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高效位点特异性突变的胚胎显微注射技术 致倦库蚊

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DOI：

10.3791/61375

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2020年5月24日

 ,  ,  ,  , 
1Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2Department of Entomology and Plant Patholog, Auburn University, 3Tata Institute for Genetics and Society, University of California, San Diego

本文内容

摘要

本方案描述了适用于Culex quinquefasciatus胚胎的显微注射操作步骤，该方法已优化以配合CRISPR/Cas9基因编辑工具使用。该技术可高效产生位点特异性、可遗传的生殖系突变，可用于在此类研究尚不充分的疾病媒介中构建遗传学技术。

摘要

Culex quinquefasciatus 是多种虫媒疾病的传播媒介，包括禽疟疾、西尼罗病毒（WNV）、日本脑炎、东部马脑炎、淋巴丝虫病以及圣路易斯脑炎。值得注意的是，禽疟疾在导致众多岛屿特有鸟类物种灭绝的过程中起到了重要作用，而西尼罗病毒已成为美国重要的虫媒传染病。为了更深入地了解 C. quinquefasciatus 的生物学特性，并扩展其遗传控制工具箱，我们需要开发出更高效且经济的基因组编辑方法。然而，Culex 蚊子某些独特的生物学特征，尤其是其卵筏结构，使得实施基因组工程所必需的显微注射操作变得困难。为应对这些挑战，我们建立了一种优化的胚胎显微注射方案，重点克服与 Culex 蚊子独特特征相关的技术障碍。本方案展示了适用于 C. quinquefasciatus 显微注射的优化卵收集、卵筏分离及其他关键操作步骤。结合 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，这些方法能够实现位点特异、高效且可遗传的生殖系突变，这对于开展高级基因组工程研究以及开发这一重要但目前研究尚不充分的疾病媒介的遗传控制技术至关重要。

引言

C. quinquefasciatus（通常称为南方家蚊）是多种病原体的有效传播媒介，包括西尼罗病毒（WNV）、日本脑炎、圣路易斯脑炎和东部马脑炎。特别是自1999年首次在纽约被发现以来，西尼罗病毒已成为美国本土主要的虫媒传染病，在1999年至2018年间报告了超过50,000例人类病例，导致约2,300人死亡1，并在2008年至2019年间报告了超过4,500例马类病例2。此外，已有至少23种分布于北美的鸟类受到西尼罗病毒感染的影响，其中至少12种被归类为因西尼罗病毒而无法恢复的物种3。西尼罗病毒对人类、马类和鸟类种群的影响源于其传播媒介的 opportunistically 取食行为。通常情况下，鸟类是西尼罗病毒的主要宿主，而人类和马则是偶然宿主或终末宿主。某些由C. quinquefasciatus传播的病原体仅感染鸟类，例如禽疟原虫Plasmodium relictum。在夏威夷，C. quinquefasciatus是禽疟的主要传播媒介，已导致多种本地鸟类灭绝4,5。

控制由媒介传播的疾病 C. quinquefasciatus，研究人员和病媒控制机构已采用常见的蚊虫种群控制工具，例如杀虫剂施用6然而，这些方法成本较高，缺乏物种特异性，且由于许多害虫对杀虫剂的抗性较强，其效果有限 C. quinquefasciatus 种群6,7,8,9其他对照技术，例如 Wolbachia基于种群的控制策略近年来已得到发展10,11，但与之相关的适合度代价 Wolbachia 感染限制了该方法在此载体中的可行性12. 此外，针对其他蚊虫种类已开发出基于遗传学的防控方法，例如 埃及伊蚊13,14, Anopheles gambiae15 和 Anopheles stephensi16，包括抗病原体蚊虫的培育17,18,19，也可被开发用于 C. quinquefasciatus 如果为该物种开发出所需的基因组编辑工具，则可以实现。然而， C. quinquefasciatus 生物学与其他学科存在显著差异 伊蚊 和 按蚊属 蚊媒中缺乏类似的遗传技术，使得在该媒介生物中开发类似技术变得困难。随着基于CRISPR的基因组编辑技术的出现，精确的基因组编辑变得越来越简便、经济且易于适应，从而推动了多种物种中新型遗传工具的开发。

利用基于CRISPR的技术引入突变时，将Cas9蛋白与针对目标位点设计的合成向导RNA（sgRNA）混合物显微注射至囊胚前期胚胎中。由于 C. quinquefasciatus 雌性将卵成组地产在漂浮的筏状结构中（图1），与产下单粒卵的特征相反，后者是 伊蚊 和 按蚊属 蚊子的胚胎显微注射在此物种中变得越来越复杂。 库蚊 幼虫也从每个卵的前侧孵化，该部位与水面接触（图1），因此该物种在操作后卵子的方向非常重要。本文中，我们描述了一种针对将Cas9蛋白和sgRNA显微注射入卵子的详细实验方案 C. quinquefasciatus 胚胎。本方案旨在适应这些胚胎特有的性状 库蚊 通过某些关键步骤优化生物学过程，以提高胚胎存活率和基因组突变率，确保及时收集卵子并提高卵子存活率。

方案

1. C. quinquefasciatus 种群饲养

  1. 在昆虫饲养笼中建立多个致倦库蚊（C. quinquefasciatus）成蚊群体。
    注：蚊群由康奈尔大学的 Laura Harrington 博士提供20。有关库蚊属（Culex）蚊虫饲养的详细方案可参见其他文献21。
    1. 将蚊虫维持在 25 ± 1 ˚C、相对湿度 30% 的环境中，光照周期为 12 小时光照 : 12 小时黑暗。
    2. 通过在笼内放置带灯芯的糖液容器，或将棉球浸透糖液后置于笼内，以自由摄食方式提供 20% 的糖溶液。
  2. 在进行血液饲喂前，让蚊虫交配至少 3 天（图 2A）。

2. 收集C. quinquefasciatus 原肠胚前阶段胚胎

  1. 羽化后3-6天，通过合成膜并使用血液饲喂系统将约40 °C的柠檬酸抗凝牛血提供给雌蚊，每次饲喂1-2 mL（图2B）。此外，也可采用其他替代性血液饲喂方案用于Culex蚊虫（例如参见参考文献21）。
    注意：C. quinquefasciatus通常偏好鸟类血液。一些实验室使用麻醉的活体鸟类或禽类血液作为血餐来源21,22,23。然而，若经过多代筛选，种群也可被驯化以适应牛血或小型啮齿类动物血液作为食物来源。
    1. 在进行显微注射实验前，雌蚊吸血后应至少静置3天，以完成卵子发生和卵子成熟过程，随后再诱导其产卵。
  2. 在胚胎显微注射当天，制备含有有机浸提物的产卵水以制作产卵杯。产卵水可通过在水中发酵兔粪（50 g/L）、腐烂草叶（4.5 g/L）或鱼饲料（25 g/L）5天或更长时间制得24,25。
  3. 将产卵杯放入蚊笼中，并将整个笼子置于黑暗环境中（图2C）。
  4. 每隔30分钟检查一次产卵杯中是否有卵筏。
    1. 若发现卵筏，可用画笔轻轻捞起卵筏，并将其转移至湿润的滤纸上（图2D,E）。

3. 淡色库蚊（C. quinquefasciatus）原肠胚前阶段胚胎的排列

  1. 使用细头画笔和镊子按压卵筏，并将卵逐个分离（图2E）。
  2. 将单个卵排列在置于载玻片顶端的双面胶带上（图2F）。
  3. 排列时，尽量使每个卵的前端朝向一致，以便后续操作。
    注意：一种无需使用双面胶带的替代卵排列方法，可参见先前发表的Nasonia vitripennis胚胎显微注射方案26。
  4. 用卤代烃油混合液覆盖卵。
    注意：卤代烃混合液可预先配制，将两种卤代烃试剂与水按9:1:20（卤代烃700 : 卤代烃27 : 超纯水）比例轻轻混合后，在25οC下孵育过夜，以促进卤代烃油的水饱和。

4. 显微注射用针头的准备

  1. 使用玻璃微电极拉制仪制备铝硅酸盐毛细玻璃针。
    1. 按照微电极拉制仪用户手册中的说明，将一根铝硅酸盐毛细玻璃管放入拉针仪中。
      注意：石英和硼硅酸盐毛细玻璃针也可使用，但本实验优先选用铝硅酸盐，因其相对经济且耐用。
    2. 在拉针仪上将加热温度设为516，拉速设为100，延迟设为70，拉力设为97，气压设为500。
    3. 根据拉针仪的操作说明启动仪器，并根据需要重复操作以制备更多针尖。
      注意：在注射过程中，针尖常会发生堵塞或意外断裂，因此强烈建议为单次实验额外多制备一些针尖。
  2. 将拉制好的针尖轻轻接触旋转的金刚石研磨板，以约50˚的角度研磨约10秒，进行斜面修整。
    注意：对针尖进行斜面修整可使其开口，便于液体通过，同时形成更尖锐的末端，以更易穿透胚胎。合适的针尖示例可参见先前发表的文章26。
  3. 将拉制并修整好的针尖插入培养皿中模型黏土的凹槽内进行存放。
    注意：为保证针尖的最佳质量，建议在注射前尽可能即时拉制并修整针尖。

5. 加载注射混合物

  1. 准备注射混合物，包含基因组修饰试剂（例如，200 ng/μL sgRNA 和 200 ng/μL Cas9 混合物），或根据需要选择的注射溶液，并将其置于冰上保存。
    注：此混合物可在等待果蝇产卵期间配制。有关 Cas9 和 sgRNA 的制备及显微注射的更多细节，可参见此前已发表的文献27,28,29,30。
  2. 使用微量加样吸头将 2 μL 注射混合物吸入注射针中。

6. 显微注射装置设置

  1. 将装满的注射针放入与电子显微注射仪相连的显微操作器中。
  2. 将载有排列整齐的卵的玻片放置在复式显微镜的载物台上。
  3. 利用显微操作器和复式显微镜，将针头对准胚胎后端，以25–35˚的角度进行定位。

7. 胚胎显微注射（图2G）

  1. 小心将针头插入胚胎，并注入约相当于胚胎体积10%的混合液（根据卵的大小，约为700–800 pL）。
    注意：注射时卵应轻微膨胀，但如果注入液体过多，卵可能会破裂，或细胞质液体可能渗出。
  2. 每次注射约20个卵后暂停，并进行胚胎回收操作。
    注意：注射过程中，针头极易发生堵塞或断裂。若发生堵塞（可通过观察注射液是否无法流经针头来判断），可尝试使用电子显微注射仪的清洗功能清洁针头，或重新修磨针尖。若上述两种方法均无效，应迅速更换新针头，同时确保已准备好的卵保持湿润。

8. 胚胎回收与孵化

  1. 将卵静置至少 5 分钟。注射后 20 分钟内，用干净的画笔轻轻刷去卤代烃油（图 2H）。
  2. 用画笔轻轻挑起卵，将其放入盛有双蒸水的容器中（图 2I）。注意保持卵漂浮在水面上。
  3. 每天检查卵的孵化情况，持续 7 天（图 2J）。
  4. 按照正常的幼虫培养程序进行操作21。

9. 基因组修饰的筛选

  1. 使用体视显微镜检查注射后的蚊子，筛选突变表型（图2K）。
    1. 对于无明显易识别表型的突变，需通过PCR扩增、T7核酸内切酶I检测以及靶区域亚克隆测序来验证31。
  2. 设置注射个体之间的额外杂交，以检测生殖系中可遗传的突变。

结果

在先前发表的实验中，该方法已成功用于产生对深色眼色素发育至关重要的基因的体细胞和生殖系突变， 白色 (CPIJ005542)30 (表1). 通过筛选注射个体在蛹期眼睛色素缺失的情况，对CRISPR/Cas9诱导的体细胞突变进行评分（G0）。体细胞突变通常表现为嵌合表型，即部分而非全部细胞表现出突变表型。例如，体细胞中某些基因的突变会导致 白色 基因突变导致小眼结构出现表型混合，部分小眼缺乏色素，部分则呈现野生型色素表型30. 当存在生殖系突变时 白色 基因，然而下一代（G1）继承了完整的白眼表型。通过杂交嵌合体G代个体来确定生殖系突变率0 个体，并对完全白眼后代进行评分（G1）。这些实验获得了64%至82%的胚胎存活率，以及37%至57%的体细胞突变率和 >61% 种系突变率（表1）。通过多重化靶向同一基因多个位点的sgRNA，体细胞和生殖系突变率可提高至高达86%（表1此外，多年来实验室已成功维持了大量可存活的白眼突变体纯合品系。

昆虫卵发育阶段示意图，显示前极（A）和后极（P），显微镜观察。
图1：C. quinquefasciatus 卵筏及单个卵的形态学特征。
C. quinquefasciatus 卵筏的背侧（A）、侧侧（B）和腹侧（C）视图。C. quinquefasciatus 雌虫产卵时，较膨大的前极接触水面，而较尖的后极则远离水面（D）。A-前极；P-后极 请点击此处查看此图的放大版本。

蚊虫饲养；卵收集、显微注射、显微镜装置；发育阶段时间线。
图2：通过显微注射创制C. quinquefasciatus突变体的时间流程图。
C. quinquefasciatus种群准备及用于显微注射的胚胎收集时间流程（A–D）。收集的卵随后被分离（E），按相同方向排列并覆盖卤代烃油（F）。然后对卵进行注射（G），注射后至少静置5分钟，再去除卤代烃油（H）。之后将卵转移至清洁水源（I）以供孵化（J），并筛选突变表型（K）。请点击此处查看本图的高清版本。

存活率体细胞嵌合（G0）生殖系突变（G1）
sgRNA注射数量♂♀总计 (%)♂♀总计 (%)G1 突变体 (%)
wsgRNA-150152035(70)7(47)13(65)20(57)128(69)
wsgRNA-25093241(82)3(33)12(38)15(37)51(61)
wsgRNA-350171532(64)7(41)8(53)15(47)157(72)
wsgRNA-1/wsgRNA-25071623(46)5(71)12(75)17(74)123(79)
wsgRNA-1/wsgRNA-35013922(44)10(77)6(67)16(73)72(81)
wsgRNA-2/wsgRNA-350171027(54)13(76)8(80)21(78)101(85)
wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-350111021(42)9(82)9(90)18(86)149(86)

表1：注射靶向white基因的单个及多重gRNA的胚胎的存活率和突变率。 本表格经30许可转载

讨论

随着近年来在蚊媒遗传工程工具开发方面的努力，有必要为常见的蚊媒疾病传播媒介建立并优化胚胎显微注射方案。尽管已经为伊蚊（Aedes）和按蚊（Anopheles）建立了相关方法，但针对库蚊（Culex）的专门化方案仍鲜有研究。通常，蚊虫胚胎注射方案可分为三个基本步骤：1）胚胎的收集与准备；2）胚胎注射；3）注射后的恢复。为了成功获得突变体，这三个步骤均需针对目标物种进行优化。本改良的胚胎显微注射方案专为库蚊（Culex）基因组工程的高效实现而设计。

最大化胚胎收集量是胚胎显微注射方案中的一个常见瓶颈。为了在短时间内获得更多的卵子，可在吸血后将蚊子限制接触产卵基质2-3天。需要注意的是，C. quinquefasciatus 通常更偏好鸟类血液来源，而非哺乳动物血液来源或通过膜饲法提供的哺乳动物血液。然而，许多研究人员难以获得稳定可靠的活体鸟类或鸟类血液用于饲喂，因此实验室种群可被驯化以适应更易获取的血液来源。使用富含营养的水作为产卵基质也至关重要，因为它可为 C. quinquefasciatus 及大多数其他 Culex 传播媒介提供产卵诱导信号。制备富含营养的水有多种方法，各实验室可能需要根据实际情况进行优化，以确保获得足够数量的卵用于显微注射。例如，本方法在使用兔粪于去离子水中发酵5天或更长时间时效果最佳，但其他研究人员发现以草或鱼食作为营养来源，甚至使用蒸馏水时也能取得更好的效果21。

由于库蚊（Culex）会将卵成批地产在卵筏上，因此收集卵较为简单。只需用画笔将整个卵筏舀起即可收集卵。卵的分离则较为复杂，但对成功注射至关重要。可使用画笔或镊子轻轻在卵之间施加向下的压力，从而将卵从卵筏上小心分离。经过一定练习后，多名操作者均能稳定地从卵筏中分离出单个卵。分离后的卵需用双面胶带按相同方向排列固定，以便在显微注射过程中保持稳定。注射时将针头插入卵的锥形后端，并在操作过程中加入卤代烃油以保持卵的湿润。

为限制显微注射过程中对胚胎的损伤，注射针必须具有适当的强度，并以合适的角度进行斜面处理。使用铝硅酸盐针在50˚角度下斜面处理10秒可获得最佳效果，但硼硅酸盐和石英针也可使用，尽管其耐用性可能较差且成本更高。此外，适当的针尖斜面处理有助于Cas9与sgRNA混合物更顺畅地流动，并形成更尖锐的针尖，便于穿透胚胎。在许多情况下，斜面处理也是一种快速修复堵塞针头的有效方法，避免了更换堵塞针头所需的时间和精力。

注射后，卵应静置至少5分钟，随后立即用干净的画笔轻轻刷去卤代烃油。去除卤代烃油后，可将注射过的卵放入水中孵化，通常在注射后3天内完成孵化。通过练习并使用足够数量的卵，本方案可在尖音库蚊（C. quinquefasciatus）中稳定获得体细胞和生殖系突变，且具有足够的通用性，可轻松适用于其他库蚊属（Culex）蚊虫。

致谢

本工作部分由提供给 O.S.A. 的加州大学圣地亚哥分校启动资金资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
9 盎司透明塑料宠物杯KaratC-KC9昆虫饲养与卵收集
铝硅酸盐玻璃毛细管，外径 1 mm，内径 0.58 mmSutter InstrumentsBF100-58-10显微注射，也可使用硼硅酸盐或石英针，但我们更倾向于使用铝硅酸盐
血液Colorado Serum Company31025种群经过多代才适应此血液来源。其他血液来源可能同样适用。参见关于血液来源选择的实验方案说明。
BugdormBugdorm4F2222昆虫饲养笼
带核定位信号（NLS）的 Cas9 蛋白PNABioCP01显微注射
复式显微镜Olympus BX41显微注射，用于胚胎注射
金刚石研磨板（尖端尺寸 0.7 µm 至 2.0 µm）Sutter Instruments104E显微注射，需与斜面研磨仪配合使用
无 DNase/RNase 的蒸馏水Invitrogen10977-015显微注射
双面胶带ScotchB084NVQGXD显微注射，用于胚胎排列
Femtojet 4x 或 4i 可编程显微注射仪Eppendorf显微注射
Femtotips 微量加样吸头Fisher ScientificE5242956003显微注射
滤纸Whatman1001-090显微注射，用于胚胎收集
细尖毛笔ZEM2595显微注射，用于胚胎排列
卤代烃油 27Sigma-AldrichH8773显微注射，用于胚胎排列
卤代烃油 700Sigma-AldrichH8898显微注射，用于胚胎排列
HemotekHemotekPS5品系维持
微电极斜面研磨仪Sutter InstrumentsBV10显微注射，用于针尖斜面处理
微量移液器拉制仪Sutter InstrumentsP-1000 或 P-2000显微注射，用于拉制注射针
显微镜载玻片Fisherbrand12-550-A3显微注射，用于胚胎排列
不干型油泥JoviB0025Z71IM显微注射，用于针头储存
体视显微镜OlympusSZ51显微注射，用于胚胎排列
蔗糖Domino20% 蔗糖溶液，作为成虫的糖源。
T7 核酸内切酶 INEBM0302显微注射材料的制备
TOPO TA 克隆试剂盒ThermoFischer ScientificK451020显微注射材料的制备
超细尖镊子Fisher Scientific16-100-121显微注射，用于胚胎排列

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