本文介绍了一种在小鼠脑内局部或全脑范围内瞬时开放血脑屏障（BBB）以递送荧光标记抗体并激活小胶质细胞的实验方案。同时介绍了一种通过组织学方法检测抗体递送效果及小胶质细胞激活状态的技术。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
只有极小部分靶向脑部疾病的治疗性抗体能够被脑组织摄取。聚焦超声提供了一种通过短暂开放血脑屏障（BBB）来提高抗体摄取和作用效率的可能性。在本实验室，我们正在开发针对神经退行性疾病的治疗策略，该策略采用不同形式的抗体，在施用聚焦超声的同时，利用微泡经颅递送抗体穿越血脑屏障，并靶向多个脑区位点，我们将此方法称为扫描式超声（SUS）。微泡与超声对血管产生的机械效应可通过短暂分离紧密连接而增强抗体等物质的旁细胞转运，并促进囊泡介导的跨细胞转运，从而使抗体和治疗剂有效穿过血脑屏障。此外，超声还能促进抗体从脑间质进入脑细胞（如神经元），使抗体分布至整个胞体甚至神经突起中。在我们的研究中，制备荧光标记的抗体，与实验室自制的脂质微泡混合后立即注射入小鼠体内，随后对脑部实施SUS处理。之后定量检测脑内抗体浓度的增加情况。为评估正常脑内稳态可能发生的改变，可将小胶质细胞的吞噬作用作为细胞水平的标志物。所得数据表明，利用超声递送抗体是一种具有前景的治疗神经退行性疾病的方法。
引言
治疗性超声是一种新兴技术，旨在以非侵入性方式治疗脑部疾病，部分作用机制是促进治疗药物进入大脑1,2,3。由于靶向脑部疾病的治疗性抗体仅有极小部分能被大脑摄取并保留4，治疗性超声有望提高这些抗体的摄取率及其与靶点的结合效率5,6。
在我们的实验室中，我们正在开发一种针对神经退行性疾病的治疗策略，该策略通过使用微泡将不同形式的抗体递送穿过血脑屏障（BBB）。为实现这一目标，我们采用一种称为扫描式超声（scanning ultrasound, SUS）的扫描模式，通过颅骨向大脑多个位点施加超声波7。超声能量、静脉注射的微泡与脑血管系统之间的机械相互作用，可暂时性地打开特定声照区域中血脑屏障的紧密连接，从而使抗体及其他治疗性物质等载荷能够有效穿越该屏障7,8,9。此外，已有研究表明，超声还可促进抗体从脑组....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均经昆士兰大学动物伦理委员会批准。
1. 实验室自制微泡的制备
- 称取摩尔比为9:1的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）。每1 mL微泡溶液需要0.5 mg脂质混合物。或者，可直接购买已溶解于氯仿中的脂质；若使用预溶解脂质，则直接进行步骤1.3。
- 将脂质溶解于少量氯仿中，置于玻璃烧杯内。
- 使用旋转蒸发仪或氮气流将氯仿蒸发完全。
- 用10 mL已通过0.22 µm滤膜过滤的PBS + 10%甘油 + 10%丙二醇溶液重新水合干燥的脂质薄膜。
- 将重新水合后的脂质溶液置于设定为55 ˚C（高于脂质相变温度）的水浴超声仪中，超声至完全溶解。
- 将脂质溶液分装至已高压灭菌的1.5 mL HPLC小瓶中，并拧紧带隔垫的瓶盖。
- 使用配有27 G针头的5 mL注射器抽尽小瓶内的空气，使小瓶内形成真空。
- 用配套注射器从小钢瓶中抽取八氟丙烷气体，并注入小瓶中，根据注射器刻度向小瓶内加入1–2 mL八氟丙烷。
- 用石蜡膜密封每个小瓶，并冷藏保存。
- 实验当天，将小瓶恢复至室温，向小瓶中加入0.5 mL 0.9% NaCl溶液，然后将小瓶放入振荡混合器中，振荡45 s（预设时间），以生成微泡。....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
通过本方案，可将荧光标记的抗体递送至脑内，并同时检测小胶质细胞的活化情况。由此可得出结论：聚焦超声联合微泡可显著增强抗体在脑内的摄取，当采用扫描模式时，可实现抗体在整个脑部或小鼠单侧半脑的递送。图1展示了用于开放血脑屏障的TIPS超声应用装置（不同组件已标注）。图2展示了使用库尔特计数器测得的微泡粒径与浓度的代表性结果，该结果应在微泡正确制备后获得。为便于观察递送效果，抗体被标记了远红荧光染料。通过红外扫描仪或对脑组织切片进行荧光显微镜观察，可轻松可视化抗体在全脑或脑切片中的摄取情况。脑组织切片可显示荧光标记抗体在微观层面的定位。在图3中展示了扫描式超声将荧光标记的抗tau抗体RN2N递送至海马体的代表性结果。为观察SUS及抗体递送是否引起正常脑内稳态的改变，其中一个检测指标是小胶质细胞溶酶体含量，以评估其吞噬活性。图4展示了使用Iba1标记小胶质细胞以及使用小胶质细胞溶酶体特异性标志物CD68进行染.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
通过聚焦超声结合以扫描模式施加的微泡，可将荧光标记的抗体递送至大脑。扫描超声处理后，可通过荧光显微镜检测抗体递送情况、小胶质细胞形态以及溶酶体的增大。小胶质细胞可通过Fc受体介导的过程，将其溶酶体摄取抗体以及抗体所结合的抗原4。
使用该方法实现可重复的血脑屏障开放和抗体递送包含多个关键步骤。确保超声换能器与小鼠头部之间具有良好的耦合至关重要。需去除小鼠头部的所有毛发，并确保耦合介质中无气泡存在。自制微泡的特性对实验成功至关重要。微泡浓度必须足够高，达到每毫升108个微泡，且粒径分布应使超过90%的微泡直径小于10 µm。这是因为较大的微泡会被肺部从循环中滤除。可接受的中位粒径范围为1–3 µm。微泡在操作和注射过程中必须轻柔处理，以避免在注射器中被破坏。超声辐照应在注射微泡后不超过2分钟内开始，通过练习可实现这一时间控制。使用SUS方法可轻松实现全脑或整个半球的靶向，当靶向大范围区域时，靶向准确性通常不会成为问题。较小的脑区如海马体或纹状体也可成功靶向，但此时必须确保焦点与目标区域重叠。小鼠脑的高度大致相当于使用.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
感谢Dr Clem Jones AO遗产基金、澳大利亚国家健康与医学研究理事会[GNT1145580，GNT1176326]、Metal基金会以及昆士兰州政府（DSITI，科学、信息技术与创新部）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 | Avanti | 850365C | |
| 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 抗体标记试剂盒 | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 抗体 | AbD Serotec | MCA1957GA | 使用 1:1000 稀释 |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| 库尔特计数器（Multisizer 4e） | |||
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | 使用 1:500 稀释 |
| 山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | 使用 1:500 稀释 |
| 头部固定装置（型号 SG-4N，Narishige 日本） | |||
| Iba1 抗体 | Wako | 019-19741 | 使用 1:1000 稀释 |
| 图像分析软件 | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow 流动液 | Beckman Coulter | B43905 | |
| 近红外成像系统 Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| 八氟丙烷 | Arcadophta | 0229NC | |
| 丙二醇 | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS（治疗成像探针系统） | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
参考文献
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
