应用激光微分射发现人体肾脏组织中的区域转录学

Summary

我们描述了人类肾脏的子段的激光微分射方案，包括球状、近肌管、厚升肢、收集管道和间质。然后从获得的隔间中分离RNA，进行RNA测序，以确定每个子段内转录签名的变化。

Abstract

人体肾脏组织的基因表达分析是了解平衡和疾病病理生理学的重要工具。需要提高这项技术的分辨率和深度，并将其扩展到组织内的细胞水平。虽然单核和单细胞RNA测序的使用已变得普遍，但从组织分离中获得的细胞的表达特征并不维持空间背景。基于特定荧光标记的激光微散射 （LMD） 将允许在已知本地化下分离特定结构和感兴趣的细胞组，从而能够在肾脏组织中获取空间锚定转录特征。我们优化了LMD方法，以快速荧光染色为指导，分离出人类肾脏内的五个不同的隔间，并从有价值的人类肾脏组织标本进行后续RNA测序。我们还提供质量控制参数，以便评估所收集标本的充分性。本手稿中概述的工作流程显示了这种方法的可行性，即高度自信地分离子段转录签名。此处介绍的方法也可用于替代相关抗体标记的其他组织类型。

Introduction

研究组织标本的技术进步增进了对各种器官健康状况和疾病状况的了解。这些进展突出表明，病理学可以在有限的区域或特定的细胞类型开始，但对整个器官有重要影响。因此，在当今的个性化医学时代，了解细胞和区域层面的生物学非常重要，而不仅是全球^的生物学。这在肾脏中尤为明显，它由各种专门的细胞和结构组成，这些细胞和结构对病理应激有微分的启动和/或反应。各类人类肾脏疾病的发病机理仍不为人所知。生成一种方法来研究人类肾脏间质的特定管状部分、结构或区域的基因表达变化，将增强发现区域特定变化的能力，这些变化可能告知疾病的发病机制。

人类肾脏活检标本是一种有限而宝贵的资源。因此，应优化肾组织转录经济学的技术，以节约组织。在细胞和区域一级研究转录学的现有方法包括单细胞RNA测序（scRNaseq）、单核RNAseq（snRNaseq）、原位空间杂交和激光微分（LMD）。后者非常适合精确隔离组织部位内感兴趣的区域或结构，用于下游RNA测序和分析^{2、3、4、5。}LMD 可在解剖过程中使用荧光成像，依靠基于验证标记的特定细胞类型或结构进行识别。

激光微分解剖辅助区域转录学的独特特征包括:1） 保存细胞和结构的空间背景，补充单细胞技术，即通过表达而不是组织学识别细胞:2） 该技术因抗体标记定义表达特征而通知并受到其他成像技术的通知:3） 即使在疾病标记发生变化时识别结构的能力:4） 在大约20，000个基因中检测低表达的记录:和5）显着的组织经济性。该技术可扩展至肾脏活检，其核心厚度小于 100μm，是获取足够的RNA所必需的，并且能够使用存档的冷冻组织，这些组织通常可在大型存储库或学术中心^6.

在随后的工作中，我们详细描述了区域和批量转录经济学技术，并优化了一种新的快速荧光染色方案，用于人体肾脏组织。这种方法改进了经典的LMD探索，因为它为间质和肾上分段提供了单独的表达数据，而不是聚合的管间表达。其中包括为确保严格性和可重复性而实施的质量保证和控制措施。该协议使细胞和感兴趣的区域可视化，从而从这些孤立区域令人满意地获取RNA，从而允许下游RNA测序。

Protocol

这项研究被印第安纳大学机构审查委员会（IRB）批准使用。

注:使用此协议与肾脏肾切除组织（高达2厘米的X和Y尺寸）保存在最佳切割温度（OCT）化合物，并存储在-80°C。 以限制RNA污染的方式执行所有工作，使用干净的一次性手套和面罩。确保所有表面的清洁。优化此协议的设备是具有脉冲紫外激光的激光微发射系统。

1. 冷冻剖射

1. 在低温之前，将 1.2 μm LMD PPS-膜（聚（苯乙烯硫化物）滑入紫外线（在组织培养层流罩中）30 分钟。将幻灯片存储在室温下，以获得最佳的组织粘性。
2. 将低温静电冷却至-20°C。 清洁工作表面并安装新的切割刀片。
3. 将一个小滑动盒（用 RNase 表面净化溶液清洗）放在冷冻机房内，用新鲜切割的组织存储幻灯片。
4. 将 OCT 中的标本粘附在组织支架上，并允许其平衡几分钟，以达到室温，并加强 OCT 块与持有人之间的粘附。使用热提取器帮助该过程。
5. 将标本切成 12μm 的厚度，并使用滑动适配器将其贴在专用 LMD 幻灯片上。每张幻灯片每张幻灯片可容纳一个肾切除部分，或每张幻灯片最多可容纳两个肾脏活检部分。将滑梯存放在 -80 °C 下，并配有干燥盒，并存放在紧闭的塑料袋内，以防止滑动盒内积聚多余的水分。
6. 用标本 ID、日期和幻灯片编号标记每个幻灯片。
7. 在冷冻分离初始日期的 10 天内将幻灯片与标本一起使用。

2. 激光微分

1. 染色前立即在无 RNase PBS 中准备 10% BSA 中的抗体混合 （Ab-Mix），添加以下信息:FITC-Phalloidin 的 4μL， 1.5 μL 的 DAPI、2 μL 的 Tamm-Horsfall 蛋白 （THP） 抗体直接与亚历克萨氟 546、3.3 μL 的 Rnase 抑制剂和 89.2 μL 的 10% BSA 在 PBS 中（达到 100μL 的体积）。
   注:替代抗体可用于代替THP抗体。例如，2 μL 的兆林/LRP2 抗体，直接与 Alexa Fluor 568 结合，可用于标记近焦管。Ab-Mix 包含 LRP2 或 THP 抗体（分别可视化近体管或粗升肢）。其他抗体可根据用户需求进行验证。
2. 在冰冷（-20°C）100%丙酮中清洗滑梯1分钟，并将其移动到湿度室。
3. 用无 Rnase PBS 清洗幻灯片顶部 30 s。 重复。
4. 在无 Rnase Pbs 中用 10% 的 Bsa 清洗幻灯片顶部 30s。 重复。
5. 应用 Ab 混合 5 分钟。
6. 在无 Rnase Pbs 中用 10% 的 Bsa 清洗幻灯片顶部 30s。 重复。
7. 空气干燥滑梯5分钟，并加载到激光微散射切割平台上。
8. 安装适合 PCR 工作的集合管（自动切口 0.5 mL 微中心管），包含 50 μL 的 RNA 隔离套件中的提取缓冲区。
9. 继续进行LMD。在最多 2 小时内完成每个 LMD 会话。
   1. 收集LMD前后免疫荧光图像，使用显微镜摄像头验证解剖的操作间变异性以及档案目的、培训和执行协议的质量评估。为了获得 0.5 – 1 ng 的RNA，至少需要 500，000 μm² 区域。这通常需要使用高达 8 x12 μm 厚的部分，以获得足够数量的材料，供所有感兴趣的子部分使用。
   2. 通过染色、形态和位置来识别感兴趣的区域，并使用大于 40 的激光功率将其除名。
      注:以下是解剖标准。近脉管由 FITC-法洛丁和 LRP2 标签定义。厚升肢由 THP 标记定义。收集管道由核形态 （DAPI） 定义，没有其他污渍。球菌由FITC-法洛丁和形态学定义。间质被定义为染色管之间的区域。
10. 通过将两个 12 μm 部分贴在 LMD 幻灯片上并将整个部分解剖成提取缓冲区，获得批量横截面表达签名。
11. LMD 流程完成后，关闭收集的微中心管并大力轻弹，以确保内容从盖子移动到管子底部
12. 将管子以 3，000 x g 为 30 s 提供离心机。
13. 将管子浸泡在 42 °C 水浴中 30 分钟。
14. 将管子在 3，000 x g 下离心 2 分钟。
15. 将超强元转移到一个新的0.5 mL管，并将其存储在-80°C中。

3.RNA隔离

注:对于此RNA隔离协议，我们已从商用RNA隔离套件中修改了协议。制造商的协议已修改，以满足为该项目设置的质量控制要求。

1. 在每个RNA净化柱 （PC） 中添加 250 μL 的有条件缓冲区 （CB），并在室温下孵育 5 分钟。
2. 离心所有 PC 1 分钟，在 16，000 x g。
3. 将 50 μL 的 70% 乙醇（在 Kit 中提供）加入带组织样本的管子中。通过上下管道将样品混合好。不要漩涡。不要离心。
4. 将混合物在 100 x g（ 绑定 RNA）下将混合物转移到有条件的 PC 和离心机中 2 分钟，在 16，000 x g 下快速跟随离心 30 秒（以消除流经）。重复此步骤，如果超过 1 管组织样本可用于任何给定的子段。
5. 在 8，000 x g时，将 100μL 的洗涤缓冲区 1 （WB1） 添加到 PC 和离心机中 1 分钟。
6. 每个样品准备 40 μL 的 DNase（将 5 μL 的 Dnase 添加到 35μL 的 RDD 缓冲区）。然后直接在PC膜上加入40微升的混合物，并在室温下孵育15分钟。
7. 将 40 μL 的 WB1 添加到 PC 的膜上，在 8，000 x g下将离心机加到 15 s。
8. 在 PC 膜上添加 100 μL 的洗涤缓冲区 2 （WB2），在 8，000 x g下将离心机加 1 分钟。
9. 在PC膜上加入100μL的WB2，离心机2分钟，在16，000 x g，紧接着在16，000 x g下离心1分钟。
10. 将PC转移到一个新的0.5 mL管。
11. 在膜上加入 12 μL 的 Elution 缓冲区 （EB），并在室温下孵育 7 分钟。因此，所有汇集解剖组织样本的最终体积为每子段 12 μL。
12. 将样品在1000 x g 下抽取1分钟，然后在16，000 x g下抽取2分钟。
13. 将 2 μL 转移到用于生物分析器分析的新鲜管中（以防止冻结事件）。
14. 将所有管子存放在-80°C中，直到准备好进一步处理。

4. RNA 测序

1. 使用商用生物分析仪和用于测量少量RNA的芯片评估每个样本的质量，用于测序。
2. 需要在库准备和测序之前遵循质量控制 （QC） 参数:散装 RNA 大于 4 ng，每个子段大于 0.5 - 1 ng:超过 200 核苷酸 （DV200） 的抄本百分比对于 LMD 标本（最佳 =75%）要求大于 25%。
3. 使用商业 cDNA 库准备套件进行图书馆准备，用于少量退化 RNA。对于补充中列出的商业套件，我们建议使用选项 2，这需要至少 DV200 的 25%，并且没有碎裂。某些测序技术可能需要更高的最低 DV200 阈值，例如 30%^7。
4. 添加 cDNA 适配器和索引。
5. 使用磁珠技术净化RNAseq库。
6. 在 RNAseq 库放大步骤之前，使用商用 rRNA 去除套件耗尽核糖体 cDNA。
7. 使用磁珠技术以 2 ng/μL cDNA 库浓度净化最终的 RNAseq 库。
8. 在商业测序系统上执行 75 bp 配对端的 RNA 测序，批量读取/示例为 3000 万次读取/示例，子细分部分执行 1 亿次读取/示例。
9. 使用参考RNA（25微克）与每次测序运行，以允许控制批次效果。我们的参考RNA的初始浓度为1微克/μL，而测序中使用的最终浓度为25 ng/μL。
10. 利用 FastQC 应用程序进行数据分析，以评估测序、间源读取和线粒体读取的质量，并确定归因于基因的读数。
11. 使用集成基因组学查看器 （IGV） 进行对齐和边缘 R/rbamtool 以进行成绩单表达测量。
12. 删除读数少于 100，000 的样本。在筛选出用户定义阈值下表达的低表达基因后，Quantile 使数据集中的原始读数规范化。
13. 将表达式量化为兴趣子细分与所有其他子细分的平均值和 log2 转换的比率。同一基因的相对表达可以比较子段和样本:然而，由于基因和RNA物种之间潜在的退化差异，比较两种不同基因之间的相对表达并不理想。
14. 进行浓缩分析，比较特定于每个肾素子段的一组制造商的基因表达，同时对参考RNA样本进行分批比较。R值>0.9平均表达式1个标准偏差范围内的批量效应被认为是可以接受的。更高的批次效果分数需要额外的规范化。任何偏离接受批次效应的运行都可以标记。每次测序运行的 Q30 应大于 +90%。

Results

样品

我们提供来自9个参考肾切除术（在印第安纳大学获得的3个标本和通过肾脏精密医学项目获得的6个标本）的数据，利用快速荧光染色方案分离肾肾部分和间歇区域。在这个过程中使用的部分是从已故的肾脏捐献者或未受影响的肿瘤肾切除术中获得的。这些样本没有病理学证据，如从邻近部分（图1A）采集的H&E污渍所示。

激光微分质量控制

通过独特的管状标记的抗体染色以及形态和结构地标，可以识别肾脏中的管状子段。 图1B-C 说明了代表性肾切除术管状细分段的染色和微小斑点。这是通过染色与DAPI（核），FITC-法利丁（F-actin），并在必要时额外的抗体来实现的。所使用的荧光染色使人能够高度自信地可视化肾脏子段，进一步以形态特征以及图像结构的空间定位为指导（

Discussion

基于LMD的转录学是一种有用的技术，将基因表达锚定在组织内的特定区域。这项技术的基础及其在肾脏中的潜在应用以前曾被描述过^8。然而，针对下游RNA测序的高精度解剖，荧光解剖的优化、现代化和精简并不普遍。由于这种方法在组织内具有空间基础，因此有可能揭示组织结构中新颖或被低估的标记物，尤其是在疾病状态下。事实上，细胞的许多常见标记可能随疾病而改变，因此，在没有空间背景的情况下，仅依靠细胞RNA表达标记进行身份判断在疾病状态中可能具有挑战性。因此，空间锚定的LMD方法可能会补充和提供一个地面真理平台，许多其他转录技术，如单细胞和单核RNA测序，其中定义细胞主要是由他们的基因表达配置文件^9。此外，LMD 提供的基因表达深度（每个样本最多 20，000 个基因）提供了另一个优势和重要场所，可以交叉链接来自多个来源的数据，并说明基因表达的变化，如果没有一定的深度，这些变化可能并不明显。组织经济性的考虑是该技术的另一个积极特征，即冷冻块的厚度小于 100μm 的厚度可能足以用于整个 LMD 数据集。这允许剩余组织用于其他分析目的。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
丙酮	Sigma-Aldrich	270725-1L
AMPure 珠子	贝克曼库尔特	A63880
生物分析仪	安捷伦	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
干燥剂滤芯	Bel-Art	F42046-0000
DNAse	Qiagen	79254	RDD 缓冲液包含在 Pakage
激光显微切割显微镜	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 抗体	Abcam	ab76969	直接与 Alexa Fluor 568
微量离心管	ThermoFisher	AB-0350
显微镜相机	Leica	DFC700T
PBS （不含 RNAse 的）	VWR	K812-500ML
鬼笔环肽（俄勒冈绿 488）	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA 分离试剂盒	Applied Biosystems	KIT0204
PPS 膜载玻片	Leica	11505268
qPCR 人类参考总 RNA 25 µg	Takara Clontech	636690
RNA 6000 真核生物总 RNA Pico 芯片	安捷伦	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNAse 抑制剂	ThermoFisher	AM2696
测序仪（HiSeq 或 NovaSeq）	Illumina	NA
SMARTer 链式总 RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech
Tamm-Horsfall 蛋白抗体	R&D Systems	AF5144	与 Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. 化合物	Sakura	4583