该活细菌细胞成像方案可实现随时间推移在单细胞水平上可视化多种细菌物种之间的相互作用。通过延时成像，可观察每种细菌在单培养或共培养条件下的行为，从而研究多物种细菌群落中的种间相互作用，包括单个细胞的运动性和存活能力。
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摘要
摘要
多微生物群落普遍存在于自然界中，但在单细胞水平上研究它们的相互作用却十分困难。因此，已开发出一种基于显微镜的方法，用于观察两种细菌病原体之间的种间相互作用。本文展示了该方法用于研究一种可运动的革兰氏阴性病原菌Pseudomonas aeruginosa与一种非运动性革兰氏阳性病原菌Staphylococcus aureus之间相互作用的应用。该实验方案包括将两种菌共同接种于盖玻片与琼脂糖垫之间，使细胞保持在单一焦平面上，从而实现对细菌在空间和时间维度上的行为进行可视化观察。
此外，本文展示的时间序列显微镜技术非常适合观察两种或多种细菌物种之间发生的早期相互作用，包括单一种类培养以及与其他物种共培养条件下细菌运动性的变化。由于显微镜装置中样品空间有限，当细胞群体数量过高时，该方案在研究细菌物种间后期相互作用方面的适用性较低。然而，该方案具有多种不同的应用，包括使用染色方法对活菌和死菌细胞进行成像、通过荧光报告系统定量基因或蛋白表达水平，以及在单物种和多物种实验中追踪细菌细胞的运动。
引言
多微生物群落很常见 在自然界中，跨越多种环境1,2,3 以及人类生态位4,5一些最著名的人类疾病中的多微生物感染包括牙科生物膜6慢性伤口7,8慢性阻塞性肺疾病患者中的呼吸道感染9呼吸机相关性肺炎10，以及遗传病囊性纤维化（CF）11,12这些感染通常由多种多样的微生物物种组成；然而，近期研究主要关注革兰氏阳性菌之间的相互作用 金黄色葡萄球菌 革兰氏阴性细菌 铜绿假单胞菌 已出现。包括这些病原体共感染患者的多项研究 体外 分析揭示了竞争性和协作性相互作用，这些作用可能对疾病进展、微生物存活、毒力、代谢以及对抗生素的敏感性产生深远且出乎意料的影响（详见 Hotterbeekx 等，2017 年综述）....
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方案
注意：本实验方案中所有耗材的完整说明及目录编号均可在材料表中找到。
1. M8T 最小培养基的制备
- 在2 L瓶中，将64 g Na2HPO4·7H2O、15 g KH2PO4和2.5 g NaCl溶解于800 mL超纯水（UPW，电阻率18 MΩ/cm）中，配制1 L的M8最低盐基础培养基（5倍浓缩液）。调节pH至7.6，用UPW定容至1 L。121°C高压灭菌45分钟。
- 在1 L瓶中，将100 g葡萄糖溶解于400 mL UPW中，配制500 mL葡萄糖溶液（20% w/v）。用UPW定容至500 mL。121°C高压灭菌45分钟。
- 将100 g胰蛋白胨溶解于400 mL UPW中，配制500 mL胰蛋白胨溶液（20% w/v）。用UPW定容至500 mL。121°C高压灭菌45分钟。
- 在600 mL UPW中加入200 mL 5倍浓缩M8最低盐溶液（终浓度1倍）、10 mL 20%葡萄糖溶液（终浓度0.2%）、1 mL 1 M MgSO4（终浓度1 mM）和50 mL 20%胰蛋白胨溶液（终浓度1%），配制1 L M8 + 10%胰蛋白胨（M8T）最低培养基。用UPW定容至1 L，通过0.2 μm无菌滤膜过滤，收集至无菌的500 mL培养基储存瓶中。 ....
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结果
成功应用所述方法将获得一系列帧，这些帧可生成一段视频，用于随时间观察物种间的相互作用。示意图中 图1 展示了成像材料制备过程中关键步骤的可视化方法。该方法的应用使得能够演示 P. aeruginosa 单培养与共培养条件下表现出不同行为的细胞 S. aureus. 与……相比 P. aeruginosa 单培养中保持成筏状聚集的细胞，在与共培养时 S. aureus, P. aeruginosa 增强了单细胞向特定方向的运动能力 S. aureus 菌落（图 2A-2B）。荧光标记的细菌菌株还可用于观察细菌物种的混合群体。使用GFP标记的 P. aeruginosa 允许观察到在之后 P. aeruginosa 单个细胞的运动性增强，它们将包围并最终侵入 S. aureus 菌落（图 .......
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讨论
本文介绍的方法描述了一种在单细胞水平上对细菌物种相互作用进行活细胞成像的实验方案，并针对其他应用（包括细胞追踪和细胞活力监测）进行了相应优化。该方法为研究微生物在共培养条件下随时间变化的单细胞行为开辟了新的途径。具体而言，该方案展示了这种共培养方法在观察细菌表面行为方面的实用性，尤其适用于研究同时具有表面相关和液体中运动附属结构的微生物。例如，通过将细菌运动限制在单一焦平面的表面上，可以清晰地观察到P. aeruginosa在响应S. aureus时由菌毛介导的增强且具有方向性的运动行为。
如前所述，要在此成像方法中获得最佳结果，需考虑若干条件，包括样品及成像仪器（即物镜和载物台）的温度与湿度。有关更多提示和故障排除方法，请参见补充文件1。成功应用本实验方案的关键步骤之一是琼脂糖垫的制备，因为干燥不充分是最常见的问题之一。如图3A所示，若琼脂糖垫干燥时间不足，在延时成像初期会出现漂移现象；而干燥时间过长的垫片则会开始收缩，导致细胞在成像数小时后漂出视野（.......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本工作获得了囊性纤维化基金会博士后到教职过渡奖 LIMOLI18F5（DHL）、囊性纤维化基金会青年教员招聘奖 LIMOLI19R3（DHL）以及美国国立卫生研究院 T32 培训基金 5T32HL007638-34（ASP）的资助。我们感谢 Jeffrey Meisner、Minsu Kim 和 Ethan Garner 分享了成像和制备垫片的初始实验方案及建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖垫 | |||
| 35 mm 玻璃底培养皿，带 20 mm 微孔，#1.5 盖玻片 | Cellvis | D35-20-1.5-N | 一个用于琼脂糖垫模具，一个用于实验 |
| KimWipes 擦拭纸 | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| 低熔点琼脂糖 | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | 用于制备琼脂糖垫 |
| 圆底刮刀 | VWR | 82027-492 | |
| 圆锥形刮刀 | VWR | 82027-530 | |
| 硅胶隔离器，按压密封，单孔，直径 D 2.0 mm × 20 mm，硅胶/粘合剂 | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | 用于琼脂糖垫模具 |
| 无菌培养皿，85 mm | Kord-Valmark / 由 RPI 销售 | 2900 | |
| 镊子 | VWR | 89259-944 | |
| M8T 最小培养基 | |||
| D (+) 葡萄糖 | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 胰蛋白胨 | BD Biosciences | DF0123173 | |
| 显微镜 | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | 相机，420 万像素背照式 sCMOS，11 μm 像素，95% 量子效率，48 帧/秒，USB 3.0，F 接口 |
| 滤光立方体 GFP | Nikon | 96372 | 滤光立方体 |
| 滤光立方体 TxRed | Nikon | 96375 | 滤光立方体 |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | 载物台培养箱 |
| Nikon NIS-Elements AR 配备 GA3 以及 2D 和 3D 跟踪功能 | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | 数据分析软件 |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | 显微镜 |
| CFI Plan Apo ƛ20x 物镜 (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | 物镜 |
| CFI Plan Apo ƛ100x 油镜 Ph3 DM 物镜 (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | 物镜 |
| ThermoBox 带内置风扇加热器 | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | 封闭装置 |
| 细菌菌株 | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | 非黏液型原养型 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-耐甲氧西林菌株 LAC，无质粒 | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC ΔagrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| 活率染色剂 | |||
| 碘化丙啶 | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ 细菌活率检测试剂盒 |
参考文献
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385(2015).
- Cursino, L., et al.
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