一种用于研究缺血过程中神经元-胶质细胞相互作用的细胞培养模型

摘要

本文介绍一种利用特定培养基的简单方法，可从胚胎皮层高效且可重复地建立富含神经元和星形胶质细胞的培养物，或神经元-胶质细胞共培养物。

摘要

缺血性脑卒中是一种以脑组织灌注不足为特征的临床病症，可导致脑组织缺氧和葡萄糖缺乏，进而引发神经元丢失。大量证据表明，胶质细胞与神经元之间的相互作用在缺血事件后具有有益效应。因此，为了探索潜在的保护机制，建立能够在缺血环境下研究神经元-胶质细胞相互作用的模型至关重要。本文介绍一种从大鼠胚胎皮层分离星形胶质细胞和神经元的简便方法，通过使用特定的培养基，可高效且可重复地建立富含神经元、富含星形胶质细胞或神经元-胶质细胞共培养的培养体系。

为了研究星形胶质细胞与神经元之间的相互作用，我们提出了一种基于共培养系统的方法，其中培养在盖玻片上的神经元与接种在多孔板中的星形胶质细胞单层保持接触。两种培养物之间由微小的石蜡球隔开。该方法可对每种细胞类型进行独立操作并施加特定处理，这在许多研究中具有优势。

为了模拟缺血性脑卒中发生时的情况，对细胞培养物进行氧糖剥夺处理。该方案是研究神经元-胶质细胞相互作用在缺血性脑卒中中作用的有效工具。

引言

根据世界卫生组织的数据，每年约有550万人死于缺血性中风¹。该病症的特征是脑部某一区域的血液供应中断，导致组织氧气和营养物质的供应出现可逆或不可逆的丧失，进而改变组织功能，并引发线粒体功能障碍、钙稳态失调、谷氨酸兴奋性毒性、炎症反应以及细胞死亡^2,3。

除了血管细胞外，神经元和胶质细胞也参与缺血性脑卒中的病理生理过程⁴。特别是星形胶质细胞，对维持神经元功能至关重要，并且最近被发现其在应对缺血性损伤中发挥关键作用⁵。这类胶质细胞具有结构支持、抵御氧化应激、神经递质合成、稳定细胞间通讯等多种功能⁶。与神经元一起，星形胶质细胞直接参与突触传递，调控三磷酸腺苷、γ-氨基丁酸和谷氨酸等分子的释放⁷。缺血引起的部分损伤是由于谷氨酸在突触间隙过度释放并积聚，导致N-甲基-D-天冬氨酸受体过度激活，进而触发下游信号级联反应，最终引发兴奋性毒性⁸。由于星形胶质细胞能够从突触间隙清除谷氨酸并将其转化为谷氨酰胺，因此在抵御兴奋性毒性方面至关重要，从而对缺血产生神经保护作用。这些细胞还在缺血诱导的神经炎症中发挥作用。缺血损伤后，活化的星形胶质细胞会发生形态学改变（肥大），增殖，并表现出胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加。它们可转变为反应性状态（星形胶质细胞增生），释放肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1α和白细胞介素-1β等促炎细胞因子，并产生活性自由基，包括一氧化氮和超氧阴离子，这些物质反过来可诱导神经元死亡^9,10。相反，反应性星形胶质细胞也可能发挥神经保护作用，因为它们会释放转化生长因子-β等抗炎细胞因子，该因子在脑卒中后表达上调¹¹。此外，它们可形成胶质瘢痕，虽然通过抑制轴突发芽而限制组织再生，但该胶质瘢痕也能将损伤部位与存活组织隔离，从而防止不可控的组织损伤扩散^12,13。

因此，建立能够在缺血性损伤条件下研究神经元-胶质细胞相互作用的模型至关重要，以期发现能够限制或逆转缺血性损伤效应的治疗策略。与其他用于研究缺血性损伤的模型相比，例如体内模型^14,15,16、器官型培养^17,18,19和急性脑切片^20,21,22，原代细胞培养体系更为简单，使得研究各类细胞在缺血性脑卒中病理生理过程中的独立作用，以及各类细胞对潜在治疗靶点的反应成为可能。通常，为了研究富集神经元培养物与富集星形胶质细胞培养物之间的相互作用，会使用出生后来源的神经元和胶质细胞^23,24，或出生后胶质细胞与胚胎期神经元^25,26。本文提出一种简便的方法，可从同一组织来源建立富集神经元、富集星形胶质细胞以及神经元-胶质细胞共培养体系。这些原代细胞来源于大鼠胚胎期皮层，该脑区是卒中常累及的区域^27,28。此外，组织的解离仅通过机械方法完成。因此，该方案能够以快速、经济的方式，高效且可重复地分离处于相同发育阶段的细胞。

星形胶质细胞与神经元之间的相互作用可通过共培养系统进行研究，该系统将接种在盖玻片上的神经元与多孔板中培养的星形胶质细胞单层保持接触。可使用小型石蜡球以确保两种细胞培养物之间的分离。该方法允许在两种细胞接触前对其各自进行独立操作。例如，可在星形胶质细胞中沉默特定基因，进而观察其对神经元在缺血诱导损伤中易损性或保护作用的影响。一种已建立的诱导类缺血条件的方法 体外 是氧糖剥夺（OGD）³，即用常规大气（95% 空气和 5% CO₂）替换₂）置于无氧环境（95% N₂ 和5% CO₂₂)，与葡萄糖的缺失相关。

该方法可用于在缺血性脑卒中的背景下，以一种简单、快速、可重复且经济的方式研究神经元与星形胶质细胞之间的相互作用。

方案

所有使用的动物均在CICS-UBI健康科学研究中心繁育，符合国家动物研究伦理要求以及《欧洲实验和其他科学用途脊椎动物保护公约》（指令2010/63/EU）。

1. 大鼠胚胎皮层原代细胞培养

1. 培养基制备
   1. 配制Neurobasal培养基（NBM），加入以下补充成分：2% B27、0.5 mM 谷氨酰胺、25 µM 谷氨酸和120 µg/mL 庆大霉素。混匀后调节pH至7.2，并使用0.22 µm滤膜通过真空过滤法对培养基进行灭菌。用于神经元-胶质细胞培养时，在NBM培养基中额外添加10%热灭活胎牛血清（HI-FBS）。
   2. 制备添加以下成分的 Eagle 最小必需培养基（MEM）：碳酸氢钠 2.2 g/L，牛胰岛素 5 mg/L，无水 D-葡萄糖 3.4 g/L，青霉素（12 U/mL）/链霉素（12 µg/mL）以及 10% 热灭活胎牛血清（HI-FBS）。充分混匀，调节 pH 至 7.2，并通过过滤除菌。
2. 材料与设备的准备
   1. 用特定直径的针头（S型为0.5 mm，M型为0.6 mm，L型为0.8 mm）横向刺穿1 mL塑料移液器吸头的末端，并将吸头开口处密封 使用火焰。
   2. 对所有玻璃器皿进行灭菌。在解剖过程中，将所使用的工具（如剪刀、镊子、手术刀）始终浸入70%乙醇中。进入超净工作台前，用70%乙醇喷洒材料。
   3. 将水浴温度设置为 37 °C，并在开始操作前将细胞培养基放入水浴中。
      注意：进行免疫细胞化学实验时，应在含有盖玻片的多孔板中进行聚-D-赖氨酸包被。
3. 大鼠胚胎皮层培养
   1. 从妊娠15-16天的雌性Wistar大鼠体内取出胚胎（交配结束时间记为妊娠第1天，交配持续时间应为24小时）^st 胚胎发育当天）。为此，使用氯胺酮（87.5 mg/kg）和赛拉嗪（12 mg/kg）对雌鼠进行麻醉，取出胚胎后，按照标准操作规程通过颈椎脱臼处死雌鼠。
   2. 将胚胎放入一个50 mL无菌离心管中，加入磷酸盐缓冲液（PBS）至完全浸没胚胎，并迅速转移至培养室。
   3. 仍在卵黄囊内时，将胚胎放入含有25 mL冷PBS的培养皿中。使用剪刀和镊子撕破卵黄囊，取出胚胎，并转移至另一含有冷PBS的培养皿中。培养皿中的PBS应足以完全覆盖整个胚胎。
      注意：打开卵黄囊时需小心，避免损伤胚胎。在步骤1.3.3和1.3.4中，我们使用直径为90 mm的培养皿，置于覆盖有吸水纸的冰袋上，以保持PBS处于低温。
   4. 将胚胎转移至另一含有30 mL冷PBS的培养皿中进行解剖。将胚胎置于解剖显微镜下，用镊子固定。沿与皮层平行的方向从眼腔至吻端做初始切口，注意避免切断动物头部。
   5. 使用镊子小心地移除头皮和脑膜，避免损伤大脑皮层组织。进行下一步切口以分离皮层。用巴斯德吸管将皮层组织转移至含有5 mL PBS的15 mL离心管中。
   6. 使用1.2.1中准备的1 mL塑料枪头对大脑皮层组织进行机械消化。先用普通移液枪吹打10次，随后依次使用孔径渐小（L、M和S）的移液枪头重复操作，直至组织块完全分散。
   7. 机械消化后，将悬液在400 x g 3分钟。弃去上清液，用预热至37 °C的适当细胞培养基重悬沉淀。
   8. 使用血细胞计数板（Neubauer chamber）测定细胞悬液中的细胞总数（细胞密度），进行适当稀释后接种细胞。初始细胞密度根据先前的研究确定。⁵.
      1. 对于神经元富集培养，使用 0.21 x 10⁶ 细胞/厘米²² 以初始细胞密度培养，并在不含热灭活胎牛血清的NBM培养基中维持细胞。
      2. 对于神经元-胶质细胞共培养，使用 0.14 x 10⁶ 细胞/平方厘米² 以初始细胞密度接种，并将细胞维持在添加了10%热灭活胎牛血清的NBM培养基中。
      3. 对于星形胶质细胞富集培养，使用 0.26 x 10⁶ 细胞/平方厘米² 按照初始细胞密度接种，并将细胞培养于按前述方法添加补充物的MEM培养基中。
      4. 将细胞置于37 °C、95% O₂的培养箱中₂ 和5% CO₂₂.
         注意：对于较长时间的培养，应添加抗有丝分裂剂（如 27 μM 5-氟-2′-脱氧尿苷和 68 μM 尿苷）以抑制细胞生长。

2. 共培养系统

1. 材料准备
   1. 将石蜡置于加热块中，于 150 °C 加热约 7 分钟。在整个操作过程中保持温度为 150 °C。然后，使用一支直径为 1 mm 的无菌玻璃巴斯德吸管，将少量石蜡滴加到已灭菌并涂有 PDL 的盖玻片上。所形成的石蜡球形状不规则，但直径约为 2 mm。这些石蜡球可使两种培养物之间保持约 1.25 mm 的间距。
   2. 由于石蜡本身并非无菌，需将含有石蜡球的多孔板置于紫外线下照射 15 分钟以进行灭菌。
   3. 为建立共培养体系，使用先前浸入 70% 乙醇中 15 分钟的镊子，将带有石蜡球的盖玻片转移至培养板中。
2. 共培养
   1. 当两种培养物均已准备就绪（即在步骤 1.3.8 所述条件下培养 7 天后），将接种于带有石蜡球的盖玻片上的神经元转移至含有星形胶质细胞的孔中。
   2. 在两种培养物接触前 24 小时，更换神经元和星形胶质细胞的培养基，使用 NBM 培养基，并根据实验目的决定是否添加 HI-FBS。
   3. 将两种细胞类型接触后，需等待 8–12 小时，再开始施加不同的刺激或进行后续操作。
      注：共培养系统的示意图见图 1。

3. 氧糖剥夺

1. 培养基制备
   1. 对于OGD实验，使用Hank's Balanced Salt Solution（HBSS）。用以下试剂配制HBSS培养基：1.26 mM CaCl₂，5.36 mM KCl，0.44 mM KH₂PO₄，0.49 mM MgCl₂，139.9 mM NaCl，4.17 mM NaHCO₃₃，3.38 mM Na₂HPO₄匀浆并调节pH至7.2。通过过滤对培养基进行灭菌。
      注意：如需，可通过添加 5.56 mM 葡萄糖制备含葡萄糖的 HBSS 溶液（HBSSglu+）。对于进行氧糖剥夺（OGD）处理的细胞培养，HBSS 培养基中不添加葡萄糖（HBSSglu-）。
2. 缺氧缺糖处理程序
   1. 接种细胞7天后，移除培养基，用HBSSglu-洗涤两次。洗涤后加入HBSSglu-细胞培养基，将多孔板放入低氧培养舱中。
   2. 密封缺氧室，并加入含有95% N₂₂/5% CO₂₂ 用20 L/min的气流冲洗4分钟，以去除腔室内的氧气。随后停止气流，将缺氧舱置于37 °C培养箱中孵育4小时或6小时，具体时间取决于预期缺血程度。
   3. 氧糖剥夺（OGD）处理结束后，将HBSSglu-培养基更换为适当的完全培养基，用于后续实验步骤。
      注意：OGD 实验旨在模拟缺氧缺糖环境 体外 细胞在缺血事件中会遭受特定条件的影响，因此必须确保彻底清除之前使用的所有培养基。

4. 免疫细胞化学检测

注意：按照先前所述方法进行免疫细胞化学检测⁵。

1. 简而言之，为表征不同皮层培养物，将细胞在4 °C下与兔抗GFAP抗体（1:2000）和小鼠抗微管相关蛋白2（MAP2；1:500）共同孵育过夜；随后在室温下与以下二抗孵育1小时：Alexa Fluor 546标记的抗兔抗体和Alexa Fluor 488标记的抗小鼠抗体，两者均按1:1000稀释。
2. 通过在室温下用2 µM Hoechst 33342孵育10分钟，对细胞核进行标记。
3. 将盖玻片封片于荧光封片剂中，并在落射荧光显微镜下使用63倍物镜获取图像。

5. 统计分析

1. 以占……的百分比形式表示数据 细胞总数或相对于对照组的百分比，表示为至少3次独立实验（每组设3个复孔）的均值±均值标准误（SEM）。
2. 使用软件（GraphPad Software Inc., San Diego, CA）进行非配对 t 检验的统计分析 t 检验。当 p 值具有统计学意义时，结果被认为具有显著性 < 0.05.

结果

为了表征这些培养物，对每种类型的皮层培养物进行了免疫细胞化学染色，以评估表达GFAP或MAP2的细胞数量，这两种蛋白分别是星形胶质细胞和神经元的常用标记物（图2）。分析结果显示，星形胶质细胞富集的培养物中，97%的细胞表达GFAP（图2A）；在神经元富集的培养物中，78%的细胞表达MAP2，4%的细胞表达GFAP，另有18%的细胞对GFAP和MAP2均呈阴性（图2B）；而在神经元-胶质细胞共培养的皮层培养物中，49%的细胞为MAP2阳性，31%为GFAP阳性，20%的细胞对两种标记物均呈阴性（图2C）。

建立皮层培养7天后，对神经元-胶质细胞共培养和神经元富集培养分别进行4小时或6小时的氧糖剥夺（OGD）处理。处理结束后，通过免疫细胞化学方法评估MAP2阳性和GFAP阳性细胞的数量。在神经元-胶质细胞共培养中，经过4小时和6小时OGD后，MAP2...

讨论

本文所述方法包括从大鼠胚胎皮层组织中分离星形胶质细胞和神经元，从而建立富集神经元或星形胶质细胞的培养体系，或神经元-胶质细胞共培养体系。该方法改编自本课题组先前的一项研究⁵，其中描述了皮层神经元-胶质细胞共培养及神经元富集型胚胎培养的分离方法，并对这两种培养体系进行了表征。利用这些培养模型，Roque 等人发现星形胶质细胞在应对缺血性损伤中发挥关键作用，并提示星形胶质细胞与神经元之间的通讯对神经保护至关重要⁵。在本实验方案中，除了制备神经元-胶质细胞共培养和神经元富集型培养外，我们还能够获得星形胶质细胞富集型培养，从而可分别或同时研究缺血环境对神经元和星形胶质细胞的影响。

免疫细胞化学数据分析显示，在神经元富集培养物中，有18%的细胞以及在神经元-胶质细胞共培养物中，有20%的细胞对MAP2和GFAP均呈阴性。这些细胞的细胞核呈现非固缩形态。鉴于培养物来源于胚胎组织，部分细胞可能尚未表达神经元标志物，需要进一步成熟。这与先前的研究结果一致，这些研究表明MAP2的表达随神经元成熟度增加而上...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24 孔培养板	Thermo Fischer Scientific	142475
95% N2/5% CO2 气体钢瓶	ArLíquido
与 Alexa Fluor 488 偶联的抗小鼠抗体	Invitrogen	A11001	1/1000 稀释；室温孵育 1 小时
与 Alexa Fluor 546 偶联的抗兔抗体	Invitrogen	A11010	1/1000 稀释；室温孵育 1 小时
B27 添加剂（50 倍浓缩）	Gibco	17504-044
Dako 荧光封片剂	Dako	S3023
无水 D-葡萄糖	Fisher Scientific	G/0450/60	3.4 g/L
落射荧光显微镜	Zeiss	AxioObserver Z1x	63 倍物镜
胎牛血清（FBS）	Biochrom	S0615	10%
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G1272	120 µg/mL
谷氨酸	Sigma-Aldrich	G8415	25µM
谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G3126	0.5 mM
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	2 µM；室温孵育 10 分钟
低氧培养箱	Stemcell Technologies	27310	用于氧糖剥夺（OGD）诱导的培养室
牛胰岛素	Sigma-Aldrich	I5500	5 mg/L
氯胺酮	Sigma-Aldrich	K-002	87.5 mg/Kg
最低必需培养基（Eagle 培养基）	Sigma-Aldrich	M0268	使用前预热至 37 °C
小鼠抗 MAP2 抗体	Santa Cruz Biotechnology	Sc-74421	1/500 稀释；4 °C 过夜孵育
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049	使用前预热至 37 °C
组织学用石蜡切片	Sigma-Aldrich	1.07164	凝固点 56–58°C
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	PBS 中配制成 4%
青霉素/链霉素	Biochrom	A 2213	青霉素（12 U/mL）/链霉素（12µg/mL）
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P1024
兔抗 GFAP 抗体	DAKO	Z0334	1/2000 稀释；4 °C 过夜孵育
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S/4240/60	2.2 g/L
赛拉嗪	Sigma-Aldrich	X1126	12 mg/Kg