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方法文章

利用聚焦扫描超声将抗体递送至大脑

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DOI：

10.3791/61372

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2020年7月18日

 ,  ,  ,  , 
1Clem Jones Centre for Ageing Dementia Research, Queensland Brain Institute, The University of Queensland

本文内容

摘要

本文介绍了一种在小鼠脑内局部或全脑范围内瞬时开放血脑屏障（BBB）以递送荧光标记抗体并激活小胶质细胞的实验方案。同时介绍了一种通过组织学方法检测抗体递送效果及小胶质细胞激活状态的技术。

摘要

只有极小部分靶向脑部疾病的治疗性抗体能够被脑组织摄取。聚焦超声提供了一种通过短暂开放血脑屏障（BBB）来提高抗体摄取和作用效率的可能性。在本实验室，我们正在开发针对神经退行性疾病的治疗策略，该策略采用不同形式的抗体，在施用聚焦超声的同时，利用微泡经颅递送抗体穿越血脑屏障，并靶向多个脑区位点，我们将此方法称为扫描式超声（SUS）。微泡与超声对血管产生的机械效应可通过短暂分离紧密连接而增强抗体等物质的旁细胞转运，并促进囊泡介导的跨细胞转运，从而使抗体和治疗剂有效穿过血脑屏障。此外，超声还能促进抗体从脑间质进入脑细胞（如神经元），使抗体分布至整个胞体甚至神经突起中。在我们的研究中，制备荧光标记的抗体，与实验室自制的脂质微泡混合后立即注射入小鼠体内，随后对脑部实施SUS处理。之后定量检测脑内抗体浓度的增加情况。为评估正常脑内稳态可能发生的改变，可将小胶质细胞的吞噬作用作为细胞水平的标志物。所得数据表明，利用超声递送抗体是一种具有前景的治疗神经退行性疾病的方法。

引言

治疗性超声是一种新兴技术，旨在以非侵入性方式治疗脑部疾病，部分作用机制是促进治疗药物进入大脑1,2,3。由于靶向脑部疾病的治疗性抗体仅有极小部分能被大脑摄取并保留4，治疗性超声有望提高这些抗体的摄取率及其与靶点的结合效率5,6。

在我们的实验室中，我们正在开发一种针对神经退行性疾病的治疗策略，该策略通过使用微泡将不同形式的抗体递送穿过血脑屏障（BBB）。为实现这一目标，我们采用一种称为扫描式超声（scanning ultrasound, SUS）的扫描模式，通过颅骨向大脑多个位点施加超声波7。超声能量、静脉注射的微泡与脑血管系统之间的机械相互作用，可暂时性地打开特定声照区域中血脑屏障的紧密连接，从而使抗体及其他治疗性物质等载荷能够有效穿越该屏障7,8,9。此外，已有研究表明，超声还可促进抗体从脑组织间隙进入脑细胞（如神经元），并在细胞体内广泛分布，甚至延伸至神经突起结构中5,10。

阿尔茨海默病的特征是存在淀粉样蛋白-β 和 tau 蛋白病变11，目前已有多种动物模型可用于解析致病机制并验证治疗策略。一种 SUS 方法，即在全脑范围内以序列模式应用超声波，经过多次治疗后，可减少淀粉样蛋白-β 沉积型淀粉样前体蛋白（APP）突变小鼠脑内的淀粉样斑块病变，并激活小胶质细胞以摄取淀粉样蛋白，从而改善认知功能7。利用超声波联合微泡开放血脑屏障（BBB）也可减轻 pR5、K3 和 rTg4510 tau 转基因小鼠中的 tau 蛋白病变5,12,13。重要的是，尽管小胶质细胞可清除细胞外蛋白沉积物，但 SUS 诱导神经元内病变清除的一个潜在机制是激活神经元自噬12。

本文概述了一种实验流程：首先制备荧光标记的抗体，然后将其与实验室自制的脂质微泡混合，经麻醉后通过眶后静脉注射入小鼠体内。眶后注射是一种替代尾静脉注射的方法，我们发现其疗效相当且更易于重复操作。注射后立即对小鼠脑部施加SUS（超声刺激）。为评估治疗性抗体的摄取情况，处死小鼠后定量检测其脑组织中抗体浓度的增加。作为脑内稳态变化的替代指标，通过组织学分析和三维体积重建来测定小胶质细胞的吞噬活性。

生成的数据表明，利用超声递送抗体可能是治疗神经退行性疾病的一种颇具吸引力的方法。该方案同样可应用于其他候选药物，以及特定大小的荧光标记葡聚糖等模型货物14。

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方案

所有动物实验均经昆士兰大学动物伦理委员会批准。

1. 实验室自制微泡的制备

  1. 称取摩尔比为9:1的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）。每1 mL微泡溶液需要0.5 mg脂质混合物。或者，可直接购买已溶解于氯仿中的脂质；若使用预溶解脂质，则直接进行步骤1.3。
  2. 将脂质溶解于少量氯仿中，置于玻璃烧杯内。
  3. 使用旋转蒸发仪或氮气流将氯仿蒸发完全。
  4. 用10 mL已通过0.22 µm滤膜过滤的PBS + 10%甘油 + 10%丙二醇溶液重新水合干燥的脂质薄膜。
  5. 将重新水合后的脂质溶液置于设定为55 ˚C（高于脂质相变温度）的水浴超声仪中，超声至完全溶解。
  6. 将脂质溶液分装至已高压灭菌的1.5 mL HPLC小瓶中，并拧紧带隔垫的瓶盖。
  7. 使用配有27 G针头的5 mL注射器抽尽小瓶内的空气，使小瓶内形成真空。
  8. 用配套注射器从小钢瓶中抽取八氟丙烷气体，并注入小瓶中，根据注射器刻度向小瓶内加入1–2 mL八氟丙烷。
  9. 用石蜡膜密封每个小瓶，并冷藏保存。
  10. 实验当天，将小瓶恢复至室温，向小瓶中加入0.5 mL 0.9% NaCl溶液，然后将小瓶放入振荡混合器中，振荡45 s（预设时间），以生成微泡。

2. 使用库尔特计数器对微泡进行质量控制

  1. 从混悬器中取出微泡溶液，并用19 G针头穿刺瓶塞，释放瓶内气体。
  2. 使用带19 G针头的1 ml注射器，将100 µL微泡溶液加入5 mL过滤后的流动液中，进行第一步1:5,000稀释；再取100 µL该1:50稀释后的微泡溶液，用移液器转移至比色皿中的10 mL过滤流动液中，完成两步连续1:5,000稀释。
  3. 检查电解质储液罐中是否有足够的流动液，并确认废液罐为空。
  4. 将比色皿放入库尔特计数仪平台并固定到位。样品采集时使用30 µm孔径的检测孔。
  5. 在软件中加载标准操作方法（SOM），然后选择编辑SOM | 浓度，输入5000倍稀释。
  6. 在软件中选择合适的文件名，例如 microbubble_1_日期。
  7. 将比色皿装入并牢固固定在平台上。
  8. 在软件中选择运行 | 预览，确认样品浓度低于10%。若该数值高于10%，需对微泡溶液进行更高稀释倍数的新一轮稀释。
  9. 点击开始，启动样品采集以获得初始读数。
  10. 每次测量后，用过滤的流动液冲洗库尔特计数仪的检测孔。重复步骤2.2–2.9，共获得3个重复样本数据。
  11. 将装有稀释微泡溶液的比色皿放入超声水浴仪中，超声处理30秒。
  12. 测量经超声处理的微泡溶液，并将其标记为空白对照。
  13. 在软件中，将最终读数减去初始读数，以扣除不含气体、非微泡颗粒的信号干扰。
  14. 在软件中选择显示结果，以显示微泡浓度、粒径分布、平均粒径和体积浓度。

3. 荧光抗体标记

  1. 在不含任何添加剂的 PBS 中配制浓度为 1 mg/mL 的小鼠 IgG 溶液。
  2. 按照试剂盒说明书中的步骤，将 1 mg 小鼠 IgG 在 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液中用 AlexaFluor 647 标记。此量的荧光标记 IgG 足以对 5–7 只成年小鼠进行实验，每只小鼠给予 5 mg/kg 的抗体剂量。
  3. 将染料加入含小鼠 IgG 的 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液中，在室温下孵育 15 分钟。
  4. 通过将抗体溶液转移至离心柱中，并在 1,000 x g 下离心 5 分钟，纯化荧光标记的抗体。游离染料将保留在柱内。
  5. 使用分光光度计测定蛋白浓度。测定偶联物溶液在 280 nm 和 650 nm 处的吸光度（A280 和 A650）。使用以下公式计算样品中蛋白的浓度：
    蛋白浓度 (M) = [A280 - (A650 × 0.03)] × 稀释倍数 / 203,000。
  6. 使用分光光度计，通过以下公式计算标记程度：
    每摩尔蛋白所结合的染料摩尔数 = A650 × 稀释倍数 / 239,000 × 蛋白浓度 (M)。
    注意：可接受的标记程度为每摩尔蛋白结合 3–7 摩尔染料，通常获得的标记程度约为 6。

4. 超声设备设置

  1. 使用聚焦超声系统，将5 mm的垫片添加到水囊中，使超声焦点位于水囊底部下方9 mm处。
  2. 将约300 mL经在线脱气装置脱气20分钟的去离子水（氧含量应低于3 ppm）注入水囊中。将环形阵列放入注满水的水囊内，并使用牙科镜检查其表面是否存在气泡。若表面有气泡，需取出环形阵列并重新放入水囊中。
  3. 启动应用程序软件。在波形菜单中选择 设置波形占空比设置参数：脉冲重复频率（Hz）10，占空比 10%，聚焦深度 80 mm，中心频率 1 MHz，声压幅度（MPa，负压峰值）0.65 MPa，机械指数 = 0.65。按下 设置 定义波形并将其存储在内存中。
    注意：聚焦超声系统已由制造商利用经校准的水听器所采集的测量数据完成预校准。
  4. 在聚焦超声系统软件中制定治疗方案。该方案需定义一个包含多个独立治疗位点的治疗区域，并明确在每个治疗位点所执行的操作。本案例中，治疗区域为小鼠大脑的其中一个半球。
  5. 在运动控制器窗口中，前往 扫描 标签和 进入 x 方向运动的起始值、终止值和增量值，以及 y 方向运动的起始值、终止值和增量值。输入以下参数：X：起始值 -4，终止值 3.50；Y：起始值 -3.00，终止值 3，增量 1.5，循环次数：1。
  6. 定义治疗位点的操作。在运动控制器窗口中，选择 活动 按钮。在 脚本编辑窗口，选择将在每个处理位点按所选顺序执行的操作列表。设置 运动类型 将光栅网格置于脚本窗口顶部。在事件选项卡中选择 添加操作 将它们移至脚本面板，并添加 同步移动, 开始 触发 arb，等待， 停止 触发 arb。单击等待操作，选择等待时间为 6,000 ms。
    注意：这些设置将使处理区域形成一个6 × 5的治疗点阵列，点间距为1.5 mm，每个点的处理时间为6秒。对一只小鼠脑部进行超声处理的总时长约为3分钟。该尺寸的处理阵列适用于体重约30 g的成年C57/Bl6小鼠。可根据小鼠体型大小相应调整治疗点阵列的尺寸。

5. 动物准备

  1. 使用精度为 0.1 g 的天平称量小鼠体重。
  2. 按 90 mg/kg 剂量腹腔注射氯胺酮，同时按 6 mg/kg 剂量注射赛拉嗪进行麻醉。通过夹捏脚趾测试反射消失情况。或者，也可使用异氟烷，通过合适的吸入式麻醉装置和面罩对小鼠进行麻醉。若使用异氟烷，应在超声检查期间将小鼠置于加热垫上，以防止低体温。
  3. 使用电动剃刀剃除动物头部的毛发，然后用棉签涂抹脱毛膏，保留 2–3 分钟，或直至用湿纱布擦拭干净为止。 注意避免脱毛膏进入小鼠眼睛。
  4. 用永久性记号笔标记小鼠头部的中心位置。换能器中心有一个孔，可通过目视对准换能器的焦点和焦斑。
  5. 取一个已将底部剪掉并用塑料膜封住底部的小称量皿，其中装满超声耦合凝胶。该装置可作为 8 mm 的间隔垫，良好地耦合小鼠头部，并允许目视检查换能器焦点与小鼠头部的对准情况。

6. 微泡制备

  1. 将微泡小瓶恢复至室温。激活时，向小瓶中加入 0.5 mL 的 0.9% NaCl 溶液，并置于振荡器中振荡 45 秒，以生成微泡。
  2. 用 27 G 针头穿刺隔膜，对小瓶进行排气。

7. 超声处理

  1. 将微泡小瓶倒置，轻柔吸取 1 µL/g 体重的溶液。向其中加入荧光标记抗体溶液，并在注射器中轻轻混匀。最大注射体积为 150 µL。
    注意：实验室自制的微泡浓度约为临床使用产品（例如 Definity 微泡）的 1/60。请调整注射体积或浓度，使注射的微泡数量与临床使用剂量相当（即 Definity 1.2 × 108 个微泡/kg 体重）。
  2. 通过小鼠眶后静脉注射微泡与抗体混合溶液，注意轻柔缓慢注射。 随后，将眼用软膏涂抹于小鼠眼部。
  3. 将小鼠固定于头部固定装置中（见材料表），固定其鼻部，然后将装满超声耦合剂的小型称量皿置于头部上方。
  4. 降低水囊，使其接触并贴合称量皿中的超声耦合剂。
  5. 使用操纵杆移动换能器焦点至头部中心位置，在运动选项卡中选择 重置原点。
  6. 选择完整扫描。步骤 7.3–7.6 将耗时 2 分钟。
  7. 为保证实验一致性，设置计时器，确保从注射微泡到开始完整扫描之间有 2 分钟的延迟。
  8. 处理结束后，向眼部涂抹眼用软膏，并将小鼠放入预热的恢复舱中。若在操作过程中观察到低体温现象，可在小鼠身下放置加热垫，以在实验期间提供额外保温。

8. 组织采集与处理

  1. 在超声处理后感兴趣的时点（至少1小时，以检测脑内高水平的抗体），使用过量戊巴比妥钠溶液（100 mg/kg）对小鼠进行深度麻醉，并通过心脏灌注30 mL PBS。良好的灌注对于特异性检测递送至脑内的荧光标记抗体至关重要。
  2. 取出脑组织，于4 °C条件下在4%多聚甲醛（PFA）中浸泡固定24小时，随后用PBS洗涤。
  3. 将脑组织置于载物盘上，使用红外成像仪在700 nm通道下获取图像。
    注意：固定后，将脑组织从PFA中取出，用PBS洗涤并进行切片。或者，可将其置于乙二醇防冻液中，在4 °C下保存24小时或直至完全浸没，然后转移至新的含防冻液的小瓶中，并于-20 °C长期保存。
  4. 使用振动切片机在低温PBS中对脑组织进行切片。将脑组织粘附于切片平台，切成30–40 µm厚的切片，并收集于PBS中。
    注意：溶酶体自发荧光（在约12个月以上年龄动物的切片中较为常见）应通过将切片置于含叠氮化钠（0.02%）的PBS中，在室温下于光照培养箱内过夜照射进行漂白，以抑制细菌生长。

9. 组织染色与图像采集

  1. 将切片转移至封闭液（含5% BSA的0.2% Triton/PBS）中，室温孵育2小时，然后用0.2% Triton/PBS溶液洗涤3次，每次更换溶液。
  2. 将切片在4 °C条件下与一抗Iba1（稀释比例1:1,000）和CD68（稀释比例1:500）在0.2% Triton/PBS中孵育过夜，随后用0.2% Triton/PBS洗涤3次。
  3. 将切片在室温下与荧光二抗（稀释比例1:500）孵育2小时，然后仅用0.2% Triton/PBS洗涤3次。
    注意：也可使用DAPI溶液（0.5 µg/mL）对细胞核进行染色。
  4. 将切片转移至载玻片上，使用硬封封片剂加盖盖玻片。在成像和图像采集前，留出足够时间使封片剂充分固化（过夜）。
  5. 使用共聚焦显微镜和至少40倍放大倍数的物镜，对超声靶向脑区获取z轴层扫图像（至少10 µm深度，步长0.3 µm，每只动物获取10张图像）。
    注意：注意确保图像采集在信号动态范围内，避免曝光不足或过度。将图像文件保存为显微镜对应软件的格式。

10. 图像分析

  1. 使用图像分析软件的文件导入功能转换z轴堆栈显微图像文件。
  2. 将转换后的文件导入软件中，并调整Iba1通道的强度以观察小胶质细胞。
  3. 围绕单个小胶质细胞绘制方框进行裁剪，选择“裁剪”并保存新文件。
  4. 构建Iba1信号的三维表面渲染，步骤如下：
    1. 打开上一步生成的单细胞Imaris文件。
    2. 向文件中添加一个表面。
    3. 选择对应于Iba1染色的通道。
    4. 应用一个应与Iba1染色区域重叠的阈值。
    5. 仅选择构成目标小胶质细胞的感兴趣结构。
  5. 完成最终处理步骤：
    1. 获取并记录Iba1染色的体积。
    2. 构建CD68染色的三维表面渲染。
    3. 在Iba1表面子文件内，对CD68通道进行掩膜处理，并移除Iba1染色区域外的体素。
    4. 向文件中添加新的表面。
    5. 选择对应于CD68染色的通道。
    6. 应用一个应与CD68染色区域重叠且尽可能匹配染色体积的阈值。
    7. 完成处理过程，因该文件中仅包含小胶质细胞内的CD68结构，故无需进一步的阈值过滤步骤。
    8. 获取并记录CD68阳性结构的数量及其平均体积。
    9. 通过计算每个对应Iba1结构中CD68结构的相对体积，作为小胶质细胞处于吞噬状态时激活程度的衡量指标。

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结果

通过本方案，可将荧光标记的抗体递送至脑内，并同时检测小胶质细胞的活化情况。由此可得出结论：聚焦超声联合微泡可显著增强抗体在脑内的摄取，当采用扫描模式时，可实现抗体在整个脑部或小鼠单侧半脑的递送。图1展示了用于开放血脑屏障的TIPS超声应用装置（不同组件已标注）。图2展示了使用库尔特计数器测得的微泡粒径与浓度的代表性结果，该结果应在微泡正确制备后获得。为便于观察递送效果，抗体被标记了远红荧光染料。通过红外扫描仪或对脑组织切片进行荧光显微镜观察，可轻松可视化抗体在全脑或脑切片中的摄取情况。脑组织切片可显示荧光标记抗体在微观层面的定位。在图3中展示了扫描式超声将荧光标记的抗tau抗体RN2N递送至海马体的代表性结果。为观察SUS及抗体递送是否引起正常脑内稳态的改变，其中一个检测指标是小胶质细胞溶酶体含量，以评估其吞噬活性。图4展示了使用Iba1标记小胶质细胞以及使用小胶质细胞溶酶体特异性标志物CD68进行染...

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讨论

通过聚焦超声结合以扫描模式施加的微泡，可将荧光标记的抗体递送至大脑。扫描超声处理后，可通过荧光显微镜检测抗体递送情况、小胶质细胞形态以及溶酶体的增大。小胶质细胞可通过Fc受体介导的过程，将其溶酶体摄取抗体以及抗体所结合的抗原4。

使用该方法实现可重复的血脑屏障开放和抗体递送包含多个关键步骤。确保超声换能器与小鼠头部之间具有良好的耦合至关重要。需去除小鼠头部的所有毛发，并确保耦合介质中无气泡存在。自制微泡的特性对实验成功至关重要。微泡浓度必须足够高，达到每毫升108个微泡，且粒径分布应使超过90%的微泡直径小于10 µm。这是因为较大的微泡会被肺部从循环中滤除。可接受的中位粒径范围为1–3 µm。微泡在操作和注射过程中必须轻柔处理，以避免在注射器中被破坏。超声辐照应在注射微泡后不超过2分钟内开始，通过练习可实现这一时间控制。使用SUS方法可轻松实现全脑或整个半球的靶向，当靶向大范围区域时，靶向准确性通常不会成为问题。较小的脑区如海马体或纹状体也可成功靶向，但此时必须确保焦点与目标区域重叠。小鼠脑的高度大致相当于使用...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

感谢Dr Clem Jones AO遗产基金、澳大利亚国家健康与医学研究理事会[GNT1145580，GNT1176326]、Metal基金会以及昆士兰州政府（DSITI，科学、信息技术与创新部）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱Avanti850365C
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]Avanti880128C
AlexaFluor 647 抗体标记试剂盒Thermo FisherA20186
CD68 抗体AbD SerotecMCA1957GA使用 1:1000 稀释
氯仿Sigma-Aldrich372978
库尔特计数器（Multisizer 4e）
甘油Sigma-AldrichG5516
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 488Thermo FIsherA-11008使用 1:500 稀释
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 488Thermo FisherA-11077使用 1:500 稀释
头部固定装置（型号 SG-4N，Narishige 日本）
Iba1 抗体Wako019-19741使用 1:1000 稀释
图像分析软件Beckman Coulter#8547008
Isoflow 流动液Beckman CoulterB43905
近红外成像系统 Odyssey FcLicor2800-03
八氟丙烷Arcadophta0229NC
丙二醇Sigma-AldrichP4347
TIPS（治疗成像探针系统）Philips ResearchTIPS_007
Bitplane

参考文献

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