螺栓（半透明蓝色）。（c）3D打印导向装置在矢状面MRI中的表现（左图），其中虚拟换能器的底部（黄色半圆）与导向装置底部对齐；右图显示该导向装置在冠状面MRI中的表现。明亮的圆环由Polyjet支撑材料制成，具有较强的MRI对比度；十字形结构由塑料构成。黄色圆圈代表换能器的位置，在立体定位框架内与导向装置同心对齐。（d）为靶向脑部结构，虚拟换能器在小鼠上方沿z轴方向移动，以匹配超声波锥形外壳的厚度。本例中，由于水浴的厚度，换能器需在导向装置上方移动8.2 mm，以实现精确靶向。脑部结构通过MRI成像数据选定，其MRI坐标被记录并输入立体定位装置中。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：所用软件的界面。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：将 MRI 坐标空间与立体定位仪器匹配的过程。（a）换能器支架上的三个孔与 MRI 导引装置上的三个孔对齐，并插入三根锥形定位螺栓，且不导致整个组件发生弯曲。（b）理想情况下，三根螺栓应均位于各孔的中心。（c）若对准存在任何不精确，例如出现 1° 的微小且可能难以察觉的偏航角时，并非所有三根螺栓都能顺利插入——此时仅有一根螺栓可插入，而相对的螺栓会被卡在 MRI 导引装置上。或者，若强行插入螺栓，可能导致整个组件出现可见的弯曲。（d）螺栓装配的放大视图。为获得最佳精度，螺栓应同心放置。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：注射器内微泡的快速再分布。 （a）混合后5秒拍摄的注射器照片。（b）一分钟后，可明显看到一层气泡聚集在1 mL结核菌素注射器顶部。此示例特别使用了微泡溶液。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：将换能器中心置于MRI引导装置中心的过程。（a）在本文所示模型中，红色载体已从图3b所示位置向前移动10.56 mm，到达此处所示位置。（b）在进行超声照射前，移除蓝色MRI引导装置，并在小鼠与换能器（橙色）之间涂抹超声耦合凝胶，以确保超声波的顺利传导。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：血脑屏障开放的MRI可视化。（a）血脑屏障开放的轴向视图。箭头所示较亮区域显示MRI T1对比剂的外渗。（b）使用FUS-BBBO靶向的背侧海马体及海马体上方皮层的冠状面视图（箭头）。（c）使用FUS-BBBO靶向的中央海马体的冠状面视图（箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：使用本文所述三螺栓靶向系统对4个脑区进行靶向的示例。带箭头的区域显示了血脑屏障开放位点，并可见MRI对比剂的扩散。这四个位点自下而上依次靶向，每次血脑屏障开放间隔约150秒。该图像拍摄于最后一次血脑屏障开放后2分钟内。比例尺为2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：DREADD表达的检测。 （a）针对DREADD所连接荧光团的免疫染色，在本例中，mCherry在某些研究中是一种可靠的检测方法。（b）在另一代表性脑切片中，使用与（a）相同的条件将DREADD靶向至海马体，但仅靠mCherry自身的荧光产生了较强的背景信号和相对较弱的特异性信号。（c）作为阴性对照，使用了一只接受了系统性AAV注射但未接受FUS-BBBO处理的小鼠。通过mCherry免疫染色未检测到显著表达。比例尺为500 mm。（数据a、c改编自7，经许可，版权所有 2020 Nature-Springer）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
ATAC 需要成功实施多种技术，以实现对特定神经环路的有效神经调节，包括精确的磁共振成像引导靶向、聚焦超声开放血脑屏障（FUS-BBBO）以及基因表达的组织学评估。为简化通过影像引导的聚焦超声开放血脑屏障技术对小脑结构的靶向定位，已开发出可3D打印的组件。
磁共振引导聚焦超声（MRIgFUS）的应用面临多项挑战。首先，典型的磁共振线圈空间有限，其设计仅能容纳被检样本，无法同时容纳超声硬件。增大磁共振设备的孔径会提高设备成本并降低图像质量，因为信号强度与线圈的填充因子相关32。因此，若将任何FUS硬件置于动物样本上方进行MRI成像，将损害成像质量。其次，设计与MRI兼容的设备困难且成本高昂。MRI兼容材料必须具有抗磁性，在射频辐射过程中不易产生涡流，并在高磁场环境中具有低磁化率。任何导电材料若产生涡流或具有磁化率，均会负面影响成像质量。最后，现有的MRI兼容材料在杨氏模量和耐久性方面均低于常用于制造精确定位装置（如立体定位架）的金属材料。用于位置调节的电机必须具备MRI兼容性，并因体积原因需置于MRI孔径之外，还需通过MRI兼容材料将电机与孔径内的换能器进行远距离连接。塑料变形、孔径内空间不足导致无法安装足够坚固的组件，以及在整个脑部范围内调整靶向位置的空间受限等问题，已在先前研究中影响了靶向精度。
为了解决这些问题，决定在磁共振成像（MRI）扫描仪外部进行成像以及聚焦超声（FUS）介导的血脑屏障开放（BBBO）给药。为了实现MRI引导，将小鼠置于一个3D打印的固定装置内，该装置配备有在MRI中可见的定位导引结构，可用于在MRI图像中以及立体定位坐标系中确定小鼠脑部结构的位置。由于小鼠颅骨和定位导引结构均牢固地固定在耳杆支架上（图1a,b），因此可利用该定位导引结构关联MRI图像中的空间坐标，并对立体定位仪器进行归零校准。该固定装置无活动部件，也不包含换能器，这使得装置既坚固又足够小巧，可放入MRI设备中，同时避免了换能器电子元件带来的信号干扰。定位导引结构内部设计为空心，因为某些材料的3D打印支撑结构在MRI中可见（图1c）。组件上的孔洞设计用于实现立体定位校准（图3）。超声换能器被固定在立体定位仪的电极夹持器上，并按照第4节所述进行定位（图1d）。换能器应沿其长度方向由耳杆外壳提供支撑，以防止其偏离水平面。在背腹方向上的定位可通过环形阵列中的相位偏移实现。
实际的靶向精度由超声聚焦和颅骨衰减决定。FUS-BBBO 操作已在大鼠中进行了详细描述11，并在多种其他模式生物23,33,34以及人类中得以实施16,17。超声焦点尺寸与频率成反比关系，即更高频率可实现更精确的递送。然而，颅骨的衰减随频率升高而增加35，可能导致颅骨发热并对皮层区域造成损伤。具体的靶向策略将取决于脑部靶点位置。当半高全宽（full-width half maximum）压力范围完全位于脑组织内时，可在许多脑结构（如纹状体、中脑和海马体）中实现可预测且安全的血脑屏障开放。在小鼠中，靠近颅底的区域构成特殊挑战。小鼠脑在背腹方向上约为 8–10 mm，与许多商用换能器的半高全宽尺寸相当。因此，在颅底进行靶向时，超声可能从骨骼以及耳道、口腔或气管中的空气发生反射，从而导致高低压力分布的不可预测模式36。其中部分压力可能超过惯性空化阈值，已被证实可引起出血和组织损伤37。对于位于颅底附近的靶区，可能更宜采用交叉型 ATAC7策略，即利用交叉遗传学方法38将基因表达限制在比 FUS 声束靶区更小的区域内。在已发表的交叉型 ATAC 示例中，针对表达基因编辑酶（Cre38）的多巴胺能细胞的转基因动物，仅对含有该类细胞的脑区亚区施加超声照射。最后，皮层区域也可作为 FUS 靶点，但超声可能发生衍射和反射，导致压力分布不均。本方案未涵盖皮层区域的靶向，因其高度依赖所使用的物种；然而，已有研究观察到海马体上方皮层的靶向效果7（例如，图 7），表明至少在小鼠中是可行的。
化学遗传激活剂的选择及其给药剂量取决于具体的实验需求。多项研究（包括其中一位作者的研究7）表明，在较低剂量下无明显非特异性反应39,40，而较高剂量（例如 10 mg/kg）至少在某些情况下可能产生副作用41。然而，与所有行为学实验一样，由于CNO及其代谢产物可能存在脱靶效应42，设置适当的对照至关重要31。此类对照可包括：对表达DREADDs的动物给予CNO和生理盐水对照处理，以及对野生型动物给予CNO处理；在某些特定情况下，还可比较脑内同侧与对侧位点，分别对应表达与不表达化学遗传受体的区域。此外，近期研究已发现多种新型DREADD激动剂，其特异性有所提高28,29,43。其他化学遗传受体5,25,44也可与ATAC实验流程联合使用。
每只动物在死后都需要进行基因表达的组织学评估。部分动物在接受FUS-BBBO7处理后，基因表达水平较低。此外，有必要验证基因表达的空间精确性和特异性，因为可能存在靶向错误的情况。值得注意的是，某些AAV可能具有逆向或顺向示踪能力45，即使超声靶向准确，也可能导致远离超声靶区的区域发生转染。如果表达的化学遗传受体与荧光蛋白融合表达或共表达，则对组织切片中的荧光蛋白成像可能足以评估其表达定位和强度。然而，许多荧光蛋白在组织固定过程中易被破坏，既往研究显示，针对DREADDs常联合使用的mCherry蛋白进行免疫染色可获得更优的信号7。最后，由于脑内某些区域神经元密度较高（例如海马颗粒细胞层），使用IRES介导的核定位荧光蛋白表达（而非融合蛋白）进行细胞计数可能更为有利，因为细胞核易于通过DAPI或TO-PRO-3等核染料进行区分和复染。在通过c-Fos染色评估神经调控效应时，必须进行核复染并计数c-Fos阳性细胞核，而非仅依据荧光信号强度；在某些情况下，细胞碎片也可能产生荧光，从而干扰阳性细胞的准确判定。
FUS-BBBO在药物和基因递送方面的局限性包括：与侵入性颅内注射相比分辨率较低，且需要注射更大剂量的药物或病毒载体。此外，直接脑内注射可将递送局限于注射部位，而FUS-BBBO采用静脉注射途径，可能导致药物或载体递送至外周组织。化学遗传学用于神经调控的局限性包括作用时间尺度较慢，可能无法满足某些需要快速改变神经调控强度的行为学实验方案。
致谢
本研究由脑与行为基金会（Brain and Behavior Foundation）的NARSAD青年研究者奖资助。多个3D打印部件最初由法比安·拉比索（Fabien Rabusseau）（法国图像引导治疗公司）设计。作者感谢约翰·希思（John Heath）（加州理工学院）和玛格丽特·斯威夫特（Margaret Swift）（加州理工学院）在准备手稿过程中提供的技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 21 号针头（BD） | Fisher Scientific | 14826C | |
| 25 号蝶形针头 | 哈佛生物科学 | 725966 | |
| 30 号针头（BD） | Fisher Scientific | 14826F | |
| 吸水蓝垫 | Office Depot | 902406 | |
| 抗c-Fos抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-253-G | |
| 抗mCherry抗体 | 赛默飞世尔科技 | PA534974 | |
| Bruker Biospec 70/30 | Bruker | 定制 | 包括射频线圈 |
| 氯氮平-n-氧化物 | Tocris | 4936 | |
| 定制设计的3D打印小鼠背带及磁共振引导聚焦超声靶向组件 | 图像引导治疗，Szablowski 实验室 | 定制 | 从 szablowskilab.org/downloads 下载 |
| 定制 MRI 引导聚焦超声设备 | 影像引导治疗 | N/A | |
| Definity 微泡 | Lantheus | DE4 | |
| 脱气的Aquasonic/超声耦合剂 | Fisher Scientific | 5067714 | |
| 脱毛钳è我 | Nair | n/a | |
| 八元件环形阵列换能器 | Imasonic 公司 | 定制 | |
| 70% 乙醇棉片（BD） | Office Depot | 599893 | |
| 肝素 | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | |
| 异氟烷 | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| 氯胺酮 | Patterson Veterinary | 07-890-8598 | |
| 中性缓冲甲醛（10%） | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 光纤水听器 | 精密声学 | ||
| PE10导管 | Fisher Scientific | NC1513314 | |
| 蠕动泵 | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | 524650-1EA | |
| Prohance 对比剂 | Bracco | 0270-1111-04 | |
| 生理盐水 | Fisher Scientific | NC9054335 | |
| 二抗，驴抗山羊 | 赛默飞世尔科技 | A-11055 | |
| 二抗，驴抗兔 | ThermoFisher | 84546 | |
| 手术剪（直型） | Fisher Scientific | 17467480 | |
| ThermoGuide 软件 | 影像引导治疗 | ||
| 组织胶（Gluture） | Fisher Scientific | NC9855218 | |
| 结核菌素注射器（1 mL）（BD） | Fisher Scientific | 14823434 | |
| VeroClear 可3D打印材料 | Stratasys | RGD810 | |
| Vialmix 微泡激活装置 | Lantheus | VMIX | |
| 振动切片机 | Compresstome | VF-300 | |
| 赛拉嗪 | Sigma-Aldrich | X1251-1G |
参考文献
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