一种用于研究缺血过程中神经元-胶质细胞相互作用的细胞培养模型

摘要

本文介绍一种利用特定培养基的简单方法，可从胚胎皮层高效且可重复地建立富含神经元和星形胶质细胞的培养物，或神经元-胶质细胞共培养物。

摘要

缺血性脑卒中是一种以脑组织灌注不足为特征的临床病症，可导致脑组织缺氧和葡萄糖缺乏，进而引发神经元丢失。大量证据表明，胶质细胞与神经元之间的相互作用在缺血事件后具有有益效应。因此，为了探索潜在的保护机制，建立能够在缺血环境下研究神经元-胶质细胞相互作用的模型至关重要。本文介绍一种从大鼠胚胎皮层分离星形胶质细胞和神经元的简便方法，通过使用特定的培养基，可高效且可重复地建立富含神经元、富含星形胶质细胞或神经元-胶质细胞共培养的培养体系。

为了研究星形胶质细胞与神经元之间的相互作用，我们提出了一种基于共培养系统的方法，其中培养在盖玻片上的神经元与接种在多孔板中的星形胶质细胞单层保持接触。两种培养物之间由微小的石蜡球隔开。该方法可对每种细胞类型进行独立操作并施加特定处理，这在许多研究中具有优势。

为了模拟缺血性脑卒中发生时的情况，对细胞培养物进行氧糖剥夺处理。该方案是研究神经元-胶质细胞相互作用在缺血性脑卒中中作用的有效工具。

引言

根据世界卫生组织的数据，每年约有550万人死于缺血性中风¹。该病症的特征是脑部某一区域的血液供应中断，导致组织氧气和营养物质的供应出现可逆或不可逆的丧失，进而改变组织功能，并引发线粒体功能障碍、钙稳态失调、谷氨酸兴奋性毒性、炎症反应以及细胞死亡^2,3。

除了血管细胞外，神经元和胶质细胞也参与缺血性脑卒中的病理生理过程⁴。特别是星形胶质细胞，对维持神经元功能至关重要，并且最近被发现其在应对缺血性损伤中发挥关键作用⁵。这类胶质细胞具有结构支持、抵御氧化应激、神经递质合成、稳定细胞间通讯等多种功能⁶。与神经元一起，星形胶质细胞直接参与突触传递，调控三磷酸腺苷、γ-氨基丁酸和谷氨酸等分子的释放⁷。缺血引起的部分损伤是由于谷氨酸在突触间隙过度释放并积聚，导致N-甲基-D-天冬氨酸受体过度激活，进而触发下游信号级联反应，最终引发兴奋性毒性⁸。由于星形胶质细胞能够从突触间隙清除谷氨酸并将其转化为谷氨酰胺，因此在抵御兴奋性毒性方面至关重要，从而对缺血产生神经保护作用。这些细胞还在缺血诱导的神经....

方案

所有使用的动物均在CICS-UBI健康科学研究中心繁育，符合国家动物研究伦理要求以及《欧洲实验和其他科学用途脊椎动物保护公约》（指令2010/63/EU）。

1. 大鼠胚胎皮层原代细胞培养

1. 培养基制备
   1. 配制Neurobasal培养基（NBM），加入以下补充成分：2% B27、0.5 mM 谷氨酰胺、25 µM 谷氨酸和120 µg/mL 庆大霉素。混匀后调节pH至7.2，并使用0.22 µm滤膜通过真空过滤法对培养基进行灭菌。用于神经元-胶质细胞培养时，在NBM培养基中额外添加10%热灭活胎牛血清（HI-FBS）。
   2. 制备添加以下成分的 Eagle 最小必需培养基（MEM）：碳酸氢钠 2.2 g/L，牛胰岛素 5 mg/L，无水 D-葡萄糖 3.4 g/L，青霉素（12 U/mL）/链霉素（12 µg/mL）以及 10% 热灭活胎牛血清（HI-FBS）。充分混匀，调节 pH 至 7.2，并通过过滤除菌。
2. 材料与设备的准备
   1. 用特定直径的针头（S型为0.5 mm，M型为0.6 mm，L型为0.8 mm）横向刺穿1 mL塑料移液器吸头的末端，并将吸头开口处密封 使用火焰。
   2. 对所有玻璃器皿进行灭菌。在解剖过程中，将所使用的工具（如剪刀、镊子、手术刀）始终浸入70%乙醇中。进入超净工作台前，用70%乙醇喷洒材料。

结果

为了表征这些培养物，对每种类型的皮层培养物进行了免疫细胞化学染色，以评估表达GFAP或MAP2的细胞数量，这两种蛋白分别是星形胶质细胞和神经元的常用标记物（图2）。分析结果显示，星形胶质细胞富集的培养物中，97%的细胞表达GFAP（图2A）；在神经元富集的培养物中，78%的细胞表达MAP2，4%的细胞表达GFAP，另有18%的细胞对GFAP和MAP2均呈阴性（图2B）；而在神经元-胶质细胞共培养的皮层培养物中，49%的细胞为MAP2阳性，31%为GFAP阳性，20%的细胞对两种标记物均呈阴性（图2C）。

建立皮层培养7天后，对神经元-胶质细胞共培养和神经元富集培养分别进行4小时或6小时的氧糖剥夺（OGD）处理。处理结束后，通过免疫细胞化学方法评估MAP2阳性和GFAP阳性细胞的数量。在神经元-胶质细胞共培养中，经过4小时和6小时OGD后，MAP2.......

讨论

本文所述方法包括从大鼠胚胎皮层组织中分离星形胶质细胞和神经元，从而建立富集神经元或星形胶质细胞的培养体系，或神经元-胶质细胞共培养体系。该方法改编自本课题组先前的一项研究⁵，其中描述了皮层神经元-胶质细胞共培养及神经元富集型胚胎培养的分离方法，并对这两种培养体系进行了表征。利用这些培养模型，Roque 等人发现星形胶质细胞在应对缺血性损伤中发挥关键作用，并提示星形胶质细胞与神经元之间的通讯对神经保护至关重要⁵。在本实验方案中，除了制备神经元-胶质细胞共培养和神经元富集型培养外，我们还能够获得星形胶质细胞富集型培养，从而可分别或同时研究缺血环境对神经元和星形胶质细胞的影响。

免疫细胞化学数据分析显示，在神经元富集培养物中，有18%的细胞以及在神经元-胶质细胞共培养物中，有20%的细胞对MAP2和GFAP均呈阴性。这些细胞的细胞核呈现非固缩形态。鉴于培养物来源于胚胎组织，部分细胞可能尚未表达神经元标志物，需要进一步成熟。这与先前的研究结果一致，这些研究表明MAP2的表达随神经元成熟度增加而上.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24 孔培养板	Thermo Fischer Scientific	142475
95% N2/5% CO2 气体钢瓶	ArLíquido
与 Alexa Fluor 488 偶联的抗小鼠抗体	Invitrogen	A11001	1/1000 稀释；室温孵育 1 小时
与 Alexa Fluor 546 偶联的抗兔抗体	Invitrogen	A11010	1/1000 稀释；室温孵育 1 小时
B27 添加剂（50 倍浓缩）	Gibco	17504-044
Dako 荧光封片剂	Dako	S3023
无水 D-葡萄糖	Fisher Scientific	G/0450/60	3.4 g/L
落射荧光显微镜	Zeiss	AxioObserver Z1x	63 倍物镜
胎牛血清（FBS）	Biochrom	S0615	10%
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G1272	120 µg/mL
谷氨酸	Sigma-Aldrich	G8415	25µM
谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G3126	0.5 mM
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	2 µM；室温孵育 10 分钟
低氧培养箱	Stemcell Technologies	27310	用于氧糖剥夺（OGD）诱导的培养室
牛胰岛素	Sigma-Aldrich	I5500	5 mg/L
氯胺酮	Sigma-Aldrich	K-002	87.5 mg/Kg
最低必需培养基（Eagle 培养基）	Sigma-Aldrich	M0268	使用前预热至 37 °C
小鼠抗 MAP2 抗体	Santa Cruz Biotechnology	Sc-74421	1/500 稀释；4 °C 过夜孵育
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049	使用前预热至 37 °C
组织学用石蜡切片	Sigma-Aldrich	1.07164	凝固点 56–58°C
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	PBS 中配制成 4%
青霉素/链霉素	Biochrom	A 2213	青霉素（12 U/mL）/链霉素（12µg/mL）
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P1024
兔抗 GFAP 抗体	DAKO	Z0334	1/2000 稀释；4 °C 过夜孵育
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S/4240/60	2.2 g/L
赛拉嗪	Sigma-Aldrich	X1126	12 mg/Kg