肺环境中免疫细胞和促炎介质的表征

摘要

该协议描述了使用流式细胞术来鉴定短暂性脑中动脉闭塞后肺部环境中免疫细胞组成，细胞因子谱和趋化因子谱的变化，这是缺血性中风的小鼠模型。

摘要

免疫细胞的扩增、激活和向肺部的运输由多种细胞因子和趋化因子的表达控制，可能因严重的脑损伤而改变。肺炎是缺血性卒中患者死亡的主要原因这一事实证明了这一点。该协议的目的是描述使用多色流式细胞术分析来鉴定小鼠肺部的13种类型的免疫细胞，包括肺泡巨噬细胞，间质巨噬细胞，CD103 +或CD11b +树突状细胞（DC），浆细胞样DC，嗜酸性粒细胞，单核细胞/单核细胞衍生细胞，嗜中性粒细胞，淋巴样来源的T和B细胞，NK细胞和NKT细胞，通过短暂的脑中动脉阻塞诱导缺血性中风。此外，我们使用磁珠匀浆方法描述了肺匀浆的制备，通过多重磁珠阵列结合流式细胞术分析同时确定13种不同细胞因子或趋化因子的表达水平。该方案也可用于研究其他疾病环境中的肺免疫反应，例如传染性肺病或过敏性疾病。

引言

肺是一个屏障器官，暴露于外部环境，因此不断接受免疫学挑战，如病原体和过敏原¹。肺常驻免疫细胞的活化和免疫细胞从外围浸润是清除肺部环境中病原体所必需的。此外，肺常驻免疫细胞保持对共生细菌的耐受性，这表明这些细胞在病原体清除和维持体内平衡¹中起作用。肺泡和间质巨噬细胞是肺常驻前哨免疫细胞之一，它们通过模式识别受体感知病原体，并通过吞噬作用²清除这些病原体。肺常驻树突状细胞通过抗原呈递弥合先天性和适应性免疫反应³.此外，激活的局部先天免疫细胞产生细胞因子和趋化因子，这些细胞因子和趋化因子可放大炎症反应并刺激单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞等免疫细胞浸润到肺部¹。缺血性卒中已被证明会改变全身免疫力，并导致肺部感染易感性增加。然而，很少有研究评估缺血性卒中后的肺间室，尽管一些研究在炎症条件下检查了它^4，5，^{6，7，8，9}。本文描述的方法的目标是同时确定肺病理学、免疫细胞组成以及肺部细胞因子和趋化因子表达水平，以评估肺间室的改变，并评估缺血发作后肺部免疫反应的潜在改变。

这里描述的是用于从小鼠肺部获得单细胞悬浮液以鉴定13种类型的免疫细胞的方案。该方案基于胶原酶D的组织消化，而无需自动组织解离器。此外，我们开发了一种制备组织匀浆的方案，可用于使用基于流式细胞术的多重磁珠阵列确定13种不同细胞因子或趋化因子的表达水平。该方案已成功用于研究缺血性卒中对肺免疫的影响，也可用于其他疾病模型。

方案

所有执行的协议和程序都得到了西弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。小鼠被安置在西弗吉尼亚大学动物馆的无病原体条件下。

1. 溶液的制备

1. 制备灌注缓冲液（磷酸盐缓冲盐水，PBS）。每只小鼠使用大约两个 10 mL 等分试样的冰冷 PBS。
2. 准备肺细胞培养基/流式细胞系统缓冲液。FACS缓冲液含有补充1%胎牛血清（FBS）的PBS。在肺切除和转移的整个过程中保持培养基的低温。每个肺样本准备约 8 mL。在实验前准备新鲜的培养基/ FACS缓冲液。
3. 制备用于单细胞分离的解离缓冲液。缓冲液在汉克缓冲盐溶液（HBSS）中含有1毫克/毫升胶原酶D和200微克/毫升DNase I。在实验前从储备溶液（100mg / mL胶原酶D和10mg / mL DNase I）中新鲜制备。每个肺样本大约需要 6 mL。使用前确保缓冲液达到室温。
4. 制备用于肺组织均质化的均质化缓冲液。缓冲液含有PBS和1x蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（储备= 100x）。在实验前新鲜准备。在整个均质化过程中保持缓冲液的低温。大约200μL缓冲液足以使肺的单个右叶匀浆化。

2. 短暂性脑中动脉阻塞

注意:tMCAO通过单丝插入大脑中动脉的程序在之前有详细的记录¹⁰。在这些实验中，使用了8至12周龄的雄性C57BL / 6J小鼠，重25-30g。

1. 简而言之，在手术前皮下给予小鼠2mg / kg美洛昔康。 使用5%异氟醚在诱导室中深度麻醉小鼠。使用脚趾捏方法确认深度麻醉。在使用鼻锥的手术过程中用1-2%异氟醚维持麻醉。在整个过程中，通过在小鼠下方放置温暖的毯子，将体温保持在36.5 - 38°C。所有手术工具应在手术前一天进行高压灭菌。
2. 使用70%乙醇剃须并准备腹侧颈部的皮肤，然后进行氯己定磨砂。在进行第一个切口之前，皮下注射2mg / kg布比卡因在切口区域。使用眼药膏遮住眼睛，防止眼睛干燥。做一个中线颈部切口。轻轻拉开气管周围的软组织。
3. 识别左颈总动脉和颈外动脉。
4. 将临时缝合线（6/0号）应用于颈总动脉以阻止血液流动。在颈外动脉做一个切口。
5. 将硅橡胶涂层的单丝（大小为6-0）插入颈外动脉，然后将单丝推进到大脑中动脉。将单丝留在大脑中动脉中60分钟（闭塞）。
6. 使用激光多普勒流量计监测血流速率。流向大脑中动脉的流速降低> 80% 表明闭塞成功。
7. 闭塞60分钟后，取出单丝以允许再灌注发生。关闭切口。
8. 在假手术小鼠中，在不插入单丝的情况下执行步骤2.1-2.6。在这些小鼠中，血液流动速率应在整个过程中保持稳定。
9. 每天监测小鼠并使用标准评分标准¹¹测量神经缺陷。0 – 无神经功能障碍;1 – 当被尾巴抬起时缩回对侧前爪;2-当被尾巴抬起时，向对侧旋转;3-走路时跌落到对侧;4 – 不自发行走或昏迷;5 – 死亡。
10. 术后每24小时皮下注射生理盐水和镇痛药（美洛昔康，2mg / kg），持续3天。
11. 在tmCAO后24和72小时分离肺部以进行下游分析。

3. 收获肺组织

1. 通过腹膜内（ip）注射100mg / kg氯胺酮和10mg / kg木乃静嗪来深度麻醉小鼠。使用脚趾捏方法确认深度麻醉。
2. 为了进行全身心经灌注¹²，将小鼠固定在手术平台上并用70%乙醇润湿毛皮以减少皮毛进入体腔的分布。使用精细的夹层剪刀在尾腹部做一个横向切口，然后在腹膜的中线切口，在穿刺膈肌之前停止在胸腔处。
   1. 不要穿过肌肉/隐藏进入腹膜腔，也不要继续切口经过腹部。
3. 一旦到达胸腔，在刺穿隔膜之前立即停止切口。注意不要损害心脏和肺部，这可能会损害灌注质量或细胞恢复
4. 使用精细的夹层剪刀使腹膜的中线切口在刺穿隔膜之前停止在胸腔处。
5. 使用镊子抓住胸骨远端的鼠标，向上抬起，同时穿过横膈膜，确保不会损害心脏，肺或脉管系统。一旦器官可见，就通过肋骨笼做一个切口，分离并固定在肋骨壳上，使心脏和肺部完全暴露。
6. 小心地在主动脉弓附近的右心房做一个小切口。这将作为灌注的流出。
7. 紧接着，将连接到装有10 mL冷PBS的注射器上的25 G x 5/8针轻轻插入左心室远端上表面。注意不要通过心室间隔插入右心室。针头不应插入左心室。
   注意:如果心室隔被刺穿，液体将从小鼠的鼻子中涌出。这将降低灌注质量并导致细胞损失。
8. 如果需要，可以使用夹具在灌注过程中将针头牢固地固定在左心室中。
9. 稳定但轻轻地将 10 mL 冷 PBS 推入心脏。当液体从右心房排出时，小鼠组织应开始灌注并清除血液。
   1. 推入第二等分试样的 10 mL PBS，直到发生足够的血液清除。肝脏将具有浅棕色的外观，肺部将从红粉红色过渡到大部分白色。
10. 使用镊子和细切剪刀，小心地去除所有周围组织，包括心脏，气管，食道，胸腺，结缔组织，淋巴结节和大支气管。
11. 分离单个肺叶，并将肺叶放入含有1-2 mL等分试样的冷肺细胞培养基的冰上的培养皿中。

4. 使用磁珠均质机对多重磁珠阵列的肺组织进行均质化

1. 预冷装有 3 个无菌 2.3 mm 氧化锆/二氧化硅珠的 2 mL 锥形螺旋盖管。向管中加入200μL冷均质缓冲液。
2. 称量转子，将转子转移到含有磁珠和均质缓冲液的预冷锥形管中。
   注意:在200μL缓冲液中匀浆的约50-100mg组织将足以检测样品中的细胞因子和趋化因子表达。
   1. 使用基于磁珠的均质机（参见 材料表）在4，000rpm下均质转子2分钟。
   2. 确保组织完全均质化。如果需要，请增加时间。
3. 均质化后，将管在预冷（4°C）微量离心机中以15，870 ×g 离心3分钟。
4. 将上清液转移到预冷的1.5mL微量管中。
5. 将样品直接放在冰上立即使用，或将样品储存在-80°C以备将来使用。避免多次冻融循环。

5. 肺组织解离和单细胞分离

1. 将肺细胞培养基倒掉剩余的肺叶，以避免解离缓冲液的稀释。然后，小心地将含有1mL解离缓冲液的25G和5/8针头的1 mL注射器插入肺组织中。
2. 将解离缓冲液的小份（约1/4^至 1^/5）注入每个肺叶并轻轻充气。
   注意:大部分缓冲液在充气后不久就会冲出，因为肺叶已被切除。
3. 重复注入解离缓冲液1-2x。
4. 在室温下用解离缓冲液孵育肺叶2分钟。
5. 用细的解剖剪刀将肺叶切成小块。
6. 将切碎的肺片与解离缓冲液转移到15mL离心管中。 补充额外的解离缓冲液，共6 mL。剧烈涡旋1分钟。
7. 将样品在37°C下孵育45分钟。 每7-8分钟剧烈涡旋一次。
8. 孵育45分钟后，剧烈涡旋样品1分钟以获得最佳结果。
9. 通过100μm细胞过滤器进一步解离样品，以除去残留的，不需要的结缔组织和间质组织。
10. 将样品以380 ×g离心10分钟，弃去上清液。
11. 向样品中加入5 mL冷肺细胞培养基。通过温和的涡旋重悬细胞沉淀。
12. 将样品以380 ×g离心10分钟，弃去上清液。
13. 加入1 mL冷肺细胞培养基。通过温和的涡旋重悬细胞沉淀。
14. 通过100μm细胞过滤器，并计数细胞。

6. 肺免疫细胞生态位的流式细胞术分析

1. 将1-2×10⁶ 个细胞/抗体集放入96孔圆底板（共3组）中。以830 ×g离心细胞3分钟。弃去上清液。
2. 将细胞沉淀重悬于50μL含有可固定活/死污渍的冷PBS中。根据制造商的说明准备污渍。
3. 将细胞在4°C下孵育20分钟，避光。以830 ×g离心细胞3分钟。弃去上清液。
4. 用含有5μg/ mL抗小鼠CD16 / 32抗体的25μL冷FACS缓冲液重悬细胞沉淀。在4°C下孵育10-15分钟。
5. 向细胞中加入25μL含有 表1 中列出的抗体组合的冷FACS缓冲液。通过轻柔移液混合。
   注意:用于抗体染色的FACS缓冲液的总体积为50μL。因此，在制备25μL抗体预混液时，抗体的浓度应为最终浓度的两倍。
6. 将细胞在4°C下孵育20分钟，避光。以830 ×g离心细胞3分钟。弃去上清液。
7. 用100μL冷FACS缓冲液重悬细胞。以830 ×g离心细胞3分钟。弃去上清液。
8. 用100μL冷FACS缓冲液重悬细胞。转移到含有150μL额外FAC缓冲液的聚苯乙烯圆底5 mL FACS管中。立即使用流式细胞仪分析样品。
   注意:使用以下步骤进行细胞固定可以在以后分析样品。
9. 在步骤6.7.之后，用100μL1%多聚甲醛重悬样品在PBS中。
10. 将样品在4°C下孵育15分钟，避光。以830 ×g离心细胞3分钟。弃去上清液。
11. 用100μL冷FACS缓冲液重悬细胞。以830 ×g离心细胞3分钟。弃去上清液。
12. 用100μL冷FACS缓冲液重悬细胞。将细胞储存在4°C，避光。在72小时内分析样品。

7. 用于细胞因子和趋化因子检测的多重磁珠阵列

注意:根据制造商方案，使用市售的促炎趋化因子和炎症多重组合（见 材料表）来确定tmCAO诱导后肺部趋化因子和细胞因子的表达，该方案已详细描述¹³。

1. 简而言之，如果在组织均质化后将分析物储存在-80°C，则在冰上解冻分析物。使用前在4°C下以590 ×g 离心样品2分钟以除去任何残留组织。
2. 通过将已知浓度为10 ng/ mL的标准鸡尾酒（C7）连续稀释到7个标准品（C1-6）中，最后一个标准品单独是测定缓冲液（C0），从而生成标准曲线。
3. 一旦所有试剂都升温到室温，将25μL每个标准品和25μL测定缓冲液加入V底96孔板中。
4. 向每个样品孔中，向V底96孔板中加入25 μL肺匀浆物（分析物）和25 μL测定缓冲液
5. 用力涡旋预包被的微球，然后将25μL预包衣珠加入每个标准品和样品孔中。
6. 密封板，并用铝箔覆盖物避光。在室温下以110rpm摇动板2小时。
7. 以230 ×g 离心5分钟。在1x下加入200μL洗涤缓冲液（储备溶液为20x，用水稀释至1x）。孵育1分钟。
8. 以230 ×g 离心5分钟。用25μL检测抗体重悬标准品和样品。
9. 密封并盖住板，以防光线。在室温下以110rpm摇动板1小时。
10. 向每个标准品中加入25μL链霉亲和素 - 藻红素（SA-PE）并充分采样。
11. 密封并盖住板，以防光线。在室温下以110rpm摇动30分钟。
12. 将板以230 x g 旋转5分钟。将标准品和样品重悬于1x洗涤缓冲液中。
13. 转移到标记良好的聚苯乙烯圆底5 mL FACS管中，该管含有额外的150μL 1x洗涤缓冲液。
14. 使用流式细胞仪测定标准品和样品的PE信号荧光强度。
15. 使用PE的平均荧光强度（MFI）与预定浓度的对比，为每个趋化因子和细胞因子构建标准曲线。
16. 使用标准曲线和每个样品的MFI确定每种趋化因子和细胞因子的浓度。多重检测面板提供数据分析软件，可用于确定每种分析物的浓度。顶叶/上叶的重量用于确定每毫克组织中细胞因子或趋化因子的浓度。

结果

我们最近报道，小鼠缺血性中风诱导改变了肺¹¹的免疫细胞组成。具体而言，短暂性脑缺血增加了肺泡巨噬细胞、嗜中性粒细胞和 CD11b+ DC 的百分比，同时减少了肺区室中 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、B 细胞、NK 细胞和嗜酸性粒细胞的百分比。此外，细胞改变对应于肺部多种趋化因子水平的显着降低。这里描述的是一种分离和鉴定肺间室中不同免疫细胞群的方法。这里显示的代表性结果来自经过TMCAO诱导和假手术的小鼠。

我们使用3组抗体组合鉴定出肺部13个不同的免疫细胞群（L1-L13），每组含有5-7个抗体（图1）。在每组中使用活/死染色剂排除死细胞。用于区分不同免疫细胞类型的抗体和标志物列于 表1中。在第1组中鉴定出肺泡和间质巨噬细胞，CD103 + DC，CD11b + DC和嗜酸性粒细胞（图1A，B）。在第2组中鉴定出促炎单核细胞和嗜中性粒细胞（...

讨论

这里描述的方案允许在同一只小鼠中鉴定肺免疫细胞类型和趋化因子或细胞因子的表达。如果需要组织病理学研究，可以在进行单细胞分离步骤之前移除并固定单个叶。这种方法的一个局限性是，如果免疫细胞组成的变化以及趋化因子和/或细胞因子的表达预计在肺的不同叶之间分布不均，则这种方法可能不适用于某些疾病环境。例如，一些细菌，如 结核分枝杆菌， 显示出感染肺的某些叶^的倾向21。在这种情况下，可能需要在波瓣之间进行比较。

从肺部分离单细胞方案的浓度，孵育时间和温度严重影响免疫细胞从肺部的恢复。胶原酶 D 的质量对于获得最佳结果至关重要，如果使用胶原酶 D 的不同来源，则应进行测试。组织的过度消化导致细胞死亡的增加;然而，组织的消化不足导致免疫细胞的产量低，尤其是巨噬细胞和DC。

我们使用3种抗体组合来确定肺部的13个免疫细胞群，每组含有5-7个抗体和一个LIVE/DEAD染色。如果从样品中获得的细胞数量有限，则可以组合每组中的抗体。 然而，当抗体数量增加时出现的一个主要问题是，流式细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B220-APC，克隆 RA3-6B2	Biolegend	103212	1：200 稀释度
Beadbug 3 位微珠匀浆器	Benchmark Scientific	D1030	组织匀浆器
CCR2-BV421，克隆 SA203G11	Biolegend	150605	1：200 稀释度
CD103-BV421，克隆 2E7	Biolegend	121422	1：200 稀释度
CD11b-PE/Cy7，克隆 M1/70	Biolegend	101216	1：400 稀释
CD11c-PE/Cy7，克隆 N418	Biolegend	117318	1：200 稀释
CD11c-Percp/Cy5.5，克隆 N418	Biolegend	117328	1：200 稀释
CD4-BV421，克隆 GK1.5	Biolegend	100443	1：200 稀释
CD45-FITC，克隆 30-F11	Biolegend	103108	1：200 稀释
CD64-APC，克隆 X54-5/7.1	Biolegend	139306	1：200 稀释
CD8-PE，克隆 53-6.7	Biolegend	100708	1：800 稀释
胶原酶 D	Sigma Aldrich	11088882001	解离缓冲液中的组分
锥形螺帽管	ThermoFisher	02-681-344	组织匀浆管
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001	解离缓冲液中的组分
Fc 块 CD16/32 抗体	Biolegend	101320	1：100 稀释
genlteMACS 解离剂	Miltenyi Biotec	130-093-235	有或没有机械解离剂的肺消化比较 gentleMACS
C 管	Miltenyi Biotec	130-093-237	带 genlteMACS 解离剂的组织剥离管
匀浆缓冲液中的	和磷酸酶抑制剂 ThermoFisher		78442
激光多普勒监测	Moor	MOORVMS-LDF	tMCAO 期间的血流监测
LEGENDplex 促炎趋化因子面板	Biolegend	740451	多重珠阵列
LIVE/DEAD 可固定近红外染色	ThermoFisher	L34976	用于流式细胞术分析过程中的死细胞排除
Ly6C-PE，克隆 HK1.4	Biolegend	128008	1：800 稀释
Ly6G-BV510，克隆 1A8	Biolegend	127633	1：200 稀释
MCAO 缝合线 L56 可重复使用的 6-0 培养基	Doccol	602356PK10Re	tMCAO
MHC II-BV510，克隆 M5/114.15.2	Biolegend	107636	1：800 稀释
NK1.1-Percp/Cy5.5，克隆 PK136	Biolegend	108728	1：200 稀释度
Siglec F-PE，克隆 E50-2440	BD Biosciences	552126	1：200 稀释
丝缝线，尺寸 6/0	精细科学工具	18020-60	tMCAO
SomnoSuite 麻醉系统	Kent Scientific	SS-01	tMCAO
小鼠麻醉 TCRb-BV510，克隆 H57-897	Biolegend	109234	1：200 稀释
氧化锆/二氧化硅微珠，2.3 mm	组织匀浆	Biospec	11079125z