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方法文章

激光显微切割技术在揭示人类肾组织区域转录组学中的应用

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DOI：

10.3791/61371

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2020年6月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , For The Kidney Precision Medicine Project
1Department of Medicine, Indiana University School of Medicine, 2Department of Cellular & Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine, 3Division of Nephrology, Department of Medicine, Ohio State University Wexner Medical Center, 4Division of Pathology, Indiana University School of Medicine

本文内容

摘要

我们描述了一种用于激光显微切割人肾亚节段（包括肾小球、近端小管、粗升支、集合管和间质）的实验方案。随后从获得的肾区室中提取RNA，并进行RNA测序，以确定各亚节段内转录组特征的变化。

摘要

人类肾脏组织的基因表达分析是理解机体稳态及疾病病理生理机制的重要工具。提高该技术的分辨率和深度，并将其扩展至组织内单个细胞水平，具有重要意义。尽管单细胞核和单细胞RNA测序技术已广泛应用，但通过组织解离获得的细胞其表达特征无法保留空间定位信息。基于特异性荧光标记的激光显微切割（LMD）技术可实现对具有明确空间位置的特定结构或目标细胞群的分离，从而获得具有空间定位的肾脏组织转录组特征。我们优化了一种基于快速荧光染色引导的LMD方法，用于从珍贵的人类肾脏组织样本中分离出五个不同的肾组织区室，并进行后续RNA测序。同时，我们提供了质量控制参数，以评估所采集样本的充分性。本文所述工作流程证明了该方法能够高可信度地获取肾组织亚区段的转录组特征。本文所提出的方法学策略也可推广至其他组织类型，仅需替换相应的特异性抗体标记即可。

引言

研究组织标本的技术进步加深了人们对多种器官健康与疾病状态的理解。这些进展凸显出，病理变化可能起始于局部区域或特定细胞类型，但却会对整个器官产生重要影响。因此，在当前个体化医疗的时代，理解细胞水平和区域水平的生物学特性至关重要，而不仅限于整体层面1。这一点在肾脏中尤为突出，因为肾脏由多种特化的细胞和结构组成，这些细胞和结构在病理应激的启动和/或响应方面具有差异性。目前，多种人类肾脏疾病的发生机制仍不完全清楚。建立一种用于研究人类肾脏中特定肾小管节段、结构或间质区域基因表达变化的方法，将有助于揭示与疾病发生机制相关的区域性特异性改变。

人类肾脏活检标本是一种有限且珍贵的资源。因此，应优化用于研究肾脏组织转录组学的技术，以节约使用组织。目前可用于在细胞和区域水平研究转录组学的方法包括单细胞RNA测序（scRNaseq）、单核RNA测序（snRNaseq）、原位空间杂交以及激光显微切割（LMD）。其中，LMD特别适用于从组织切片中精确分离特定的区域或结构，用于后续的RNA测序与分析2,3,4,5。LMD可结合基于荧光成像的方法，在解剖过程中利用已验证的标志物识别特定的细胞类型或结构。

激光显微切割辅助区域转录组学的独特特征包括：1）保留细胞和结构的空间背景，这与单细胞技术形成互补，后者通过基因表达而非组织学特征来识别细胞；2）该技术与其他成像技术相互支持、相互补充，因为抗体标记物可定义表达特征；3）即使在疾病状态下标记物发生变化时，仍能识别特定结构；4）可在约20,000个基因中检测低水平表达的转录本；以及5）显著的组织利用效率。该技术可应用于肾活检，仅需厚度小于100 µm的组织芯即可获得足够的RNA，并可利用存档的冷冻组织，这类样本在大型样本库或学术中心中通常广泛可得6。

在接下来的工作中，我们详细描述了区域性和整体转录组学技术，并采用了一种新型的快速荧光染色方案对人肾组织进行优化。该方法相较于传统的激光显微切割探索具有优势，能够分别获得肾间质和肾单位亚节段的表达数据，而非整体肾小管间质的汇总表达数据。文中还包括为确保研究严谨性和可重复性而实施的质量保证与质量控制措施。该方案可实现对细胞和目标区域的可视化，从而能够从这些分离区域满意地获取RNA，用于后续的RNA测序。

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方案

该研究已获得印第安纳大学机构审查委员会（IRB）的使用批准。

注意：本方案适用于保存在最佳切割温度（OCT）包埋剂中并在 -80 °C 下储存的肾脏切除组织（X 和 Y 方向尺寸均不超过 2 cm）。所有操作均应避免 RNA 污染，使用洁净的一次性手套和口罩，并确保所有工作表面清洁。本方案所优化的设备为配备脉冲紫外激光的激光显微切割系统。

1. 冷冻切片

  1. 在冷冻切片前立即用紫外线（在组织培养超净工作台中）照射1.2 µm LMD PPS膜（聚对苯硫醚）载玻片30分钟。将载玻片于室温下保存，以获得最佳组织黏附效果。
  2. 将冷冻切片机冷却至-20 °C。清洁工作表面，并安装新的切割刀片。
  3. 将一个小型载玻片盒（用RNase表面去污染溶液清洗过）放入冷冻切片机腔室内，用于存放带有新鲜切片组织的载玻片。
  4. 将包埋于OCT中的样本固定在组织夹持器上，并静置数分钟，使其温度与腔室平衡，增强OCT包埋块与夹持器之间的黏附性。可使用散热器辅助此过程。
  5. 将样本切成12 µm厚度，并使用载玻片适配器将其贴附于专用LMD载玻片上。每张载玻片可承载一个肾切除标本切片，或最多两个肾活检标本切片。将载玻片与干燥剂 cartridge 一同置于密封塑料袋内，并于-80 °C保存，以防止载玻片盒内积聚过多湿气。
  6. 在每张载玻片上标注样本编号、日期和载玻片序号。
  7. 自初次冷冻切片之日起，应在10天内使用带有样本的载玻片。

2. 激光显微切割

  1. 染色前立即在无RNase的PBS中含10% BSA的溶液中配制抗体混合液（Ab-Mix），加入以下成分：4 µL FITC-鬼笔环肽、1.5 µL DAPI、2 µL 直接偶联Alexa Fluor 546的Tamm-Horsfall蛋白（THP）抗体、3.3 µL RNase抑制剂，以及89.2 µL含10% BSA的无RNase PBS（最终体积为100 µL）。
    注：可使用其他抗体替代THP抗体。例如，可用2 µL直接偶联Alexa Fluor 568的megalin/LRP2抗体标记近端小管。Ab-Mix中包含LRP2或THP抗体之一（分别用于可视化近端小管或髓袢升支粗段）。其他抗体可根据用户需求进行验证。
  2. 将载玻片在冰冻（-20 °C）100%丙酮中清洗1分钟，然后转移至湿盒中。
  3. 用无RNase的PBS清洗载玻片表面30秒，重复一次。
  4. 用含10% BSA的无RNase PBS清洗载玻片表面30秒，重复一次。
  5. 加入Ab-Mix孵育5分钟。
  6. 用含10% BSA的无RNase PBS清洗载玻片表面30秒，重复一次。
  7. 将载玻片在空气中干燥5分钟，然后装载到激光显微切割切割平台。
  8. 安装适用于PCR实验的收集管（经高压灭菌的0.5 mL微量离心管），每管中预先加入RNA提取试剂盒提供的50 µL提取缓冲液。
  9. 进行激光显微切割（LMD）。每次LMD操作应在最多2小时内完成。
    1. 使用显微镜相机获取LMD前和LMD后的免疫荧光图像，以验证操作者间差异，并用于归档、培训及对实验方案执行质量的评估。为获得0.5 – 1 ng的RNA，至少需要收集500,000 µm2的面积。通常需要使用多达8张厚度为12 µm的切片，才能获得足够量的材料用于所有目标亚段的分析。
    2. 根据染色特征、形态学及位置识别目标区域，并使用高于40的激光功率进行切割。
      注：以下是切割判定标准。近端小管由FITC-鬼笔环肽和LRP2标记界定；髓袢升支粗段由THP标记界定；集合管由细胞核形态（DAPI）及其他染色缺失界定；肾小球由FITC-鬼笔环肽染色和形态学特征界定；间质定义为染色小管之间的区域。
  10. 通过将两张12 µm厚的切片贴附于LMD载玻片上，并将整张切片切割后收集至提取缓冲液中，获得整体横断面的表达谱。
  11. LMD过程完成后，盖上收集用微量离心管的管盖，并用力甩动，确保管壁和管盖上的液体全部移至管底。
  12. 以3,000 x g离心30秒。
  13. 将管子置于42 °C水浴中孵育30分钟。
  14. 以3,000 x g离心2分钟。
  15. 将上清液转移至新的0.5 mL离心管中，并保存于-80 °C。

3. RNA 提取

注意：本RNA提取方案改编自一种商业RNA提取试剂盒的说明书。已对该试剂盒生产商提供的方案进行了修改，以满足本项目的质量控制要求。

  1. 向每个RNA纯化柱（PC）中加入250 µL条件化缓冲液（CB），在室温下孵育5分钟。
  2. 将所有PC在16,000 × g下离心1分钟。
  3. 向含有组织样本的管中加入50 µL 70%乙醇（试剂盒中提供），通过反复吹吸充分混匀样本。切勿涡旋震荡。切勿离心。
  4. 将混合物转移至已条件化的PC中，在100 × g下离心2分钟（以结合RNA），随后立即在16,000 × g下快速离心30秒（去除流穿液）。若某一特定亚段有多个含组织样本的管，则重复此步骤。
  5. 向PC中加入100 µL洗涤缓冲液1（WB1），在8,000 × g下离心1分钟。
  6. 为每个样本配制40 µL DNase溶液（将5 µL DNase加入35 µL RDD缓冲液中），然后直接将40 µL该混合液加至PC的膜上，在室温下孵育15分钟。
  7. 在PC的膜上加入40 µL WB1，并在8,000 × g下离心15秒。
  8. 在PC的膜上加入100 µL洗涤缓冲液2（WB2），并在8,000 × g下离心1分钟。
  9. 在PC的膜上加入100 µL WB2，在16,000 × g下离心2分钟，随后立即在16,000 × g下再次离心1分钟。
  10. 将PC转移至新的0.5 mL离心管中。
  11. 在膜上加入12 µL洗脱缓冲液（EB），室温孵育7分钟。因此，每个亚段所有合并的显微解剖组织样本最终体积为12 µL。
  12. 将样本在1,000 × g下离心1分钟，随后在16,000 × g下离心2分钟。
  13. 取2 µL转移至新管中用于Bioanalyzer分析（以避免冻融循环）。
  14. 将所有管置于-80 °C保存，直至进行后续处理。

4. RNA测序

  1. 使用商业化的生物分析仪和专用于检测微量 RNA 的芯片，对每个拟进行测序的样本进行质量评估。
  2. 在文库构建和测序前，必须满足以下质量控制（QC）参数：总样本 RNA 量需大于 4 ng，各亚区段样本 RNA 量需大于 0.5 – 1 ng；激光显微切割（LMD）样本的转录本中长度超过 200 个核苷酸的比例（DV200）应大于 25%（理想情况下 > 75%）。
  3. 采用专为微量且降解 RNA 设计的商业化 cDNA 文库构建试剂盒进行文库制备。对于补充材料中列出的商业化试剂盒，建议使用选项 2，该选项要求最低 DV200 为 25%，且无需片段化。某些测序技术可能要求更高的最低 DV200 阈值，例如 30%7。
  4. 添加 cDNA 接头和索引（indexes）。
  5. 利用磁珠技术纯化 RNA 测序文库。
  6. 在 RNA 测序文库扩增步骤之前，使用商业化的 rRNA 去除试剂盒去除核糖体 cDNA。
  7. 使用磁珠技术对最终的 RNA 测序文库进行纯化，cDNA 文库终浓度为 2 ng/µL。
  8. 在商业化测序系统上对样本进行 75 bp 双端测序，总样本测序深度为每样本 3000 万条读段，亚区段样本为每样本 1 亿条读段。
  9. 每次测序运行均需加入参考 RNA（25 µg），以控制批次效应。本研究中参考 RNA 的初始浓度为 1 µg/µL，测序时使用的终浓度为 25 ng/µL。参考 RNA 应作为独立样本进行文库构建，并在每次运行中与所有 LMD 样本一同测序。
  10. 使用 FastQC 软件进行数据分析，以评估测序质量、基因间区和线粒体来源的读段，并确定归属于特定基因的读段。
  11. 使用 Integrative Genomics Viewer（IGV）进行序列比对，使用 edgeR/rbamtools 进行转录本表达量分析。
  12. 剔除读段数少于 100,000 的样本。在根据用户自定义阈值过滤低表达基因后，对数据集中的原始读段进行分位数标准化。
  13. 将目标亚区段的基因表达量表示为该亚区段相对于其他所有亚区段平均表达量的比值，并进行 log2 转换。同一基因在不同亚区段和样本间的相对表达量可进行比较；但由于不同基因和 RNA 种类间可能存在降解程度差异，不建议直接比较两个不同基因之间的相对表达量。
  14. 进行富集分析，以比较各肾单位亚区段特异性标志基因集的表达情况，同时在不同批次间比较参考 RNA 样本。若批次效应在平均表达量的 1 个标准差范围内，且 R 值 > 0.9，则认为可接受；若批次效应更高，则需进行额外的标准化处理。任何偏离可接受范围的测序运行均应标记。每次测序运行的 Q30 值应大于 >90%。

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结果

样品

我们展示了来自九例参考性肾切除术的数据（其中3例标本来自印第安纳大学，6例来自肾脏精准医学项目），采用快速荧光染色方案分离肾脏肾单位节段和间质区域。该过程中所用的组织切片来自已故肾脏捐献者或无肿瘤侵犯的肾切除术标本。这些样本未见病理学上的疾病证据，这一点在相邻切片的苏木精-伊红染色（H&E染色）中得到证实（图1A）。

激光显微切割质量控制

通过特异性肾小管标志物的抗体染色，以及形态学和结构特征，可实现对肾脏内肾小管亚段的鉴定。图1B-C 展示了从一个代表性肾切除标本中进行肾小管亚段染色与显微解剖的过程。该过程通过DAPI（细胞核）、FITC-鬼笔环肽（F-actin）染色，并根据需要添加其他特异性抗体来完成。所采用的荧光染色方法能够高度可靠...

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讨论

基于激光显微切割（LMD）的转录组学是一种有用的技术，可将基因表达定位到组织内的特定区域。该技术的基础及其在肾脏中的潜在应用此前已有描述8。然而，针对下游RNA测序所需的高精度切割，基于荧光的显微切割技术在优化、现代化和流程简化方面仍不够普及。由于该方法在组织中具有明确的空间定位基础，因此有望揭示组织结构中以往未被发现或被低估的标志物，尤其是在疾病状态下。事实上，许多常见的细胞标志物在疾病过程中可能发生改变，因此在疾病状态下，若仅依赖细胞RNA表达标志物进行细胞身份判定，而缺乏空间背景信息，可能会面临挑战。因此，具有空间定位优势的LMD技术有望作为补充手段，为单细胞和单核RNA测序等其他转录组学技术提供真实可靠的数据平台，后者主要依据基因表达谱来定义细胞类型9。此外，LMD所提供的基因表达深度（每样本最多可达20,000个基因）是另一项优势，也为整合来自不同来源的数据提供了重要途径，有助于识别在缺乏足够测序深度时可能被忽略的基因表达变化。该技术在组织利用效率方面的考量也是一大优点：从一个冷冻组织块中仅需不到100 µm的总厚度即可完成整个LM...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

一般说明： 作者谨向肾脏精准医学项目（www.kpmp.org）的研究人员致以诚挚的感谢，感谢他们提供的大力支持与宝贵建议。

资助：本工作的支持来自美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（NIH/NIDDK）K08DK107864（M.T.E.）；NIH/NIDDK UG3DK114923（T.M.E.，P.C.D.）；R01DK099345（T.A.S.）。本手稿中报告的研究由国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）肾脏精准医学项目（KPMP）（www.kpmp.org）资助，资助编号为U2CDK114886。

数据和材料可用性： 数据已存档于基因表达综合数据库（GEO编号待定）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮Sigma-Aldrich270725-1L
AMPure 磁珠Beckman CoulterA63880
生物分析仪Agilent2100
牛血清白蛋白（BSA）VWR0332-100G
DAPIThermoFisher62248
干燥剂盒Bel-ArtF42046-0000
DNaseQiagen79254包装中包含 RDD 缓冲液
激光显微切割显微镜LeicaLMD6500
Megalin/LRP2 抗体Abcamab76969直接偶联 Alexa Fluor 568
微量离心管ThermoFisherAB-0350
显微镜相机LeicaDFC700T
PBS（无 RNA 酶）VWRK812-500ML
鬼笔环肽（Oregon Green 488）ThermoFisherO7466
PicoPure RNA 提取试剂盒Applied BiosystemsKIT0204
PPS 膜切片Leica11505268
qPCR 人总 RNA 参考品 25 µgTakara Clontech636690
RNA 6000 Eukaryote 总 RNA Pico 芯片Agilent5067-1513
RNAse AwayThermoFisher7000
RNase 抑制剂ThermoFisherAM2696
测序仪（HiSeq 或 NovaSeq）IlluminaNA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2Takara Clontech634411
Tamm-Horsfall 蛋白抗体R&D SystemsAF5144直接偶联 Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. 包埋剂Sakura4583

参考文献

  1. El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
  2. Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
  3. Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
  4. Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
  5. Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
  6. Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).
  7. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016).
  8. Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
  9. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832(2019).
  10. Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
  11. Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45(2018).

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