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植物微小RNA的检测与定量分析：RNA印迹分析法

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DOI：

10.3791/61394

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2020年7月11日

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2SASTRA University

本文内容

摘要

本方法展示了利用Northern杂交技术从总RNA提取物中检测miRNA。

摘要

microRNA（miRNA）是一类内源性表达的非编码小RNA，长度约为21个核苷酸（nt），参与调控动植物中的基因表达。大多数miRNA作为负向调控开关，靶向关键基因。在植物中，初级miRNA（pri-miRNA）转录本由RNA聚合酶II生成，并形成长度各异的稳定茎环结构，称为前体miRNA（pre-miRNA）。一种内切核酸酶Dicer-like1将pre-miRNA加工成miRNA-miRNA*双链体。miRNA-miRNA*双链体中的一条链被选择并装载到Argonaute 1蛋白或其同源蛋白上，介导靶标mRNA的切割。尽管miRNA是重要的信号分子，但其检测通常采用灵敏度较低的基于PCR的方法，而非更灵敏的Northern印迹分析。本文介绍一种简单、可靠且极其灵敏的Northern印迹方法，非常适合以极高灵敏度定量任意植物组织中的miRNA水平。此外，该方法还可用于确认miRNA及其前体的大小、稳定性和丰度。

引言

近年来，小调控RNA——microRNA的发现推动了相关研究，以深入理解其在植物和动物中的作用1。miRNA的长链前体在HYL1和特定的Dicer样蛋白作用下，被加工为21至24 nt的成熟miRNA2,3。一条22 nt的miRNA可通过产生次级siRNA引发级联沉默效应4。研究表明，miRNA及次级siRNA在发育过程、细胞命运决定以及应激反应中均发挥重要作用5,6。

Northern 杂交是一种常规用于检测特定 RNA 分子的实验方法。该方法经过优化，可用于从总 RNA 混合物中检测长度约为 19–24 nt 的小 RNA7。在本演示中，我们展示了该技术用于 microRNA（miRNA）的检测与定量。该方法采用放射性同位素标记探针，因此可显著提高样品中 miRNA 水平的检测灵敏度。与基于 PCR 的方法不同，该方法不仅能实现 miRNA 表达量的准确定量，还可确定其分子大小。在本实验方案中，我们展示了若干关键步骤，以提升 miRNA 的检测效果。我们对印迹和杂交步骤进行了优化，以获得高分辨率的 miRNA 信号检测结果。该技术还可用于检测其他内源性小 RNA，如 siRNA、tasi-secondary RNA 和 snoRNA。

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方案

1. 制备15%变性聚丙烯酰胺凝胶

  1. 称取并加入 4.8 g 尿素，加入 3.75 mL 40% 丙烯酰胺:双丙烯酰胺（19:1）溶液以及 1 mL 10× TBE（pH 8.2）溶液至一个无菌的 50 mL 离心管中。
  2. 将离心管置于 60 °C 的水浴中，使尿素溶解，形成澄清溶液。
  3. 用新灭菌的去离子水定容至 10 mL，并将凝胶混合液冷却至室温。
  4. 配制新鲜的 10%（w/v）过硫酸铵溶液。

2. 玻璃板和电泳装置的组装

  1. 用洗涤剂清洗凝胶电泳和电转移所需的全部装置。使用软海绵轻轻擦洗，以去除残留的缓冲液和丙烯酰胺，然后用水冲洗并晾干。
  2. 将两块玻璃板组装在一起，并牢固地放置在海绵上。本实验装置使用厚度为1 mm的玻璃板。确保两块玻璃板处于同一水平，以防止漏液。
  3. 向10 mL凝胶混合液中加入8 µL TEMED和80 µL新配制的10% (w/v) 过硫酸铵溶液。
  4. 立即轻轻混匀，并将混合液缓慢注入组装好的玻璃板之间。小心插入梳子。此步骤应避免产生气泡。
  5. 让凝胶聚合约45分钟。
  6. 在将凝胶放入电泳装置前，用无菌水冲洗聚合后的凝胶。
  7. 将玻璃板装入电泳夹心中，小心移除梳子。
  8. 向电泳槽中加入新配制的无菌1x TBE缓冲液（pH 8.2）。
  9. 用移液器吸取缓冲液小心冲洗加样孔，以去除盐结晶。此步骤有助于RNA样品在凝胶中均匀迁移。
  10. 以80 V预电泳30分钟。

3. 上样染料和样品的制备

  1. 配制 10 mL 上样缓冲液：称取 5 mg 溴酚蓝和 5 mg 二甲苯青，小心加入 10 mL 去离子甲酰胺，充分混匀。
  2. 将 10 µg 总 RNA 分装至无菌 1.5 mL 离心管中，使用真空浓缩仪干燥样品。注意不要过度干燥。
  3. 用 8 µL 上样缓冲液重悬 RNA 样品。
  4. 将样品在 98 °C 加热 2 分钟，室温冷却 1 分钟，涡旋振荡并短暂离心，重复此步骤 3 次。此步骤对 RNA 的充分重悬至关重要，进而确保样品上样量均一。

4. 凝胶电泳

  1. 在上样前停止预电泳，并清洗上样孔。
  2. 将样品在 98 °C 加热 1 分钟，然后使用毛细管尖端趁热将样品加入上样孔中。将尖端插入孔底，使样品在孔内形成一层薄层。
  3. 完成所有样品的上样，同时需加入 RNA decade marker。
  4. 以 80 V 电压电泳，直至溴酚蓝染料几乎完全迁移。在 15% 变性丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝的迁移位置相当于 10 bp。

5. 电转印前的准备

  1. 用HB铅笔在尼龙膜的右上角进行标记，并将其裁剪至与玻璃板相同的尺寸。
  2. 将标记面朝向水面，轻轻将膜放置于无菌水表面，预浸润15分钟。
  3. 将4张吸水纸I裁剪至与纤维垫相同尺寸。
  4. 准备好凝胶夹心结构，将夹子的灰色面朝下放置于洁净托盘中。
  5. 预先润湿纤维垫并将其覆盖在夹子上，去除气泡。
  6. 将一张吸水纸用1×TBE缓冲液预湿后覆盖在纤维垫上，用塑料移液管轻轻滚压以去除气泡；再覆盖另一张预湿的吸水纸，并同样去除气泡。
  7. 小心地从电泳夹心中取出凝胶，并将其放置在夹心装置上，确保第一个上样的RNA样品位于右侧。
  8. 将预浸润的膜用1×TBE缓冲液轻轻浸湿后覆盖在凝胶上，标记面朝下，用滚压方式去除气泡。
  9. 取一张吸水纸浸入缓冲液后覆盖在膜上，并去除气泡；再取另一张浸湿的吸水纸覆盖在整个夹心结构上，同样去除气泡。
  10. 在装置上方放置一块预湿的纤维垫，完成夹心结构，并牢固闭合夹子。
  11. 将转印夹子放入转印装置中，并加入pH 8.2的1×TBE缓冲液至标记线处。
  12. 在4 °C条件下，以10 V电压过夜转印。
  13. 转印完成后，将湿润的膜置于一张纸片上，并立即用254 nm紫外光（120,000 µjoules/cm²）照射交联RNA至膜上。交联后的膜可在4 °C保存，用于后续杂交实验。

6. 放射性标记探针的制备

  1. 设计一条与待检测的小RNA完全互补的探针。
  2. 按照表1中提供的配方，使用BRIT提供的ƳP32ATP在探针的5’端进行末端标记。
  3. 将上述反应混合物在37 °C下孵育30分钟。
  4. 根据生产商的方案，使用Sephadex G-25柱将未标记的ƳP32ATP与探针分离。

7. 印迹杂交

  1. 将交联后的印迹膜RNA面向上放入杂交瓶中。
  2. 充分混匀超敏杂交缓冲液，加入10 mL，并在35 °C的杂交炉中旋转孵育印迹膜。
  3. 预杂交20分钟。
  4. 将杂交瓶从孵育炉中取出，轻柔地将标记好的探针加入杂交缓冲液中。
  5. 在35 °C下旋转杂交12小时。
  6. 杂交完成后，小心将杂交液转移至15 mL离心管中。该溶液可于4 °C保存，以备重复使用。
  7. 用2×SSC缓冲液加0.5% SDS快速洗涤印迹膜2分钟，以去除多余的杂交液，弃去洗涤液。
  8. 用2×SSC缓冲液加0.5% SDS在35 °C下旋转孵育印迹膜30分钟。
  9. 再用0.5×SSC缓冲液加0.5% SDS在35 °C下旋转洗涤印迹膜30分钟。
  10. 将印迹膜放入杂交封片中，吸去多余缓冲液并密封。
  11. 将封好的印迹膜置于暗盒中，过夜曝光至无放射性磷屏成像仪的成像屏上。
  12. 使用生物分子成像仪检测杂交信号，并用合适的软件分析结果。
  13. 通过在80 °C下旋转孵育30分钟（使用0.5×SSC缓冲液加0.1% SDS），再用0.1×SSC缓冲液加0.1% SDS在相同条件下孵育30分钟，对印迹膜进行剥离处理。

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结果

在本实验中，我们检测并定量了indica水稻var whiteponni不同组织中miR397的表达（图1）。miR397是一种长度为22 nt的保守miRNA。在所有检测的样品中均可检测到miR397的表达。根据高通量测序数据，样品1（幼苗组织）中miR397的表达量为每百万序列读数5条（rpm）。我们能够清晰检测到其信号，表明该方法具有很高的灵敏度，可用于检测丰度极低的miRNA。在本实验中，我们使用miR168和U6作为上样对照。

在此印迹中（图1），使用ImageJ对信号强度进行定量。miR397在营养生长期的叶鞘中表达量最高。

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讨论

该方法可广泛用于检测和定量小RNA，包括丰度较低的miRNA。本实验方案主要描述了在上样缓冲液中对总RNA进行变性、通过凝胶电泳按大小分离RNA、将RNA转移至膜上、将RNA交联固定于膜上，并使用所需的放射性标记寡核苷酸探针进行杂交的步骤。

任何印迹实验的关键步骤是使用高质量的RNA进行样品制备。在上样到凝胶之前，必须确保样品流动性良好，不会粘附在加样枪头。加样时应小心操作，枪头应刚好插入加样孔底部上方，使样品在孔内形成一层薄层。为了检测丰度极低的miRNA，杂交炉的温度必须维持在35 °C。若需对印迹膜进行多次杂交，应将膜保存在4 °C，置于湿润的2x SSC溶液中以保持湿润。

该方法可用于检测富含多糖和多酚组织中的小RNA8。在本实验方案中，采用真空干燥浓缩RNA样品，与以往其他方法相比，具有更高的稳定性且样品损失更少9。本方法的另一项改进是在电转移过程中，将膜在浸入1× TBE缓冲液前先在水中铺展。这有助于提高RNA转移效率，...

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致谢

作者感谢主办机构和印度放射同位素委员会（BRIT）提供的辐射实验室及放射性同位素使用权限。 PVS 实验室由印度国家生物科学中心、塔塔基础研究所及印度政府生物技术部资助（项目编号：BT/PR12394/AGIII/103/891/2014；BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19；BT/PR25767/GET/119/151/2017）。MP 感谢印度政府生物技术部提供的 DBT-研究奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液SigmaA9926
过硫酸铵（APS）BioRad1610700
吸水纸whatmann blotting paper I1001-125
溴酚蓝SigmaB5525-5G
毛细管上样尖端BioRad2239915
去离子甲酰胺AmbionAM9342
加热金属块Eppendorff5350
Hybond N+ 尼龙膜GERPN203B
杂交瓶SigmaZ374792-1EA
杂交炉Thermo Scientific1211V79
N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）SigmaT7024-25ml
磷屏成像仪GE- Typhoon scanner29187194
磷屏成像仪屏幕和暗盒GE healthcareGE28-9564-75
移液器Gilson, 型号：P20 和 P10FA10002M, FA10003M
塑料移液管Falcon357550
聚丙烯酰胺凝胶装置BioRad1658003EDU
Sephadex G-25 柱GE healthcare27532501
真空浓缩仪Thermo Scientific20-548-130
SpinwinTarsons1010
T4 多核苷酸激酶（PNK）NEBM0201S
转印装置（Transblot）BioRad1703946
ULTRAHyb 杂交缓冲液AmbionAM8670
尿素Fischer Scientific15985
紫外交联仪UVPCL-1000L
涡旋振荡器Tarsons3020
水浴锅NEOLABD-8810
二甲苯青SigmaX4126-10G

参考文献

  1. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
  2. Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
  3. Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
  4. Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
  5. Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
  6. Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
  7. Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
  8. Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
  9. Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
  10. Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).

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