本方案描述了检测和定量秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞以膜结合型胞外小体形式释放的大分子聚集体和/或细胞器外排物（约4 µm）的方法。我们介绍了为深入研究这种碎片排出机制所需使用的品系、培养条件、评分标准、实验时间安排以及显微镜观察的相关注意事项。
方法文章
定量评分方法 体内 大型外吐囊泡中的神经元聚集体和细胞器外排 秀丽隐杆线虫
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
错误折叠蛋白的毒性及线粒体功能障碍是促进跨物种年龄相关性神经元功能衰退和神经退行性疾病的关键因素。尽管这些神经毒性挑战长期以来被认为属于细胞内在特性，但现有大量证据表明，起源于一个神经元的错误折叠人类疾病蛋白可出现在邻近细胞中，这一现象被认为可能促进人类神经退行性疾病的病理扩散。
C. elegans 成虫神经元在表达聚集性蛋白时，能够释放出较大的（约 4 µm）由膜包被的囊泡，这些囊泡可能包含聚集的蛋白、线粒体和溶酶体。这些大型囊泡被称为“外吐体”（exophers），与外泌体（exosomes）不同（外泌体约小 100 倍，且具有不同的生物发生机制）。通过外吐体排出细胞碎片可能是一种保守的机制，代表了神经元蛋白质稳态和线粒体质量控制的一个基本但此前未被认识的分支，与人类神经退行性疾病中蛋白聚集物扩散的过程相关。
尽管胞外小泡（exopher）的研究主要集中于在触觉神经元中表达高拷贝数转基因mCherry的动物，但这些实验方案同样适用于研究多种类型神经元中荧光标记的细胞器或其他目的蛋白的胞外小泡形成过程（exophergenesis）。
本文描述了秀丽隐杆线虫（C. elegans）外泌体的物理特征、检测策略、鉴定标准、定量的最佳时机，以及可控制影响外泌体产生水平的应激因素的动物培养方案。上述方案的详细信息共同为不同实验室开展外泌体的定量分析建立了标准化参考。本文件旨在为致力于研究外泌体产生机制及其被邻近或远端细胞响应机制的实验室提供领域内的参考资源。
引言
聚集体和功能障碍线粒体的神经毒性挑战长期以来被认为属于细胞内在问题，但近年来研究逐渐明确，起源于一个神经元的错误折叠人类疾病相关蛋白亦可扩散至邻近细胞，促进病理过程1。同样，哺乳动物的线粒体可从其原始生成细胞中释放，用于跨细胞降解2，或用于挽救受损邻近细胞中的线粒体群体3。通常观察到各种尺寸的囊泡可将细胞物质转移至邻近细胞或周围液体环境中4。某些排出的囊泡大小接近平均神经元胞体（平均触觉神经元胞体约 6 µm），足以容纳大型聚集体和细胞器。
一种能够携带蛋白质聚集体和细胞器的大囊泡外排现象的显著例子发生在表达高拷贝数报告基因构建体的 C. elegans 触觉感受神经元中，该构建体编码一种有害的、易于聚集且抗降解的 mCherry5。这些来自触觉神经元的外排结构被称为“外泌体”（exophers），平均直径约为 4 µm，可选择性地包裹 mCherry 或其他聚集体，并被直接递送至邻近的下皮层组织，而下皮层通常包绕着触觉感受神经元。下皮层会尝试通过溶酶体途径进行降解，但某些不可消化的内容物（如 mCherry 聚集体）可被下皮层再次外排至动物体内充满液体的假体腔中，随后 mCherry 可被远端的清道夫细胞（称为体腔细胞，coelomocytes）摄取并长期储存（图 1，图 2）5。
这些大型挤出的外吐小体囊泡被触觉感受器的质膜包裹，离开细胞后可包含聚集的人类疾病相关蛋白、线粒体以及溶酶体。外吐小体的生成过程似乎涉及对潜在毒性物质的分选（例如，易于聚集的表达型mCherry会被分隔出来，而可溶性、无害的蛋白如GFP则主要保留在神经元胞体中）。通过这种方式，神经元实现了对威胁性物质的定向排出5。蛋白稳态的挑战，例如由 自噬基因敲低、MG132介导的蛋白酶体抑制，或转基因表达与人类疾病相关的蛋白（如亨廷顿病相关的多聚谷氨酰胺扩增片段Q128，或阿尔茨海默病相关的Aβ1-42片段）所引起的压力，均可增加产生外吐小体的神经元数量5。
由于外泌体（exophers）是最近才被记录的，其生物学特性值得描述。外泌体最初发现于，并且研究最为深入的是在 秀丽隐杆线虫 触觉感受神经元。共有六种 秀丽隐杆线虫 细胞体分布在全身各处的机械感觉触觉神经元（图3A）因其超微结构具有独特的15条原纤维微管而被称为微管细胞。触觉感受神经元包括前端的AVM（前腹侧微管神经元）、ALMR和ALML（前外侧微管神经元右侧和左侧）、位置更靠中央的PVM（后腹侧微管神经元），以及尾部的后侧PLMR和PLML（后外侧微管神经元右侧和左侧）。有趣的是，尽管这六种触觉感受神经元表达相同的有害转基因，但其产生外泌体（exophers）的速率却各不相同。图3C在六种机械感知触觉感受神经元中，ALMR神经元发生外泌体生成的频率高于其他触觉神经元。因此，通常通过聚焦ALMR来定量触觉神经元中外泌体的数量。
排泡生成是一个动态过程，通常始于神经元胞浆的肿胀（图1A-B）。细胞内容物、细胞器或蛋白质聚集体被聚集到神经元胞体的一侧，最常见的是向ALMR神经元的后端（远离突起的神经突方向）聚集，形成排泡前结构域（PED）（图1B）。当PED开始向外突出时，可观察到早期突起，形成一个明显的突出芽状结构。当排泡前结构域的最大直径比胞体与排泡连接处颈部的缩窄直径大约⅓时，定义为晚期芽状结构（图1C）。 排泡可以从胞体向几乎任意方向释放，但大多数排泡从细胞体的后部排出，并保持与起源胞体大致相同的焦平面。
随着出芽颈部收缩成一条细丝，外泌体可从起源的胞体移开。外泌体可通过此细丝与胞体保持连接（图1D，箭头），之后可能完全脱离。细胞内容物如钙离子、蛋白聚集体和线粒体可通过该细丝转运至相连的外泌体5，尽管大部分被挤出的物质是在大规模出芽过程中进入外泌体腔室的。当不再有可见的连接管或细丝，且外泌体与供体胞体完全分离时，即被视为成熟外泌体（图1E）。
由外泌体产生 秀丽隐杆线虫 触觉神经元立即接触到其周围的表皮组织。通常情况下，exopher囊泡似乎在表皮组织内向后部尾侧移动，在exopher内容物被靶向降解之前，其位置可能已距离胞体较远（例如，可达约100 µm）图1F））。荧光外泌体囊泡在表皮下层分裂成许多更小的囊泡，呈现出被称为“星夜”（starry night）的形态图1G 和 图2）。在“星夜”阶段，与最初的单一外排泡相比，可观察到点状荧光物质分散在表皮合胞体中，形成许多更小的荧光点。“星夜”在低倍镜下呈点状，高倍镜下则表现为点状和/或网状结构，位于表皮层内。“星夜”的荧光信号通常比外排泡及神经元表达的荧光更弱。图2B-C）。mCherry 分散至多个点状囊泡中，被认为涉及吞噬体成熟及与表皮下细胞的内体/溶酶体网络融合。部分外排小体内容物可能在表皮下溶酶体网络中被降解，但一些抗降解的残留物（如 mCherry 聚集体）则被排出表皮下组织进入假体腔——一种可容纳细胞碎片的液体腔室。随后，这些荧光物质被远处的清道细胞——即体腔细胞——所摄取（图2C），可浓缩、储存并再次尝试降解 mCherry。
聚集体的挤压与转移现象在不同门类生物中具有保守性，已在C. elegans5,6,7和D. melanogaster8,9等遗传模型以及多种哺乳动物模型中被报道。在哺乳动物细胞中也观察到了类似外泌体（exopher-like）的突出结构10，这一发现提示聚集体和细胞器排出可能由保守的机制所介导。因此，外泌体的生成可能是一种保守的细胞碎片清除机制，构成了神经元蛋白质稳态和线粒体质量控制的一个基本但此前未被认识的分支；当该过程失衡时，可能主动促进神经退行性疾病的发生。未来的研究仍需明确参与碎片识别与分选、向特定亚细胞区域转运、挤压排出、连接胞体与晚期外泌体的管状结构的形成/断裂，以及由邻近细胞识别并远程降解大体积挤出囊泡的相关分子。利用线虫和果蝇模型开展的研究将对阐明聚集体和细胞器收集与转移的机制至关重要，这些模型所提供的无偏倚遗传学方法和强大的细胞生物学工具，有助于在生理背景下鉴定参与该过程的分子。
解析外泌体生物学机制的关键第一步是制定可重复的实验方案 体内 外泌体定量。该 秀丽隐杆线虫 该模型在此类研究中具有独特优势，因其身体透明，当外泌体携带荧光标记的蛋白质或细胞器时，可被直接观察到。已有研究报道，外泌体可由 秀丽隐杆线虫 多巴胺能神经元 PDE 和 CEP，ASE 和 ASER 感觉神经元，以及染料填充的纤毛神经元5由于触觉感受神经元产生的外体（exopher）特征最为明确，本文重点介绍利用触觉神经元进行外体分析的方法。然而，该基本方法也可适用于检测和量化任何细胞产生的外体。检测和定量由不同细胞产生的外体的实验方案 秀丽隐杆线虫 表达mCherry蛋白的转基因触觉感受器神经元被标示出来，重点在于可监测的运输 cargo 及评分时的时间限制。本文阐述了相关研究方法 体内 外小体的鉴定，以及调控外小体生成的环境与遗传条件的定量分析。实验方案强调，为确定基础水平的外小体生成并实现不同基因型间的比较，必须严格维持恒定的非应激条件。
方案
1. 用于外泌体检测的菌株
- 选择一种在秀丽隐杆线虫（C. elegans）神经元中表达荧光货物的品系，以便于观察外泌体（exopher）。
注意：表1列出了已用于观察触觉感受神经元中外泌体形成的品系5,11,12。理论上，可通过使用特定细胞或组织启动子驱动易于聚集或被选择性排出的荧光蛋白表达，来检测任意细胞或神经元类型是否产生外泌体。 - 或者，可使用染料填充实验来观察头部纤毛神经元（amphid head neurons）中的外泌体，这些神经元与外界相通，适合进行逆向填充5,13。
2. 培养基
- 根据标准方法制备标准线虫生长培养基（NGM）以培养菌株14,15。
注意：缺乏食物或常用以阻断子代产生的氟代脱氧尿苷（FuDR）会显著影响外泌体的产生。应持续提供食物（避免细菌食物短暂耗尽），并保持动物处于恒定温度条件下。
3. 动物饲养对稳定产生外泌体至关重要
- 在一致的培养基上饲养动物，并使用一致的细菌作为食物来源。动物 不得 耗尽细菌食物，即使只是短暂时期，因为食物限制会显著改变外泌体的产生水平。
- 在整个研究过程中保持培养基配方和制备方法的一致性。
注意：更换培养基可能影响外泌体产生的基础水平。 琼脂批次可能影响基础外泌体小体（exopher）水平，因此当试剂批次更换时，需记录更换日期。储备平板使用超过两周后应丢弃，以确保细菌食物处于健康状态，并防止琼脂干燥；干燥会导致琼脂渗透压改变，进而影响外泌体小体水平。 - 在基础条件下，将动物维持在20 °C的恒定温度。在可变温度下饲养动物（即使是暂时的） 温度变化等因素可能导致最大外泌体产生时间的差异。
注意：温度变化不仅限于培养条件。实验过程中或实验台操作时的温度波动也可能产生显著影响。例如，显微镜室内的温度应与培养箱或实验台温度无明显差异。 - 不要使用药理学抗生育干预措施，因为受精卵对于早期成虫外排体的产生至关重要。
注意：氟脱氧尿苷（FuDR）的使用16 或 C2217，必须避免。 在进行寿命或老年动物实验时，应通过物理方法将成年个体从其体型较小的后代中分离，将其挑取至涂有细菌的新培养板上，以维持年龄同步的种群，而非使用常见的药理学抗生育干预手段。 - 切勿使用受污染的培养物；若细胞群体或培养板出现生物学污染，应重新开始实验。 细菌或真菌污染可诱导动物产生应激反应和代谢变化，因此实验种群中必须排除此类污染。
- 为获得可重复的实验结果，在实验前需于20 °C条件下培养至少两个健康、营养充足且无污染的世代，以避免潜在的环境诱导表观遗传改变。
4. 通过漂白、蔗糖漂浮或L4期幼虫挑选对exopher评分进行年龄同步化
- 保持实验种群的生物学年龄一致，因为外泌体的检测模式随成虫年龄而变化，混合年龄种群的动物比较可能混淆实验结果。 始终通过检查实验动物种群在L4阶段是否具有“白色新月形”阴门形态，以确保同步化成功。
注意：通常情况下，外泌体产生的高峰出现在 秀丽隐杆线虫 成年第2-3天发生机械感觉ALMR神经元图3D), 从L4阶段后天数测量。成虫第1天指L4幼虫阶段后24小时，该阶段以“白色新月形”阴门形态为特征（图5E). - 通过漂白有孕成虫制备同步化的卵群体。
- 用M9缓冲液冲洗在NGM平板上生长的成年线虫，收集充满卵的成虫。冲洗时，向平板中加入1 mL M9缓冲液，用移液器反复吹打以收集悬浮有线虫的液体，并将液体转移至1.5 mL微量离心管中。通过重力沉降或使用小型离心机进行轻柔离心使线虫沉淀，随后弃去上清液。
- 加入150 µL 5M NaOH和150 µL 6%次氯酸钠（漂白剂）至1 mL H₂O中2O，并倒置混匀约5分钟。
注意：使用新鲜的漂白液可确保破坏动物的角质层，以便收获卵。 可在解剖显微镜下观察角质层破坏的进展情况；当成虫开始破裂并释放卵时，应停止漂白。 - 用微量离心管轻轻离心20秒，然后移去上清液。 加入1 mL M9缓冲液，再次离心，离心后在沉淀上方保留约100 µL液体。
- 重复步骤 4.2.3 两次，以去除漂白液残留。
- 重悬 将剩余体积中的卵转移至新鲜的已接种NGM平板中。成虫将被裂解，但制备物中应含有大量可存活的卵。
- 通过定时产卵制备同步化群体。
- 使用标准转移方法，挑选20只带有卵的成虫至已接种的NGM平板上14.
- 让动物自由爬行并产卵1.5小时（产仔数较少的突变品系可能需要引入更多的成年个体）。
- 用挑取法移除平板上的所有成虫，留下同步化的卵群体。数小时后检查平板，确认在移除成虫过程中未遗漏任何有活力的成虫。
- 通过蔗糖漂浮法筛选卵子以制备同步化的卵子群体。
- 从五块 NGM 平板上收集动物和卵，这些平板上已让成年 gravid 动物产卵至少 24 小时；通过加入含 0.1% 去垢剂（如 Tween 20 或 Triton X-100）的 M9 溶液淹没平板，将内容物收集至 15 mL 离心管中。在室温下以低速离心（2,000 x g）沉淀成年线虫 g 30 秒。
- 移除上清液，用15 mL新鲜M9缓冲液洗涤样本三次，每次洗涤后弃去上清液，注意保留富含线虫和卵的沉淀。
- 保留2 mL上清液，重悬沉淀。加入2 mL 60%（重量/体积）蔗糖溶液。
- 以 2000 x g 5分钟。此时溶液将出现上层相，其中富含虫卵。
- 将约 2.5 mL 上层相转移至新的 15 mL 离心管中，并加入 10 mL M9。
- 颠倒混匀1分钟，然后以2000 × g离心 g 1 分钟。
- 移除上清液，并用 M9 缓冲液洗涤富含卵的沉淀。取 10–15 µL 卵沉淀物转移至新鲜的接种了 OP50 的 NGM 平板。
注意：该方法可获得大量卵；切勿使收集的线虫耗尽 OP50 食物 E. coli 食物
- 通过挑选处于L4发育阶段的动物来制备同步化群体。
- 在接种的NGM平板上培养动物，具体方法如上所述。
注意： 秀丽隐杆线虫 在20 °C条件下，新产的卵约需9小时孵化，发育经历四个离散阶段。图 5A孵化后，动物依次经历幼虫1期（L1）至幼虫4期（L4），每期持续8–12小时，相邻各期之间经历一次蜕皮。图5A-F因此，接种卵后约40小时，应有大量L4期动物，可用于挑选。 - 通过寻找发育中阴门呈白色新月形的半月状结构来识别处于L4期的动物（图5E).
注意：L4阶段的动物在体型和体表色素沉着方面均一。挑选带有白色新月形结构的个体转移至新鲜的培养平板，用于后续对发育阶段的观察。次日（约24小时后）记为成虫第1天。 - 从成年第2天开始，每天对动物群体进行评分。
注意：通常在成虫期第2天对出胞体进行评分，此时在基础条件下出胞体的产生达到峰值。然而，由于所研究的环境或遗传改变可能会使出胞体生成的峰值及时间发生偏移，建议对成虫动物群体连续四天每日进行评分，以获得最全面的结果图3D).
- 在接种的NGM平板上培养动物，具体方法如上所述。
5. 使用荧光显微镜检测外泌体
- 使用配备荧光显微功能的高倍伪立体解剖显微镜观察外泌小体（exophers）。
- 在NGM琼脂平板表面滴加100–200 µL的10–100 mM左旋咪唑（levamisole）/四咪唑（tetramisole）溶液，将线虫固定于平板上。2–4分钟后，线虫将出现麻痹，可直接在琼脂平板上进行观察。
注意：固定处理并非绝对必需，经过训练的观察者在显微镜下直接观察培养板中爬行的动物时，即可通过视觉识别神经元并判断是否存在外泌小体，从而确定是否产生了外泌泡（exopher）。 - 使用100倍总放大倍数在荧光显微镜下观察神经元，以实现对出胞体（exophers）的解剖显微镜检测。
注意：使用解剖显微镜对出胞体事件进行评分，可相对简便地直接在培养线虫的琼脂平板上观察大量动物。 - 使用共聚焦显微镜对报告基因菌株进行活体成像及制片以开展胞外出泡体研究
- 使用共聚焦显微镜对胞内动态及外泌体生成的特征进行活体成像。
注意：活体成像是一种观察外泌体生成细微特征的有利方法，因为外泌体生成是一个动态过程。 - 使用便捷方法限制动物运动以实现高分辨率活体成像，包括采用10–100 mM的左旋咪唑（levamisole）或四咪唑（tetramisole），或应用直径为15 µm、30 µm或40 µm的水凝胶聚苯乙烯微珠18.
- 使用共聚焦显微镜对胞内动态及外泌体生成的特征进行活体成像。
- 用于复合显微镜和共聚焦显微镜的载玻片制备
- 将20-50个动物样本用固定剂固定在显微镜载玻片上。使用带有直径13 mm凸起圆环的可重复利用的环形细胞学载玻片有助于样本固定。
- 将活体动物挑入涂有圆圈或琼脂垫上的5-20 µL麻痹剂（如10-100 mM左旋咪唑或四咪唑）中。
- 等待4分钟以实现麻痹，然后用盖玻片覆盖载玻片（推荐使用1½号（0.16–0.19 mm）或2号（0.17–0.25 mm）盖玻片）。
- 固定少量动物标本
- 不要压碎载片上的动物；当每张载片仅观察少量（少于20只）动物时，由于盖玻片压力不均，可能导致部分动物被压碎。 通过使用低浓度琼脂糖垫进行封片，可将该风险降至最低。
- 制备2-4%的琼脂糖凝胶垫片，然后向凝胶垫上加入2-15 µL的麻痹溶液。注意左旋咪唑（levamisole）和四咪唑（tetramisole）会扩散进入凝胶垫，从而降低其有效浓度。
- 通过挑选动物进行固定 2-15 µL 麻醉溶液或微珠滴于琼脂垫上。盖上盖玻片，检查动物是否完整18.
- 琼脂垫制备
- 制备2%琼脂垫，将2%琼脂糖加入M9溶液中，微波加热至琼脂糖完全溶解并呈均匀熔融状态。
- 为获得质量合格的琼脂垫，需交替进行混合与低功率微波加热，每次加热时间少于20秒。将煮沸的琼脂置于加热金属块上，使气泡上浮至表面，以避免琼脂垫中产生气泡。
- 使用巴斯德移液管从升腾气泡下方的熔融溶液深处吸取琼脂。
- 准备两张贴有胶带的载玻片，将其置于洁净的玻璃载玻片两侧，平放在平整表面上。制作贴胶带的载玻片时，需在每张载玻片上各贴两条5 cm长的实验室胶带图 6A).
- 使用巴斯德移液管，将一滴琼脂置于被胶带固定的载玻片之间的洁净显微镜载片上（图6B).
- 小心且迅速地将第四张干净的载玻片盖在熔化的琼脂滴上，将其放置在用胶带固定的载玻片上图6Cc).
注意：应轻轻按压载玻片，使熔化的琼脂形成厚度约为0.4 mm（与胶带厚度相同）的扁平圆形图6D）。琼脂应迅速冷却。 - 通过滑动移除上层载玻片（图6E). 琼脂垫干燥迅速，最好在制备后几分钟内使用。移除上层载玻片后，应立即使用凝胶垫进行动物样本封片。避免使用含有气泡的垫片。
- 将琼脂垫夹在两张载玻片之间，存放不超过30分钟。干燥的琼脂会导致动物聚集并脱水。在载玻片上加入2–15 µL麻痹溶液或微珠悬浮液，将动物固定后加盖盖玻片；在麻痹和封片后20分钟内对样本进行镜检图6).
注意：由于应激条件可能改变外泌体的产生率，在筛选外泌体时应避免使用可诱导氧化应激的麻痹剂（例如叠氮化钠）。
- 使用转盘共聚焦显微镜检测外泌体样囊泡
- 使用数值孔径为1.4的63倍和100倍物镜观察细胞器及其他细胞内含物等细胞生物学特征。
- 使用能够进行载物台控制和利用多维采集进行图像采集的软件。显微镜和图像处理软件也应适用于成像与数据收集，因为这些步骤涉及标准的成像方法。
6. 利用固定动物识别触觉神经元并对外排小体进行评分
- 固定麻痹的成年动物（图6）。
- 确定目标Z平面。使用低倍明场（10–40×）识别动物合适的Z平面，注意动物的位置、头尾方向以及阴门的位置——这些是后续识别神经元和细胞外囊泡（exopher）的重要解剖标志（图3A & 图5E）。
- 聚焦于所选报告基因的荧光信号。保持在同一Z平面，切换至10–40×宽场荧光观察模式，观察所选的细胞质报告基因。
注意：本示例中，荧光表达由 mec-4 机械感受触觉神经元特异性启动子驱动。高拷贝数的转基因阵列以及不同的荧光蛋白在表达水平上存在差异，因此荧光强度也会有所不同。必要时可进行调整。 - 沿Z轴方向逐层扫描，观察动物的深度以及焦平面内荧光信号的分布。在此过程中，确认头尾方向：头部/咽部区域可见荧光神经环，而尾部在此情况下通常包含1–2个可见的PLM胞体（图3A）。
- 识别触觉神经元
- 确定动物是左侧还是右侧朝下放置（图3A）。
注意：考虑到动物的三维结构，最接近光学物镜的一侧可获得最佳成像分辨率。 - 通过观察识别胞体（ALM、ALMR、AVM）——从头部开始，识别荧光神经环及侧向的神经突起。
- 在10–40×放大倍数下，缓慢沿Z轴扫描，以识别与胞体相连的神经突。
- 一旦识别出神经突，沿其向后外侧追踪至阴门区域，胞体将表现为神经突末端的圆形细胞结构。当找到最清晰聚焦的神经元胞体后，可借助其他神经元解剖标志进一步确认其身份，方法如下：
- 利用邻近的腹侧神经元 AVM 辅助判断动物方位。若AVM与ALM位于同一焦平面，则动物为侧卧，此时不在该平面内的触觉神经元为ALMR。 若AVM与待识别的ALM不在同一焦平面，则最接近焦平面的触觉神经元为ALML。
- 识别位于尾部附近的另一腹侧触觉神经元 PVM，以判断前部触觉神经元是否处于同一焦平面。若PVM与前部神经元共焦，则所观察的触觉神经元为ALML。
- 全面了解 感兴趣区域附近其他胞体的位置（即位于胞体两侧的荧光神经元），并在所有Z平面中进行观察，即使无法使最深层的神经元完全清晰聚焦。
注意：准确识别所有触觉神经元胞体至关重要，因为失焦的胞体可能被误判为细胞外囊泡（exopher）。
- 确定动物是左侧还是右侧朝下放置（图3A）。
7. 鉴定并评分外泌体
- 一旦发现触觉神经元，检查其是否存在足够大的突起（外泌体结构域），大到可被视为出芽型外泌体（reaching 至少 1/5th （起始胞体的大小）（图1C).
注意：平均外泌体直径约为2-8 µm，而（ZB4065）的平均细胞体 bzIs166[ Pmec-4::mCherry]) 动物在成虫第2天时测量为6-10 µm（图7B). - 若未观察到芽状结构或外泌体结构域，应检查神经元胞体上是否附有从胞体发出的细丝。附着的外泌体通常位于靠近其起源胞体的位置，且处于相似的Z平面。
注意：外泌体并不总是附着在胞体上。检测到有附着的丝状结构是判断该物体为外泌体的确切依据。 - 要识别一个未附着的外小体（exopher），需观察其内部成分。外小体可富集被排出的荧光蛋白，因此通常比胞体更亮。
注意：外泌体（exophers）的内容物具有异质性和可变性。细胞器如溶酶体和线粒体也可能被包裹在外泌体中排出图4C-E). - 在与细胞体所在焦平面不同的焦平面上寻找未附着的胞外体。尽管已观察到胞外体可从ALM细胞体向任意方向突出，但通常情况下，胞外体会从神经突起的后侧方向远离细胞体突出。
- 检查是否存在未被正确定位或识别为神经元胞体的大型球状物体。外泌体（exophers）可能呈不规则形状，但通常为球形结构。随着时间推移，外泌体逐渐降解，因此较老的外泌体往往形状更不规则。
注意：成熟或较老的细胞外囊泡与分散的 "星夜" 载物台 通过外泌体荧光强度更高及其球形形态。 - 通过“星夜”表型研究早期外泌体生成现象。外泌体进一步发育为 ““星夜”阶段，外泌体破裂成更小的囊泡，周围的下皮层试图降解其内容物（图1G，2B，3B & 7A).
注意：星夜期阶段的特征是出现碎片状、分散的（有时呈网状）荧光实体，其具有 失去结构完整性，与触觉神经元和外泌体结构相比，荧光明显变暗。 - 寻找“多次出胞事件”的实例。出胞体通常以单次事件的形式产生（1个出胞体来自1个细胞体），但在某些情况下，单个细胞体可释放多个出胞体。图7D).
注意：成熟的外泌体在表皮层降解过程中可分裂为多个囊泡。要区分这些外泌体是来自独立的外泌体形成事件，还是由一个原始外泌体分裂产生额外囊泡，只能通过延时成像观察来确定。 - 请记住 并非所有形态异常都会发育为胞吐体.
- 不要将膨胀的细胞体记为外泌体。有时可观察到延长或呈尖状的细胞体（尤其是在衰老或应激条件下），但若无明显收缩位点的延伸结构，不应记为外泌体。
- 剔除未达到1/5大小的微小已解离芽体th 外泌体事件定量中胞体的大小。
- 不要将神经突起的延伸物计为外泌体。随着年龄增长，成熟的神经突起可显著延伸（通常与神经元突起方向相反），荧光蛋白可能迁移至这些结构的远端19.
注意：这些神经突起的生长并非外泌体，因为它们在数天至数周内具有独特的发育模式，不会形成芽状结构，也不会脱落。图7E).
- 识别荧光实体 不 外泌体样囊泡
注意：了解背景荧光水平对于正确区分挤出的荧光物质与自发荧光至关重要。- 转基因荧光表达与自发荧光 不要将自发荧光误认为转基因表达。真正的外泌体信号不会出现在肠道或消化道中（可通过微分干涉相差显微镜确认这些组织），且外泌体信号的亮度明显高于背景自发荧光。
注意：自发荧光由肠道颗粒中的肠道荧光色素引起，并随年龄增长而积累。该荧光具有异质性，尤其在不同波长下观察时更为明显。 - 胚胎信号。 不要将胚胎信号误认为外泌体生成。通过从荧光切换到明场照明，并检查信号是否与子宫内的卵相关联，以确认对胚胎信号的怀疑。
- 胞体位于焦平面外或邻近区域。 通过识别观察开始时附近所有细胞体（包括焦外的细胞体），避免将焦外细胞体误认为外泌体。
注意：若对来自ALMR的胞外小泡进行评分，需识别并记录AVM和ALMR胞体的位置。有关胞体定位的更多细节描述见下文 图3A.
- 转基因荧光表达与自发荧光 不要将自发荧光误认为转基因表达。真正的外泌体信号不会出现在肠道或消化道中（可通过微分干涉相差显微镜确认这些组织），且外泌体信号的亮度明显高于背景自发荧光。
8. 评分与统计
- 将外泌体囊泡（exopher）评分记为二元值（是，存在外泌体囊泡/否，不存在外泌体囊泡）。
- 将外泌体检测视为一种 "“exopher事件”指在特定神经元中观察到的一个或多个exopher出现在胞体附近的现象。
注意：为了定量分析单个外泌体生成事件的数量，需使用延时观察法。 - 统计特定已识别细胞的外泌体事件数量，因为不同细胞产生外泌体的速率并不相同（例如参见 图3CALMR神经元在本文所述品系中产生的基础外泌体最多，因此通常是用于触觉感受神经元外泌体定量的首选细胞。
- 在统计学上，通常应进行至少3次生物学重复实验， 至少 30 每次试验中评分的动物数量及分析干扰所需对应的观察次数
- 对于涉及一个或两个突变体/处理组与对照组比较的多个试验，采用Cochran-Mantel-Haenszel检验适用于确定 p 值。
- 对于涉及两种以上突变体与对照组比较的试验，使用二元逻辑回归分析来评估任意数量的分类预测变量的显著性也是合适的。
结果
可使用多种荧光报告基因来检测胞吐体。触觉神经元的胞吐体易于观察 体内 通过标记可能被挤出的蛋白质、可被挤出的细胞器或细胞膜来实现。 表1 鉴定出用于监测外排体的触觉神经元表达的荧光报告基因，并包含代表性示例 图4已知在出胞体中被排出的货物包括人亨廷顿蛋白N端结构域与扩展多聚谷氨酰胺（Q128）的融合蛋白（图 4B），利用绿色荧光蛋白标记的溶酶体相关膜蛋白（LMP-1）对溶酶体进行标记（图 4C），以及用定位于线粒体基质的GFP标记的线粒体（图4D细胞质中的GFP未被强烈排出，而是在胞体中优先保留5，尽管GFP可微弱地显示外排体（exophers）图 4A）。当GFP与被排出的蛋白质融合时，该标签可用于观察外排体。一个重要之处在于，通过标记不同的蛋白质，可以研究一系列科学问题，包括特定货物分子和细胞器的排出机制，以及构成外排体的蛋白质和膜成分。
伪立体显微镜装置是一种在琼脂平板上观察动物外泌体的有效工具。该装置结合了复式显微镜与立体显微镜的技术特点，具备每个放大倍数下的高数值孔径光学系统、伪立体技术（在立体基座上配置独立的物镜）以及变焦操作开关，可在已安装物镜的放大倍数之间进行中间倍数的观察。此类显微镜应配备10倍目镜，以及足够强大的物镜，用于观察神经元形态和外泌体生成，以实现高通量评分（使用2倍物镜进行扫描或挑选，10倍物镜用于识别和评分）。
尽管标准体视显微镜的放大能力通常具有足够高的分辨率，能够观察到表达荧光蛋白的触觉神经元网络，但标准解剖显微镜不足以观察外泌体（exopher）的亚细胞结构细节，例如胞体与外泌体之间的管状连接。此类观察需要使用共聚焦显微镜（详见材料表中的设备信息）。
外排体定量研究需要严格的对照，以消除实验性应激因素。为了获得可重复的外排体产生结果，必须仔细维持一致的培养条件。具体而言，外排体的生成对应激具有响应性，因此持续的喂养、恒定的温度以及无污染的跨代培养对于实验的可重复性至关重要。在基础培养条件下，当神经元高水平表达 mCherry 时，外排体的生成率相对较低（约 5–25% 的 ALMR 产生外排体）；但某些应激因素（包括渗透压应激和氧化应激）可提高外排体的生成率。尽管 mCherry 的表达本身可被视为一种应激，但鉴于外排体水平对应激敏感，若加以适当控制，人为引入实验性应激可作为一种更易诱导和观察外排体生成的策略。
时间和预期的外泌体产生水平。 外泌体囊泡在幼虫发育期间几乎不存在。外泌体囊泡产生的高峰期极为局限，主要出现在成虫期第1至第4天，最常见于成虫第2或第3天。由于高峰期可能略有提前或延后，对外泌体囊泡产生特征进行最完整评估的方法是在成虫第1至第4天每天进行多次观察记录。通常情况下，单个ALMR会产生一个主要的外泌体囊泡，该囊泡至少可维持24小时。外泌体囊泡的形成速度相对较快（最快可在数分钟内完成）。. 通常情况下，每个神经元在成年早期仅产生一个主要的外泌体，但也可产生多个外泌体。
在基础条件下，表达 mCherry 的 ALMR 在成虫第 2-3 天的最佳观察时间范围内，产生外泌体（exopher）的比例通常为 5-25%（图 3D）。蛋白质稳态危机5以及其他应激因素均可调节外泌体水平。应激或遗传干扰可使外泌体的产生率升高至高达 90% 的 ALMR 神经元产生外泌体突起。
通过饲喂法RNAi检测特定基因在排胞作用（exophergenesis）中的功能。 线虫 C. elegans 通常通过饲喂表达靶向目的基因的双链RNA（dsRNA）的转基因 E. coli 菌株HT115来进行RNA干扰（RNAi）基因敲降20。在利用饲喂法进行RNAi以检测排胞体（exopher）形成时，可使用HT115菌株5。尽管该技术可用于靶向大多数组织中的转录本，但神经元组织对RNAi的响应性较低。可通过使用在神经元特异性启动子驱动下表达外源性dsRNA转运蛋白SID-1的转基因动物来提高神经元对RNAi的敏感性，从而实现神经组织对RNAi的增敏21。
通过在缺乏内源性RNAi代谢组分的突变体中特异性表达该组分，可实现目标基因的组织特异性敲低。例如：在rde-1突变动物的神经元中特异性表达Argonaute蛋白RDE-1，当动物接受针对该目标基因的RNAi干预时，可实现该基因仅在神经元中的敲低。
采用标准的线虫RNAi实验方案20,22，在L4阶段对亲代进行RNAi处理，并让其子代在表达RNAi的HT115工程菌中生长至成虫期，可实现较强的基因敲低效果；但需注意RNAi可能引起发育延迟，实验组动物的生长状况可能与空载体对照组不同。实验中必须始终设置空载体对照组，以进行阴性对照比较。在通过喂养方式进行RNAi并观察外泌体（exopher）形成时，可使用HT115细菌。然而需注意，某些基因即使在较短时间的RNAi处理下也能显著改变外泌体生成率5。若特定基因的敲低导致发育失败，应避免对动物进行终生基因敲低；可仅在L4阶段将动物转移至RNAi平板，使其从L4期至成虫D2或D3期接受处理。
| 菌株名称 | 基因型 | 描述 | 排胞体百分比 | 参考文献 |
| SK4005 | zdIs5[Pmec-4GFP] | 在触觉神经元中表达胞质GFP。 | 1-8% ALM | 图4A，Melentijevic 2017 |
| ZB4065 | bzIs166[Pmec-4::mCherry] | 在触觉神经元中过表达mCherry（bzIs166），产生胞质信号和mCherry聚集体。bzIs166是排胞体诱导子。mCherry聚集体是排胞体生成的预测标志物，并优先被排出至排胞体中。 | 3-20% ALM（正常条件）；20-80% ALM（饥饿条件）。 | 图4B，Melentijevic 2017 |
| ZB4067 | bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; | YFP在mec-7触觉神经元中进行胞质标记。共表达的Q128::CFP聚集体可诱导排胞体生成。CFP优先被沉默。 | 约25% | 图4C，Meletijevic 2017 |
| ZB4509 | bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] | bzIs168 LMP-1::GFP标记质膜和溶酶体膜。bzIs168可用于识别神经元膜、排胞体（因其具有膜结构）以及溶酶体膜结构。 | 3-20% ALM | 图4D，Melentijevic 2017 |
| ZB4528 | bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] | 等位基因zhsEx17是一种线粒体定位报告基因，其最大激发波长根据局部氧化环境从405 nm（氧化态）变为476 nm（还原态）。该报告基因在触觉神经元中表达，可单独用于识别触觉神经元及其线粒体排胞体中的线粒体。 | 3-20% ALM 蛋白排胞体。ALM线粒体排胞体的定量正在进行中。 | 图4E，Melentijevic 2017，Cannon 2008，Ghose 2013 |
表1. 用于触觉神经元、触觉神经元外排囊泡及外排囊泡内容物成像所使用的品系。
图 1：外小体生成的各个阶段。 形成并释放外小体的过程称为“外小体生成”（exopher-genesis）。外小体形成的动态过程可持续数分钟至数小时。图中展示了在高外小体产生品系 ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] 中，外小体生成动态过程特定步骤下的胞体及外小体形态示例。所有图像均为使用 100 倍物镜拍摄的第 2 天成年 ALM 神经元图像。（A）正常胞体。成年机械感觉触觉神经元 ALM 转基因表达 Pmec-4mCherry。该品系中年轻成年神经元典型的胞体形态如图所示，mCherry 在胞质中呈集中分布。（B）早期出芽阶段。外小体生成中首个可观察到的步骤是特定胞质物质向胞体膜边缘极化。此步骤常伴随胞体的扩张或肿胀。在触觉神经元中，前体外小体区域（PED）会延伸至周围表皮下组织（此处不可见）。注意 mCherry 物质在早期出芽区域的浓度更高。（C）晚期出芽阶段。随着细胞进一步极化及前体外小体区域的扩大，胞体与外小体之间出现明显的收缩（箭头）。这一事件标志着进入晚期出芽阶段。尽管此时细胞已表现出清晰的收缩位点以及独立的胞体与外小体区域，但尚未完全从胞体分离；出芽中的外小体可能仍通过一条较粗的柄状结构相连（箭头）。当出芽区域的直径比收缩部位/柄的直径大约 ⅓ 时，该区域被视为早期外小体。（D）早期外小体阶段。早期外小体可通过一条柄与脱离中的胞体相连——随着外小体远离胞体，该连接的直径可能变细。胞质物质可通过此管道从胞体转移至外小体，但大部分物质在出芽过程中已装载完成。外小体可如图（E）所示从胞体脱离，脱离后的外小体被视为成熟外小体（F）。成熟外小体可在周围表皮下组织中移动，远离其来源的胞体。（G）标记有 mCherry 的外小体在表皮下组织中分解为更小的囊泡，导致 mCherry 物质呈现弥散的点状分布，这很可能是因为其进入了表皮下组织的内溶酶体网络。这种弥散的点状信号被称为“星空”阶段。部分外小体内容物可能由表皮下组织的溶酶体降解，但部分物质未被完全降解，常被表皮下组织重新排入假体腔。mCherry 标记物在外小体生成后的转运过程在 图 2 中有更详细的描述。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：触觉神经元通过外排体排出的 mCherry 会进入周围表皮组织的溶酶体网络，但随后可进一步释放至假体腔中，由体腔细胞储存或降解 mCherry。（A）示意图总结了神经元排出的外排体中 mCherry 在体内的转运过程。在外排体形成过程中，特定的细胞内容物（如 mCherry）会定位于神经元胞体，并以独立囊泡的形式从神经元胞体出芽，该囊泡被神经元和表皮组织的质膜共同包裹。由于触觉神经元嵌入在表皮组织中，当外排体结构向外出芽时，会进一步进入表皮层内部。外排体可在表皮组织中迁移，数小时至数天后，其内容物可在表皮组织的内溶酶体网络中发生断裂。此时 mCherry 可表现为在表皮组织中弥散分布的小点状信号，此阶段称为“星夜”（starry night）。数天后，部分 mCherry 可从表皮组织释放至周围的假体腔中，由一类称为体腔细胞的吞噬细胞接触并摄取，进而储存 mCherry。（B）“星夜”阶段 mCherry 囊泡的典型形态。图像显示 ALM 神经元胞体标记有 mCherry，可见较大的外排体碎片及“星夜”样囊泡。菌株为 ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]。（C）mCherry 在远端体腔细胞中富集的示例。侧视图显示第10天成虫（菌株 ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]）中 mCherry 在体腔细胞中明显富集（箭头所示）。部分“星夜”样囊泡也清晰可见。通常，体腔细胞中的 mCherry 富集现象在成虫期约第5天后开始显现。（B bottom）（B）的示意图再现，其中触觉神经元及其突起以红色标出，最亮的外排体碎片也以红色表示；不同 Z 轴深度的弥散小囊泡以浅粉色表示。（C bottom）（C）图像的示意图版本，神经元突起以红色表示，“星夜”信号以粉色表示，体腔细胞以绿色表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：机械感觉触觉神经元以不同的水平产生exopher，并具有精确的时间特征。（A）（上图）机械感觉触觉神经元在空间上与秀丽隐杆线虫（C. elegans）关键解剖标志的位置关系示意图，包括头部的泵动咽部和神经元密集的神经环、体中部的阴门以及逐渐变细的尾部。（下图）从顶部和左侧观察表达GFP的荧光标记触觉神经元（图像改编自WormAtlas）。红色框表示ALM exopher通常出现的区域。（B）在表达[Pmec-4mCherry]的品系中，ALM来源的exopher在体中部区域的高倍放大视图。图中显示了AVM和ALMR神经元，以及一个ALMR exopher和mCherry星夜样结构。ALMR神经元最易产生exopher。（C）在雌雄同体的基础条件下，ALMR机械感觉触觉神经元比其他触觉神经元更容易产生exopher。图中显示了成虫第2天各单个触觉感受神经元的exopher产生情况。品系：ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]，N>150，误差条表示标准误（SEM）。（D）与青春期L4阶段或老年个体相比，ALMR触觉神经元在成虫第2天和第3天产生更多的exopher。品系：ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]，N>150，误差条表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：标记出泡体内容物的一些荧光报告基因示例。 观察外泌体的一种简便方法是构建表达神经元启动子驱动的荧光蛋白的转基因动物。荧光蛋白可用于可视化外泌体，而转基因表达会诱导蛋白聚集和/或蛋白稳态压力，从而促进外泌体生成。 amphid神经元产生的外泌体也可在天然条件下通过染料填充法进行观察。图中显示了可用于观察外泌体的常见品系示例，(E) 外泌体，(S) 胞体。A) SK4005品系成虫ALM神经元的胞体与外排囊泡 zdIs5[实验方案]mec-4GFP]，摄影使用100倍物镜，比例尺 3μm在此品系中，可检测包含可溶性GFP的外泌体，但外泌体的产生频率较低。在其他研究中，将GFP与倾向于在外泌体中被优先排出的蛋白质融合，证实GFP融合蛋白可在成熟的外泌体中被检测到。. (B) ZB4065品系成虫的ALM胞体与外排囊泡 bzIs166[蛋白质印迹法]mec-4mCherry]，该品系表达 mCherry 并诱导触觉神经元外排体的产生。摄影采用 100 倍物镜，比例尺 5 μm. (C) ZB4067品系成虫的ALM胞体与外排囊泡 bzIs167[蛋白质印迹法]mec-4mitogfp Pmec-4mCherry4 igIs1[蛋白质]mec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; 图像中 htt57Q128::CFP 采用蓝色通道选择性显示。外泌体中含有 htt57Q128::CFP 聚集体（箭头），其在外泌体中的浓度较胞体中更高。摄影使用 40 倍物镜，比例尺 5μm. (D-E) 外吐小体可包含细胞器，利用荧光蛋白对细胞器特异性标记可实现对细胞器外排过程的监测。D溶酶体膜标记物 LMP-1::GFP 可清晰勾勒出胞体及外泌体膜结构，同时微弱地标记细胞膜（细胞膜定位是向溶酶体靶向运输过程中的一个转运步骤），并对溶酶体细胞器表现出强烈标记。图中显示的是共表达 P 的成年 ALM 胞体mec-4mCherry 和 Pmec-7LMP-1::GFP 定位于膜结构和溶酶体。胞体上附有一个外吐体，以及若干较小的突起，可能为外吐体碎片（箭头所示）。GFP 阳性结构存在于胞体内，并分布于较大的外吐体中, 菌株：ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry; bzIs168[蛋白质印迹法]mec-7LMP-1::GFP]。摄影使用100倍物镜，比例尺 5 μm. E) 可使用线粒体GFP标记物来鉴定胞体和外排体中的线粒体。图中显示的是表达P的成年ALM胞体mec-4mCherry 和定位于线粒体基质的 mito::ROGFP。单独表达 mito::ROGFP（不含 mCherry）也可用于识别神经元，并对含有线粒体的外泌体进行评分。菌株：ZB4528 bzIs166[蛋白质印迹法]mec-4mCherry zhsEx17 [实验方案]mec-4mitoLS::ROGFP]。摄影使用100倍物镜；比例尺 5μm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5： 发育周期 C. elegans 以及 L4 鉴定。 (A) 在 20 °C 卵在母体产出后大约需要9小时孵化。B新孵化的动物处于幼虫1期（L1），12小时后蜕皮进入幼虫2期（L2）。C) 动物保持在 L2 以及 (D) 每次约8小时的L3幼虫阶段。E) 青年期动物被视为第四幼虫阶段（L4），其特征是出现明显的发育中阴门，表现为体中部附近的白色新月形结构。这一白色新月形结构的存在使得L4阶段动物易于识别和挑选，从而建立同步化培养，便于后续对出胞体（exophers）进行计数分析。动物在L4阶段持续约10小时，随后经历最后一次蜕皮，发育为产卵期成虫。 F通过发育中的卵、可见的受精囊以及开始产卵来鉴定。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 6：显微镜载玻片琼脂垫的制备。（A）准备两张载玻片，在每张载玻片顶部沿长度方向贴一条实验室胶带。如图所示，将一张未贴胶带的载玻片置于两者之间。（B）在载玻片上滴加一滴熔融的琼脂糖。（C）将一张干净的载玻片轻轻盖在液滴上，将琼脂糖压成一个扁平的圆形垫状。（D）移除带胶带的载玻片，这些载玻片的作用是使琼脂均匀压平，从而形成厚度一致的垫片。（E）待琼脂糖垫干燥后，移去顶部的载玻片。（F）用移液器将麻痹溶液（左旋咪唑或四咪唑）滴加到琼脂垫上。（G）挑选发育阶段合适的生物体进入麻痹溶液中。（H）用盖玻片轻轻覆盖生物体，并确认其仍存活。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：外泌体（exophers）的特征及外泌体鉴定标准 (A) 鉴定外泌体的一般标准。 (B) 发送细胞体与挤出的外泌体在直径上的比较，测量于 μm. 成年ALM细胞体，N=35，品系：ZB4065 bzIs166[蛋白质印迹法]mec-4mCherry 6.53 μm 胞体的平均大小及 3.83 μm 外排体的平均大小。C) 定义区分外泌体结构域与出芽外泌体的标准。D最常见的现象是单个神经元产生一个较大的外吐体（exopher），随后在表皮细胞试图降解其内容物的过程中发生分裂或碎裂。尽管如此，有时可在同一触觉神经元附近观察到多个外吐体，这些结构可能源于单个神经元多次产生外吐体的事件，也可能是因为外吐体自身发生出芽或碎裂所致。多个类外吐体结构的来源只有通过延时显微成像才能确定。上方图示为ALMR触觉神经元胞体及其远离胞体的单个外吐体。下方图示为ALMR触觉神经元胞体及其周围多个类外吐体突起。E成年ALM触觉神经元胞体中可能被误认为外小体事件的常见形态学特征。 左上 - 肿胀的ALM胞体，无明显的外泌体结构域或收缩位点。 中上部 - 神经元可能具有微小的细胞外突起，这些结构可能类似于exopher，但由于不符合exopher的尺寸标准，因此不能被认定为exopher。 右上 – 随着年龄增长，触觉神经元可能在其细小神经突上形成突起。荧光蛋白mCherry常聚集于神经突起的末端。若聚集的mCherry未达到出泡体与胞体大小比例的要求，则不将其记为出泡体。 底部 描绘具有外泌体结构域或外泌体定义特征的成年ALM神经元。 左下 - 具有显著出泡结构域的ALM胞体，该结构域选择性地包含mCherry细胞质和mCherry标记的聚集体。出泡结构域的缩窄部位由箭头标示，并符合尺寸标准（至少为1/5）th 胞体大小）。外排体结构的最大直径比缩窄部位的直径大约1/3，符合外排体事件的标准。 底部中央 - 符合大小标准且具有明显出芽状外泌体的ALM胞体，存在清晰的收缩位点。 右下角 - 符合出泡体大小要求且通过细连接丝与之相连的、内含 mCherry 标记物质的 ALM 细胞体出泡体。所有图像均来自该品系 ZB4065 bzIs166[蛋白质印迹法检测细胞裂解物中的目标蛋白]mec-4mCherry 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
对的表征 体内 以大型细胞外囊泡（exopher）形式清除聚集体和细胞器的分子机制研究尚处于起步阶段。关于被排出货物的指定、这些货物在细胞内的极性聚集、生成exopher的决策调控、介导外排过程的分子机器，以及exopher与邻近细胞中降解机制的相互作用等问题，仍有待阐明。此外， 体内 能够传递包括钙离子、聚集体和线粒体在内的生物物质的管状连接结构的可视化，其本身即为一个引人入胜且尚未得到充分研究的生物学现象。为何某些细胞比其他细胞更容易产生外泌体样结构（exopher）的问题目前仍未解决，但可通过本实验方案中所述的方法从遗传学角度逐步开展研究。
本方案详细描述了实现可重复的外泌体（exopher）产生评分的方法，重点关注如何区分外泌体与邻近细胞的胞体、选择适当的分析时间以捕捉外泌体产生的高峰期，以及严格控制培养条件以消除可能影响外泌体水平的非预期应激因素。可通过量化早期出现的大型外泌体，或周围表皮组织中“星夜”样弥散结构的存在，作为外泌体产生的证据。通常情况下，在基础条件下表达mCherry的神经元中，特定类型神经元产生外泌体的比例为5-25%。通过可控地引入应激条件，可显著提高外泌体的产生率，使高达90%的神经元产生外突结构，这一策略特别适用于筛选调控外泌体形成的遗传或药物因子。
在人类神经退行性疾病中，大分子聚集体可从病变神经元转移至邻近细胞，从而促进病理学改变的扩散。外排囊泡（exopher）机制可能通过一种在不同物种间保守的聚集体外排机制发挥作用。阐明该机制 体内 能够增强该过程效率（即更有效的蛋白质稳态调控）或阻断该过程的分子，可被用于指导设计新型策略，以应对多种神经退行性疾病。因此，本文所述方案可用于经典的遗传诱变筛选、全基因组范围的RNAi筛选（通过系统性敲低基因以鉴定增强因子和抑制因子），或用于药物干预研究，以鉴定该过程的候选药理学调控分子。该方法原理简单，但操作较为繁琐。外泌体体积较大，可直接使用高倍解剖显微镜进行观察。然而， 秀丽隐杆线虫 神经元相对较小，观察其细胞器或细胞膜需要高倍率的共聚焦图像，这一过程较为缓慢。提高通量的可选方案包括采用多孔板格式的高内涵成像方法。
采用标准化方法对出泡体进行评分，应作为系统性遗传学解析神经元如何组织并清除细胞碎片这一过程的基础。
致谢
我们感谢以下 NIH 基金项目：R01AG047101 和 R37AG56510。 Driscoll 实验室和 Grant 实验室的成员为所述实验方案的开发与精细优化做出了广泛贡献，开展了严谨的实验并保持了密切的沟通。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 95B 科学级 CMOS 相机 | Photometrics Prime | ||
| 1,000 μL 低吸附吸头 | Sarstedt | ||
| 10 mL 血清移液管 | Appleton Woods | CC214 | |
| 10 μL 低吸附吸头 | Sarstedt | 70.1130.105 | |
| 13% 次氯酸钠 | Acros Organics | AC219255000 | |
| 15 mL 离心管 | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| 2 L 锥形瓶 | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
| 25 mL 血清移液管 | Appleton Woods | CC216 | |
| 300 μL 低吸附吸头 | Sarstedt | 70.765.105 | |
| 50 mL 血清移液管 | Appleton Woods | CC117 | |
| 5-氟-2'-脱氧尿苷 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
| 9 cm 无菌培养皿 | Fisher Scientific | 11309283 | |
| 无水乙醇 | Vwr | 20821.33 | |
| 琼脂 | Sigma Aldrich | A1296 | |
| C. elegans 野生型菌株 | 由 CGC 提供 | N2 | C. elegans 菌株 |
| 二水合氯化钙 | Sigma Aldrich | C3881 | |
| 胆固醇 | Acros | 110190250 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma Aldrich | S3264 | |
| E. coli OP50 菌株 | 由 CGC 提供 | Op50 | E. coli 菌株 |
| FBS10 标准显微镜 | Meyer Instruments | KSC 410-1-100-1 | FBS10 标准型，带培养皿底座、100/100 三目镜筒和翻转变焦功能 |
| 270 mm 玻璃移液管 | Fisherbrand | FB50255 | |
| Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher Scientific | 75004515 | |
| 接种环 | Fisher Scientific | 11821741 | |
| LB 培养基胶囊 | MP Biomedicals | 3002-031 | |
| LDI – 激光二极管照明器 | 89 North | ||
| 左旋咪唑 | Sigma Aldrich | 16595-80-5 | |
| M4 多通道移液器 | Eppendorf | 4982000012 | |
| 硫酸镁 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma Aldrich | P0662 | |
| Multitron Standard 摇床培养箱 | Infors HT | INFO28573 | |
| Nalgene 1 L 离心瓶 | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
| P10 移液器 | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
| P1000 移液器 | Eppendorf Research Plus | ||
| P200 移液器 | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
| pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
| 聚苯乙烯微珠 | Sigma Aldrich | MFCD00131491 | |
| RC5C plus 落地式离心机 | Sorvall | 9900884 | |
| 可重复使用带环细胞学载玻片 | ThermoFisher Scientific | 22037242 | |
| SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] | Driscoll 实验室定制 | 在触觉神经元中表达 GFP | |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | 13422 | |
| 氢氧化钠 | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
| Tactrol 2 自动灭菌器 | Priorclave | ||
| 吐温-X | Thermofisher Scientific | 28313 | |
| 吐温 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| X-Light V2 转盘共聚焦成像系统 | CrestOptics | ||
| ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] | Driscoll 实验室定制 | 在触觉神经元中表达 mCherry | |
| ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] | Driscoll 实验室定制 | 在触觉神经元中表达 Q128 | |
| ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] | Driscoll 实验室定制 | 在触觉神经元中表达 mitoROGFP | |
| ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] | Driscoll 实验室定制 | 在触觉神经元中表达自噬标志物 | |
| ZEISS Axio Vert.A1 | Zeiss |
参考文献
- Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).
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