使用聚焦扫描超声将抗体输送到大脑中

摘要

这里介绍的是一种方案，用于局部或整个小鼠大脑短暂打开血脑屏障（BBB），以传递荧光标记的抗体并激活小胶质细胞。还提出了一种通过组织学检测抗体递送和小胶质细胞活化的方法。

摘要

只有一小部分针对脑部疾病的治疗性抗体被大脑吸收。聚焦超声提供了通过血脑屏障（BBB）的短暂打开来增加抗体摄取和参与的可能性。在我们的实验室中，我们正在开发神经退行性疾病的治疗方法，其中使用微气泡将各种形式的抗体输送到BBB中，同时通过针对多个点的颅骨进行聚焦超声应用，我们称之为扫描超声（SUS）。微气泡和超声对血管的机械效应通过瞬时分离紧密连接来增加BBB的细胞旁转运，并增强囊泡介导的转运，使抗体和治疗剂能够有效地交叉。此外，超声还有助于将抗体从间质大脑摄取到脑细胞中，例如抗体分布在整个细胞体中的神经元，甚至进入神经炎过程。在我们的研究中，制备荧光标记的抗体，与内部制备的基于脂质的微气泡混合，并在SUS应用于大脑之前立即注射到小鼠中。然后量化大脑中增加的抗体浓度。为了解释正常脑稳态的改变，小胶质细胞吞噬作用可用作细胞标志物。产生的数据表明，抗体的超声递送是治疗神经退行性疾病的一种有吸引力的方法。

引言

治疗性超声是一种新兴技术，旨在以非侵入性方式治疗脑部疾病，部分原因是通过促进治疗剂进入大脑^1，2，3。由于只有一小部分针对脑部疾病的治疗性抗体被大脑吸收并保留在大脑^中4，因此治疗性超声提供了增加其摄取和靶向参与的可能性^5，6。

在我们的实验室中，我们正在开发神经退行性疾病的治疗方法，其中各种形式的抗体使用微气泡通过血脑屏障（BBB）递送。为了实现这一点，超声波通过颅骨施加到大脑的多个位置，使用我们称之为扫描超声波（SUS）⁷的扫描模式。超声能量、静脉注射微气泡和脑脉管系统之间的机械相互作用在给定的超声处理体积中瞬时分离BBB的紧密连接，允许抗体和包括治疗剂在内的其他货物有效地穿过这一屏障^7，8，9.此外，超声已被证明可以促进抗体从间质性大脑摄取到脑细胞中，例如神经元，其中抗体分布在整个细胞体中，甚....

方案

所有动物实验均获得昆士兰大学动物伦理委员会的批准。

1. 内部微气泡制备

1. 称出1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）的摩尔比为9:1。每1mL微泡溶液需要0.5mg脂质混合物。或者，脂质已经以氯仿购买，如果使用预溶解的脂质，则继续进行步骤1.3。
2. 将脂质溶解在玻璃烧杯中的少量氯仿中。
3. 用蒸发器或氮气流蒸发氯仿。
4. 用10 mL PBS + 10%甘油+ 10%丙二醇溶液重新水合干燥的脂质膜，该溶液已通过0.22μm过滤器过滤。
5. 将再水化的脂质溶液置于设置为55°C（高于脂质的熔化温度）的水浴超声仪中，并超声处理直至完全溶解。
6. 等分脂质溶液放入高压灭菌的1.5 mL HPLC小瓶中，并拧在隔膜盖上。
7. 用装有27 G针头的5 mL注射器吸入小瓶中的所有空气，并在小瓶中产生真空。
8. 用随附的注射器将八氟丙烷加入小瓶中，从罐中吸取气体。通过读取注射器中的体积，用1-2mL八氟丙烷填充小瓶。
9. 用石蜡膜密封每个小瓶并冷藏。
10. 在实验当天，将小瓶置于室温，向小瓶中加入0.5mL的0.9%NaCl溶液，然后将小瓶放入混合器中并搅拌45秒（预设时间）以产生微气泡。

结果

使用该协议，荧光标记的抗体被传递到大脑并且可以被检测到，以及小胶质细胞的激活。可以得出的结论是，使用聚焦超声和微气泡显着增强了抗体的大脑摄取，并且在扫描模式下使用时可以将抗体传递到小鼠的整个大脑或半球。 图1 显示了用于打开BBB的TIPS超声应用设备（标记的不同组件）。 图2 显示了库尔特计数器测量的尺寸和浓度的代表性结果，当微气泡正确产生时，应获得这些结果。为了容易地可视化递送，用远红色荧光染料标记抗体。使用红外扫描仪或使用荧光显微镜对大脑切片，可以在整个大脑或切片中轻松可视化大脑的抗体摄取。大脑切片在微观水平上显示荧光标记抗体的位置。扫描超声递送到荧光标记的抗tau抗体RN2N的海马体的代表性结果如图 3所示。为了观察SUS和抗体递送导致正常脑稳态的任何改变，一个读数是与吞噬作用相关的小胶质溶酶体含量。 图4 显示了使用Iba1和小胶质细胞溶酶体特异性标志物CD68对小胶质细胞的代表性染色，以确.......

讨论

荧光标记的抗体可以使用聚焦超声和扫描模式下施加的微气泡一起传递到大脑。抗体递送、小胶质细胞形态和溶酶体肿大可通过超声扫描后的荧光显微镜检测。小胶质细胞可以吸收到其溶酶体抗体和抗原中，抗体在Fc受体介导的过程中结合⁴。

使用这种方法实现可重复的BBB开放和抗体递送有许多关键步骤。确保超声换能器和鼠标头部之间的良好耦合至关重要。去除鼠标头上的所有毛发，并确保接头中没有气泡。内部制备的微气泡的特性是成功的关键。微气泡必须具有¹⁰⁸ 微气泡/mL的足够浓度和尺寸分布，使得超过90%的微气泡直径低于10μm。这是因为已知较大的微气泡会被肺部从循环中过滤掉。可接受的中位数大小在1-3μm之间。微气泡必须轻轻处理和注射，以避免在注射器中破坏它们。重要的是，超声波在注射微气泡后不迟于2分钟，这可以通过实践来实现。使用SUS方法可以轻松实现整个大脑或整个半球的靶向，并且在靶向大区域时，靶向的准确性不太可能成为问题。较小的大脑区域（如海马体或纹状体）也可以成功靶向，但在这种情况下，焦点与目标区域重叠很重要。使用典型的超声换能器，小鼠.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱	Avanti	850365C
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]	Avanti	880128C
AlexaFluor 647抗体标记试剂盒	Thermo Fisher	A20186
CD68抗体	AbD Serotec	MCA1957GA	使用1：1000
稀释氯仿	Sigma-Aldrich	372978
Coulter 计数器 （Multisizer 4e）
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 488	Thermo FIsher	A-11008	使用 1：500 稀释山
羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11077	使用 1：500 稀释
头架（型号 SG-4N，日本 Narishige）
Iba1 抗体	Wako	019-19741	使用 1：1000 稀释
度 图像分析软件	Beckman Coulter	#8547008
Isoflow flow solution	贝克曼库尔特	B43905
近红外成像系统 Odyssey Fc	Licor	2800-03
八氟丙烷	Arcadophta	0229NC
丙二醇	Sigma-Aldrich	P4347
TIPS（治疗成像探针系统）	飞利浦研究	TIPS_007
	位平面