激光显微切割技术在揭示人类肾组织区域转录组学中的应用

摘要

我们描述了一种用于激光显微切割人肾亚节段（包括肾小球、近端小管、粗升支、集合管和间质）的实验方案。随后从获得的肾区室中提取RNA，并进行RNA测序，以确定各亚节段内转录组特征的变化。

摘要

人类肾脏组织的基因表达分析是理解机体稳态及疾病病理生理机制的重要工具。提高该技术的分辨率和深度，并将其扩展至组织内单个细胞水平，具有重要意义。尽管单细胞核和单细胞RNA测序技术已广泛应用，但通过组织解离获得的细胞其表达特征无法保留空间定位信息。基于特异性荧光标记的激光显微切割（LMD）技术可实现对具有明确空间位置的特定结构或目标细胞群的分离，从而获得具有空间定位的肾脏组织转录组特征。我们优化了一种基于快速荧光染色引导的LMD方法，用于从珍贵的人类肾脏组织样本中分离出五个不同的肾组织区室，并进行后续RNA测序。同时，我们提供了质量控制参数，以评估所采集样本的充分性。本文所述工作流程证明了该方法能够高可信度地获取肾组织亚区段的转录组特征。本文所提出的方法学策略也可推广至其他组织类型，仅需替换相应的特异性抗体标记即可。

引言

研究组织标本的技术进步加深了人们对多种器官健康与疾病状态的理解。这些进展凸显出，病理变化可能起始于局部区域或特定细胞类型，但却会对整个器官产生重要影响。因此，在当前个体化医疗的时代，理解细胞水平和区域水平的生物学特性至关重要，而不仅限于整体层面¹。这一点在肾脏中尤为突出，因为肾脏由多种特化的细胞和结构组成，这些细胞和结构在病理应激的启动和/或响应方面具有差异性。目前，多种人类肾脏疾病的发生机制仍不完全清楚。建立一种用于研究人类肾脏中特定肾小管节段、结构或间质区域基因表达变化的方法，将有助于揭示与疾病发生机制相关的区域性特异性改变。

人类肾脏活检标本是一种有限且珍贵的资源。因此，应优化用于研究肾脏组织转录组学的技术，以节约使用组织。目前可用于在细胞和区域水平研究转录组学的方法包括单细胞RNA测序（scRNaseq）、单核RNA测序（snRNaseq）、原位空间杂交以及激光显微切割（LMD）。其中，LMD特别适用于从组织切片中精确分离特定的区域或结构，用于后续的RNA测序与分析^2,3,4,5。LMD可结合基于荧光成像的方法，在解剖过程中利用已验证的标志物识别特定的细胞类型或结构。....

方案

该研究已获得印第安纳大学机构审查委员会（IRB）的使用批准。

注意：本方案适用于保存在最佳切割温度（OCT）包埋剂中并在 -80 °C 下储存的肾脏切除组织（X 和 Y 方向尺寸均不超过 2 cm）。所有操作均应避免 RNA 污染，使用洁净的一次性手套和口罩，并确保所有工作表面清洁。本方案所优化的设备为配备脉冲紫外激光的激光显微切割系统。

1. 冷冻切片

1. 在冷冻切片前立即用紫外线（在组织培养超净工作台中）照射1.2 µm LMD PPS膜（聚对苯硫醚）载玻片30分钟。将载玻片于室温下保存，以获得最佳组织黏附效果。
2. 将冷冻切片机冷却至-20 °C。清洁工作表面，并安装新的切割刀片。
3. 将一个小型载玻片盒（用RNase表面去污染溶液清洗过）放入冷冻切片机腔室内，用于存放带有新鲜切片组织的载玻片。
4. 将包埋于OCT中的样本固定在组织夹持器上，并静置数分钟，使其温度与腔室平衡，增强OCT包埋块与夹持器之间的黏附性。可使用散热器辅助此过程。
5. 将样本切成12 µm厚度，并使用载玻片适配器将其贴附于专用LMD载玻片上。每张载玻片可承载一个肾切除标本切片，或最多两个肾活检标本切片。将载玻片与干燥剂 cartridge 一同置于密封塑料袋内，并于-80 °C保存，以防止载玻片盒内积聚过多湿气。
6. 在每张载玻片上标注样本编号....

结果

样品

我们展示了来自九例参考性肾切除术的数据（其中3例标本来自印第安纳大学，6例来自肾脏精准医学项目），采用快速荧光染色方案分离肾脏肾单位节段和间质区域。该过程中所用的组织切片来自已故肾脏捐献者或无肿瘤侵犯的肾切除术标本。这些样本未见病理学上的疾病证据，这一点在相邻切片的苏木精-伊红染色（H&E染色）中得到证实（图1A）。

激光显微切割质量控制

通过特异性肾小管标志物的抗体染色，以及形态学和结构特征，可实现对肾脏内肾小管亚段的鉴定。图1B-C 展示了从一个代表性肾切除标本中进行肾小管亚段染色与显微解剖的过程。该过程通过DAPI（细胞核）、FITC-鬼笔环肽（F-actin）染色，并根据需要添加其他特异性抗体来完成。所采用的荧光染色方法能够高度可靠.......

讨论

基于激光显微切割（LMD）的转录组学是一种有用的技术，可将基因表达定位到组织内的特定区域。该技术的基础及其在肾脏中的潜在应用此前已有描述⁸。然而，针对下游RNA测序所需的高精度切割，基于荧光的显微切割技术在优化、现代化和流程简化方面仍不够普及。由于该方法在组织中具有明确的空间定位基础，因此有望揭示组织结构中以往未被发现或被低估的标志物，尤其是在疾病状态下。事实上，许多常见的细胞标志物在疾病过程中可能发生改变，因此在疾病状态下，若仅依赖细胞RNA表达标志物进行细胞身份判定，而缺乏空间背景信息，可能会面临挑战。因此，具有空间定位优势的LMD技术有望作为补充手段，为单细胞和单核RNA测序等其他转录组学技术提供真实可靠的数据平台，后者主要依据基因表达谱来定义细胞类型⁹。此外，LMD所提供的基因表达深度（每样本最多可达20,000个基因）是另一项优势，也为整合来自不同来源的数据提供了重要途径，有助于识别在缺乏足够测序深度时可能被忽略的基因表达变化。该技术在组织利用效率方面的考量也是一大优点：从一个冷冻组织块中仅需不到100 µm的总厚度即可完成整个LM.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Sigma-Aldrich	270725-1L
AMPure 磁珠	Beckman Coulter	A63880
生物分析仪	Agilent	2100
牛血清白蛋白（BSA）	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
干燥剂盒	Bel-Art	F42046-0000
DNase	Qiagen	79254	包装中包含 RDD 缓冲液
激光显微切割显微镜	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 抗体	Abcam	ab76969	直接偶联 Alexa Fluor 568
微量离心管	ThermoFisher	AB-0350
显微镜相机	Leica	DFC700T
PBS（无 RNA 酶）	VWR	K812-500ML
鬼笔环肽（Oregon Green 488）	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA 提取试剂盒	Applied Biosystems	KIT0204
PPS 膜切片	Leica	11505268
qPCR 人总 RNA 参考品 25 µg	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote 总 RNA Pico 芯片	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNase 抑制剂	ThermoFisher	AM2696
测序仪（HiSeq 或 NovaSeq）	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech	634411
Tamm-Horsfall 蛋白抗体	R&D Systems	AF5144	直接偶联 Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. 包埋剂	Sakura	4583