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方法文章

肺部环境中免疫细胞及促炎介质的表征

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DOI：

10.3791/61359

⸱

2020年6月24日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了流式细胞术的应用，用于鉴定短暂性大脑中动脉闭塞（一种缺血性脑卒中的小鼠模型）后肺部环境中免疫细胞组成、细胞因子谱和趋化因子谱的变化。

摘要

严重的脑损伤可能会改变由多种细胞因子和趋化因子表达所调控的免疫细胞扩增、活化及其向肺部的迁移。这一观点的证据在于，肺炎是缺血性脑卒中患者死亡的主要原因之一。本方案旨在描述如何利用多色流式细胞术分析，在通过短暂性大脑中动脉闭塞诱导缺血性脑卒中后的小鼠肺组织中鉴定13种免疫细胞类型，包括肺泡巨噬细胞、间质巨噬细胞、CD103+ 或 CD11b+ 树突状细胞（DCs）、浆细胞样DCs、嗜酸性粒细胞、单核细胞/单核细胞来源细胞、中性粒细胞、淋巴系来源 T细胞和B细胞、NK细胞以及NKT细胞。此外，我们还描述了采用珠磨法制备肺组织匀浆的方法，以通过与流式细胞术联用的多重微球阵列技术，同时测定13种不同细胞因子或趋化因子的表达水平。该方案也可用于研究其他疾病状态下的肺部免疫反应，例如感染性肺部疾病或过敏性疾病。

引言

肺是一种屏障器官，暴露于外部环境，因此会持续受到病原体和过敏原等免疫学挑战1。清除肺部环境中的病原体需要肺驻留免疫细胞的活化以及外周免疫细胞的浸润。此外，肺驻留免疫细胞可维持对共生细菌的免疫耐受，表明这些细胞在病原体清除和维持稳态中发挥重要作用1。肺泡巨噬细胞和间质巨噬细胞是肺驻留的哨兵免疫细胞之一，可通过模式识别受体识别病原体，并通过吞噬作用清除这些病原体2。肺驻留树突状细胞通过抗原呈递连接固有免疫与适应性免疫应答3。此外，活化的局部固有免疫细胞可产生细胞因子和趋化因子，从而放大炎症反应，并促进单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等免疫细胞向肺组织浸润1。已有研究表明，缺血性脑卒中可改变全身免疫状态，导致对肺部感染的易感性增加；然而，关于缺血性脑卒中后肺部微环境变化的研究较少，尽管部分研究已在 炎症条件下对此进行过探讨4,5,6,7,8,9。本文所述方法的目标是同时评估肺部病理变化、免疫细胞组成以及肺组织中细胞因子和趋化因子的表达水平，以分析缺血性脑卒中后肺部微环境的改变，并评估肺部免疫应答可能发生的改变。

本文介绍了一种从小鼠肺组织中制备单细胞悬液的实验方案，用于鉴定13种免疫细胞。该方案基于胶原酶D消化组织，无需使用自动组织解离仪。此外，我们还建立了一种制备组织匀浆的方法，可用于通过基于流式细胞术的多重微球阵列技术检测13种不同细胞因子或趋化因子的表达水平。该方案已成功应用于研究缺血性脑卒中对肺部免疫的影响，也可适用于其他疾病模型。

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方案

所有实验方案和操作均经西弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。小鼠饲养于西弗吉尼亚大学动物实验中心的无特定病原体环境中。 

1. 溶液的配制

  1. 配制灌注缓冲液（磷酸盐缓冲液，PBS）。每只小鼠使用约两份10 mL的冰冻PBS。
  2. 配制肺细胞培养基/FACS缓冲液。FACS缓冲液含有添加1%胎牛血清（FBS）的PBS。在整个肺组织切除和转移过程中保持培养基低温。每份肺组织样本准备约8 mL。实验前新鲜配制培养基/FACS缓冲液。
  3. 配制用于单细胞分离的消化缓冲液。缓冲液包含1 mg/mL胶原酶D和200 µg/mL DNase I的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）。实验前用储存液（100 mg/mL胶原酶D和10 mg/mL DNase I）新鲜配制。每份肺组织样本约需6 mL。使用前确保缓冲液升至室温。
  4. 配制用于肺组织匀浆的匀浆缓冲液。缓冲液包含PBS和1×蛋白酶与磷酸酶抑制剂混合液（储存液为100×）。实验前新鲜配制。整个匀浆过程中保持缓冲液低温。匀浆单侧肺叶约需200 µL缓冲液。

2. 短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）

注意：通过单丝插入大脑中动脉进行tMCAO的操作步骤此前已有详细记录10。在这些实验中，使用了8至12周龄、体重为25-30 g的雄性C57BL/6J小鼠。

  1. 简要而言，术前对小鼠皮下注射2 mg/kg美洛昔康。使用5%异氟烷在诱导室中对小鼠进行深度麻醉，并通过夹趾法确认麻醉深度。手术期间通过鼻罩维持1–2%异氟烷麻醉。在小鼠身下放置加热毯，全程维持体温在36.5–38 °C。所有手术器械应在手术前一天进行高压灭菌处理。
  2. 使用70%乙醇和氯己定溶液对小鼠颈部腹侧皮肤进行剃毛和消毒。在切口前，于切口区域皮下注射2 mg/kg布比卡因。使用眼膏覆盖眼睛，防止角膜干燥。沿颈部正中做一切口，轻柔分离气管周围的软组织。
  3. 辨认左侧颈总动脉和颈外动脉。
  4. 在颈总动脉上使用临时结扎线（6/0规格）以阻断血流，随后在颈外动脉上做一切口。
  5. 将一根硅胶包被的单丝线（6-0规格）插入颈外动脉，然后将其推进至大脑中动脉。将单丝线留置于大脑中动脉60分钟（闭塞期）。
  6. 使用激光多普勒血流仪监测血流速度。当大脑中动脉血流速度降低超过>80%时，提示闭塞成功。
  7. 完成60分钟闭塞后，撤出单丝线以实现再灌注，并缝合切口。
  8. 对于假手术组小鼠，执行步骤2.1–2.6，但不插入单丝线。在此类小鼠中，血流速度应在整个过程中保持稳定。
  9. 术后每日观察小鼠状态，并采用标准评分标准评估神经功能缺损11。0分——无神经功能缺损；1分——尾部提起时对侧前肢回缩；2分——尾部提起时向对侧转圈；3分——行走时向对侧倾倒；4分——不能自发行走或处于昏迷状态；5分——死亡。
  10. 术后连续3天，每天皮下注射生理盐水和镇痛剂（美洛昔康，2 mg/kg）。
  11. 在tMCAO术后24小时和72小时分别取肺组织，用于后续分析。

3. 收集肺组织

  1. 通过腹腔注射（i.p.）给予小鼠 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪，使其深度麻醉。使用脚趾夹捏法确认小鼠已深度麻醉。
  2. 为进行全身经心脏灌注12，将小鼠固定在手术平台上，并用 70% 乙醇润湿毛发，以减少毛发散落到体腔内。使用精细解剖剪在腹部尾侧做一横向切口，然后沿中线切开腹膜，至接近膈肌前的胸腔为止。
    1. 切勿切穿肌肉/皮肤进入腹膜腔，且切口不应超过腹部范围。
  3. 一旦到达胸腔，即停止切口，避免穿刺膈肌。注意不要损伤心脏和肺，以免影响灌注质量或细胞回收率。
  4. 使用精细解剖剪沿中线切开腹膜，至接近膈肌前的胸腔为止。
  5. 用镊子夹住胸骨远端并向上提起，同时剪开膈肌，注意避免损伤心脏、肺或血管系统。待器官暴露后，剪开肋骨，并将肋骨分开并向后固定，使心脏和肺完全暴露。
  6. 小心地在右心房靠近主动脉弓处做一个小切口，作为灌注的流出通道。
  7. 紧接着，将连接有 10 mL 冷 PBS 的 25 G × 5/8 针头轻轻插入左心室远端上表面。注意避免穿入室间隔进入右心室。针头应仅轻微插入左心室。
    注意：若穿破室间隔，液体会从小鼠鼻腔迅速流出，这将降低灌注质量并导致细胞丢失。
  8. 如有需要，可在灌注过程中使用夹子将针头牢固固定于左心室。
  9. 平稳而轻柔地将 10 mL 冷 PBS 推入心脏。随着液体从右心房流出，小鼠组织应开始灌注并清除血液。
    1. 再推注第二份 10 mL PBS，直至血液清除充分。肝脏将呈现浅棕色，肺则由粉红色逐渐变为近乎白色。
  10. 使用镊子和精细解剖剪，小心去除所有周围组织，包括心脏、气管、食管、胸腺、结缔组织、淋巴结和大支气管。
  11. 分离各个肺叶，并将肺叶放入含有 1–2 mL 冷肺细胞培养基的冰上培养皿中。

4. 使用珠式均质器对肺组织进行均质化处理以用于多重微球阵列分析

  1. 预先将含有3颗无菌2.3 mm氧化锆/二氧化硅珠的2 mL锥形螺口管置于冰上冷却。向管中加入200 µL冷匀浆缓冲液。
  2. 称取肺叶组织，将其转移至预冷的含有珠子和匀浆缓冲液的锥形管中。
    注意：约50–100 mg组织在200 µL缓冲液中匀浆，足以用于检测样本中的细胞因子和趋化因子表达。
    1. 使用基于珠子的匀浆仪（参见材料表），在4,000 rpm条件下匀浆2分钟。
    2. 确保组织完全匀浆；如需要，可延长匀浆时间。
  3. 匀浆完成后，将管子置于预冷（4 °C）的微量离心机中，在15,870 x g 条件下离心3分钟。
  4. 将上清液转移至预冷的1.5 mL微量离心管中。
  5. 将样品立即置于冰上使用，或于-80 °C保存以备后续使用。避免反复冻融。

5. 肺组织解离与单细胞分离

  1. 弃去肺细胞培养基，以免残留的肺叶稀释解离缓冲液。然后，将装有1 mL解离缓冲液、配有25G 5/8针头的1 mL注射器小心插入肺组织中。  
  2. 注射少量组分（约1/4）th 至1/5th将解离缓冲液注入每个肺叶，并轻轻膨胀。
    注意：由于肺叶已被切除，充气后大部分缓冲液会立即迅速流出。
  3. 重复加入解离缓冲液1-2次。
  4. 将肺叶与解离缓冲液在室温下孵育2分钟。
  5. 使用精细解剖剪将肺叶切碎成小块。
  6. 将切碎的肺组织块连同解离缓冲液转移至15 mL离心管中。  补充解离缓冲液至总体积6 mL。剧烈涡旋振荡1分钟。
  7. 在37 °C下孵育样品45分钟，每7-8分钟剧烈涡旋振荡一次。
  8. 孵育45分钟后，为获得最佳效果，将样品剧烈涡旋振荡1分钟。
  9. 通过100 µm细胞滤筛进一步解离样本，以去除残留的非目标结缔组织和间质组织。
  10. 将样品在380 × g下离心10分钟 x g弃去上清液。
  11. 加入5 mL冷的肺细胞培养基至样品中，轻轻涡旋振荡以重悬细胞沉淀。
  12. 将样品在380 × g下离心10分钟 x g弃去上清液。
  13. 加入1 mL冷的肺细胞培养基，轻轻涡旋振荡以重悬细胞沉淀。
  14. 通过100 µm细胞滤网过滤，计数细胞。

6. 肺免疫细胞微环境的流式细胞术分析

  1. 将每种抗体组合对应的 1-2 × 106 个细胞接种至 96 孔圆底板中（共 3 组）。在 830 x g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
  2. 用含可固定的活/死细胞染料的 50 µL 冷 PBS 重悬细胞沉淀。按照制造商说明书配制染料。
  3. 在 4 °C 避光孵育 20 分钟。在 830 x g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
  4. 用含 5 µg/mL 抗小鼠 CD16/32 抗体的 25 µL 冷 FACS 缓冲液重悬细胞沉淀。在 4 °C 孵育 10–15 分钟。
  5. 向细胞中加入含 表 1 所列抗体组合的 25 µL 冷 FACS 缓冲液。轻轻吹打混匀。
    注意：抗体染色所用 FACS 缓冲液总体积为 50 µL。因此，配制 25 µL 抗体主混合液时，各抗体浓度应为最终浓度的两倍。 
  6. 在 4 °C 避光孵育 20 分钟。在 830 x g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
  7. 用 100 µL 冷 FACS 缓冲液重悬细胞。在 830 x g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
  8. 用 100 µL 冷 FACS 缓冲液重悬细胞，转移至含额外 150 µL FACS 缓冲液的聚苯乙烯圆底 5 mL FACS 管中。立即使用流式细胞仪分析样品。
    注意：通过以下步骤进行细胞固定后，样品可延迟分析。
  9. 在完成步骤 6.7 后，用 100 µL 含 1% 多聚甲醛的 PBS 重悬样品。
  10. 在 4 °C 避光孵育 15 分钟。在 830 x g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
  11. 用 100 µL 冷 FACS 缓冲液重悬细胞。在 830 x g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
  12. 用 100 µL 冷 FACS 缓冲液重悬细胞，于 4 °C 避光保存。在 72 小时内完成样品分析。

7. 用于细胞因子和趋化因子检测的多重微球阵列

注意：采用市售的促炎性趋化因子和炎症多重检测试剂盒（见材料表），按照制造商提供的方案检测tMCAO诱导后肺组织中趋化因子和细胞因子的表达水平，该方法已有详细描述13。

  1. 简要而言，若分析物在组织匀浆后于 -80 °C 保存，则需在冰上解冻。使用前在 4 °C 下以 590 x g 离心 2 分钟，以去除任何残留组织。
  2. 通过将已知浓度为 10 ng/mL 的标准品混合液（C7）进行系列稀释，制备 7 个标准品（C1–6），最后一个标准品仅含测定缓冲液（C0）。
  3. 待所有试剂恢复至室温后，向 V 型底 96 孔板中每孔加入 25 µL 各标准品及 25 µL 测定缓冲液。 
  4. 向每个样本孔中加入 25 µL 肺组织匀浆液（分析物）和 25 µL 测定缓冲液至 V 型底 96 孔板中。
  5. 剧烈涡旋预包被微球，然后向每个标准品孔和样本孔中加入 25 µL 预包被微球。
  6. 密封酶标板，并用铝箔覆盖以避光。在室温下以 110 rpm 振荡 2 小时。
  7. 在 230 x g 下离心 5 分钟。加入 200 µL 1x 洗涤缓冲液（储存液为 20x，用水稀释至 1x）。孵育 1 分钟。
  8. 在 230 x g 下离心 5 分钟。用 25 µL 检测抗体重悬标准品和样本。
  9. 密封并覆盖酶标板以避光。在室温下以 110 rpm 振荡 1 小时。
  10. 向每个标准品和样本孔中加入 25 µL 链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）。
  11. 密封并覆盖酶标板以避光。在室温下以 110 rpm 振荡 30 分钟。
  12. 在 230 x g 下离心 5 分钟。用 1x 洗涤缓冲液重悬标准品和样本。
  13. 转移至含有额外 150 µL 1x 洗涤缓冲液的已明确标记的聚苯乙烯圆底 5 mL FACS 管中。
  14. 使用流式细胞仪测定各标准品和样本的 PE 荧光信号强度。
  15. 以 PE 的平均荧光强度（MFI）对预先确定的浓度作图，为每种趋化因子和细胞因子构建标准曲线。
  16. 根据标准曲线及各样本的 MFI 确定每种趋化因子和细胞因子的浓度。多重检测面板提供数据分析软件，可用于确定各分析物的浓度。以肺尖叶/上叶的重量计算每毫克组织中的细胞因子或趋化因子浓度。   

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结果

我们近期报道了小鼠脑缺血性卒中诱导会改变肺部的免疫细胞组成11。具体而言，短暂性脑缺血增加了肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和CD11b+树突状细胞的比例，同时降低了肺组织中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和嗜酸性粒细胞的比例。此外，细胞组成的改变与肺组织中多种趋化因子水平显著降低相关。本文描述了一种用于分离和鉴定肺组织中不同免疫细胞群体的方法。此处展示的代表性结果来自经历tMCAO诱导和假手术处理的小鼠。

我们使用3组抗体组合，在肺部鉴定了13种不同的免疫细胞群体（L1-L13），每组包含5至7种抗体图1）。每组均使用LIVE/DEAD染色排除死细胞。用于区分不同免疫细胞类型的抗体和标记物列于 表1肺泡巨噬细胞、间质巨噬细胞、CD103+ 树突状细胞、CD11b+ 树突状细胞以及嗜酸性粒细胞在Set 1中被鉴定出（图1A，B

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讨论

本文所述的实验方案可用于鉴定同一只小鼠肺部的免疫细胞类型以及趋化因子或细胞因子的表达情况。如果需要进行组织病理学研究，可在进行单细胞分离步骤之前，单独取出一个肺叶并固定以用于该目的。该方法的一个局限性在于，在某些疾病状态下，如果免疫细胞组成以及趋化因子和/或细胞因子的表达在肺的不同肺叶之间分布不均，则此方法可能不适用。例如，某些细菌（如Mycobacterium tuberculosis）倾向于感染肺的特定肺叶21。在这种情况下，可能需要对不同肺叶进行比较分析。

肺组织单细胞分离方案中的浓度、孵育时间和温度对肺内免疫细胞的回收率具有关键影响。胶原酶D的质量对于获得最佳结果至关重要，若使用不同来源的胶原酶D，应进行测试验证。组织消化过度会导致细胞死亡增加；而消化不足则会导致免疫细胞得率降低，尤其是巨噬细胞和树突状细胞。

我们使用了3种抗体组合来鉴定肺组织中的13种免疫细胞群体，每组组合包含5-7种抗体以及一种活/死细胞染料。  如果从样本中获得的细胞数量...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目P20 GM109098以及Praespero公司创新奖项目资助Edwin Wan完成。流式细胞术实验在西弗吉尼亚大学（WVU）流式细胞术平台完成。 & 单细胞核心设施，该设施 由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 S10 OD016165、U57 GM104942、P30 GM103488 和 P20 GM103434。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
B220-APC，克隆号 RA3-6B2Biolegend1032121:200 稀释
Beadbug 3 位珠式匀浆仪Benchmark ScientificD1030组织匀浆仪
CCR2-BV421，克隆号 SA203G11Biolegend1506051:200 稀释
CD103-BV421，克隆号 2E7Biolegend1214221:200 稀释
CD11b-PE/Cy7，克隆号 M1/70Biolegend1012161:400 稀释
CD11c-PE/Cy7，克隆号 N418Biolegend1173181:200 稀释
CD11c-Percp/Cy5.5，克隆号 N418Biolegend1173281:200 稀释
CD4-BV421，克隆号 GK1.5Biolegend1004431:200 稀释
CD45-FITC，克隆号 30-F11Biolegend1031081:200 稀释
CD64-APC，克隆号 X54-5/7.1Biolegend1393061:200 稀释
CD8-PE，克隆号 53-6.7Biolegend1007081:800 稀释
胶原酶 DSigma Aldrich11088882001解离缓冲液组分
锥形螺口管ThermoFisher02-681-344用于组织匀浆的管
DNase ISigma Aldrich10104159001解离缓冲液组分
Fc 封闭抗体 CD16/32Biolegend1013201:100 稀释
gentleMACS 解离仪Miltenyi Biotec130-093-235比较有无机械解离仪时的肺组织消化效果
gentleMACS C 管Miltenyi Biotec130-093-237与 gentleMACS 解离仪配合使用的组织解离管
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液ThermoFisher78442匀浆缓冲液组分
激光多普勒血流监测仪MoorMOORVMS-LDFtMCAO 期间的血流监测
LEGENDplex 促炎性趋化因子检测试剂盒Biolegend740451多重微球阵列
LIVE/DEAD 可固定近红外染料ThermoFisherL34976流式细胞术分析中用于排除死细胞
Ly6C-PE，克隆号 HK1.4Biolegend1280081:800 稀释
Ly6G-BV510，克隆号 1A8Biolegend1276331:200 稀释
MCAO 缝合线 L56 可重复使用 6-0 中号Doccol602356PK10RetMCAO
MHC II-BV510，克隆号 M5/114.15.2Biolegend1076361:800 稀释
NK1.1-Percp/Cy5.5，克隆号 PK136Biolegend1087281:200 稀释
Siglec F-PE，克隆号 E50-2440BD Biosciences5521261:200 稀释
丝线缝合线，6/0 规格Fine Science Tools18020-60tMCAO
SomnoSuite 麻醉系统Kent ScientificSS-01用于 tMCAO 小鼠的麻醉
TCRb-BV510，克隆号 H57-897Biolegend1092341:200 稀释
氧化锆/二氧化硅珠，2.3 mmBiospec11079125z用于组织匀浆的珠子

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