用于植物微RNA检测和定量的RNA斑点分析

摘要

此方法演示了利用北方杂交技术从总RNA提取物中检测miRNA。

摘要

MicroRNA （miRNA） 是一类内源性表达的非编码，±21 nt 小型RNA参与植物和动物基因表达的调控。大多数miRNA充当针对关键基因的基因表达的负开关。在植物中，原发性miRNA（原始miRNA）转录本由RNA聚合酶II生成，它们形成不同长度的稳定茎环结构，称为前miRNA。内核糖酶，像迪瑟一样1，将预米RNA处理成miRNA-miRNA*双工。从miRNA-miRNA* 双面的一股被选择并加载到Argonaute 1蛋白或其同源体上，以调解目标mRNA的裂解。虽然miRNA是关键信号分子，但它们的检测通常采用不太理想的基于PCR的方法，而不是敏感的北方印迹分析。我们描述了一种简单、可靠和极其敏感的北方方法，它非常适合从任何植物组织中对具有极高灵敏度的 miRNA 水平进行定量。此外，此方法可用于确认米RNA及其前体的尺寸、稳定性和丰度。

引言

最近发现的小型调控RNA，微RNA，已经领导了研究，了解它们及其在植物和动物^{中的作用1。}miRNA的长前体由HYL1和特定的骰子样蛋白质^{2，3加工成21至24nt成熟的3}miRNA。22 nt miRNA 可以通过生成二级 siRNA⁴启动级联沉默。研究表明，miRNA和二级siRNA在发育、细胞命运和压力反应^{5，6,中的作用}。

北方杂交是一种常规用于检测特定RNA分子的实验方法。此方法自定义其在检测大约 19 -24 nt 长的小 RNA 从总 RNA^{7 的池中的使用}。在此演示中，我们演示了该技术用于检测和定量 miRNA。该方法使用放射性同位素对探头进行标签标记;因此，可以提高灵敏度检测样品中的miRNA水平。与基于 PCR 的方法不同，此方法可确保表达式的量化以及 miRNA 的大小确定。在该协议中，我们展示改善miRNA检测的关键步骤。我们修改了印迹和杂交步骤，以获得 miRNA 的高分辨率信号检测。此技术还可用于检测其他内生小RNA，如 siRNA、tasi-辅助RNA 和 snoRNA。

方案

1. 制备15%变性聚丙烯酰胺凝胶

1. 称重并加入4.8克尿素，加入3.75 mL的40%丙烯酰胺:双丙烯酰胺（19:1）溶液和1 mL的10x TBE pH 8.2放入无菌50 mL管中。
2. 使用 60°C 的水浴将尿素溶解成清晰的溶液。
3. 使用新鲜自功能开的无菌水将体积放大至 10 mL，将凝胶混合物冷却至室温。
4. 准备新鲜的 10%（w/v）铵硫酸盐溶液。

2. 玻璃板和电泳装置的组装

1. 用洗涤剂清洗凝胶电泳和电印所需的所有设备。用软海绵轻轻擦洗它们，去除残留的缓冲液和丙烯酰胺，用水冲洗，让它们干燥。
2. 将两个玻璃板组装在一起，并牢固地放在海绵上。使用 1 毫米厚的板进行此设置。确保板处于同一水平，以避免泄漏。
3. 在 10 mL 凝胶混合物中，加入 8 μL 的 TEMED 和 80 μL 新鲜制备的 10%（w/v）硫酸铵溶液。
4. 毫不拖延地，轻轻混合并倒入组装的玻璃板之间。小心地放置梳子。在此步骤中避免产生气泡。
5. 让凝胶聚合约 45 分钟。
6. 在将聚合凝胶置于凝胶运行装置内之前，用无菌水清洗聚合凝胶。
7. 组装运行盒内的板，轻轻拆下梳子。
8. 将新鲜准备好的无菌 1x TBE、pH 8.2 倒入罐中。
9. 通过移液液洗孔以去除盐晶体。此步骤可帮助 RNA 样品均匀地穿过凝胶。
10. 在 80 V 下执行预运行 30 分钟。

3. 装载染料和样品的准备

1. 对于10 mL的凝胶加载染料，重量5毫克的布罗莫酚蓝色，5毫克的二甲醇，加入10 mL的去化甲酰胺仔细混合。
2. 将总RNA10μg放入无菌1.5 mL管中，并使用速度真空将样品干燥。不要过度干燥样品。
3. 将RNA样品重新在8μL的负荷中。
4. 在 98 °C 加热样品 2 分钟，在 RT 冷却 1 分钟，涡流和旋转样品 3 次。此步骤对于适当的再暂停至关重要，这反过来又有助于对样品进行相等的加载。

4. 凝胶电泳

1. 在样品装载之前停止预运行并清洗油井。
2. 在 98 °C 下加热样品 1 分钟，并使用毛细管尖端将样品加热到井中。将尖端插入井底，使样品在井中占据一层薄层。
3. 完成所有样品的加载。包括加载RNA十年标记。
4. 在 80 V 下运行凝胶，直到布罗莫酚蓝色染料几乎完全运行。溴酚蓝色运行在15%变性丙烯酰胺凝胶10个基点。

5. 电印准备

1. 将 N+尼龙膜切割到玻璃板的尺寸，用 HB 铅笔将膜的右上角标记。
2. 轻轻地将膜放在无菌水的表面，朝向有标记的一侧，朝向水面。预浸泡膜15分钟。
3. 切割4件印迹纸I到纤维垫的尺寸。
4. 准备凝胶三明治，将盒式磁带的灰色面放在干净的托盘中。
5. 预湿纤维垫，并放在盒式磁带上。清除气泡。
6. 在 1x TBE 中预湿一张印迹纸，并放在纤维垫上。通过将塑料移液器滚动到纸张上，去除气泡。再放一块预湿印迹纸并清除气泡。
7. 小心地从运行盒中取下凝胶，并将其放在三明治设置上，使第一个加载的 RNA 样品朝向右侧。
8. 轻轻地将预浸膜浸入 1x TBE 中，并放在凝胶上，朝向贴有标签的一侧朝下。推出以清除气泡。
9. 浸一张印迹纸，放在膜上，去除气泡。再浸一张印迹纸，放在三明治上，去除气泡。
10. 将预湿纤维垫放在设置上并牢固地关闭盒式磁带，完成三明治。
11. 将转盘盒放在模块中，并填充 1x TBE，pH 8.2 至印迹标记。
12. 在 10 V 下传输，在 4 °C 下过夜。
13. 转移后，将湿膜放在纸片上，并立即用 254-nm 紫外线照射将 RNA 与膜交叉连接（120，000 μjoules/cm2）。交连印迹可能储存在4°C，用于进一步杂交。

6. 准备放射性标记探头

1. 设计一个完全与要检测的小RNA互补的探针。
2. 使用³²ATP（ƳP从 BRIT 获得）在其 5' 端将组件组合在一起，根据表 1 中提供的配方，将探头标记为 32ATP（从 BRIT 获取）。
3. 在37°C下孵育上述反应混合物30分钟。
4. 根据制造商的协议，ƳP使用 Sephadex G-25 列将未标记的³²ATP 从探头中分离。

7. 污点的混合

1. 将交叉链接的印迹，RNA 侧朝顶部在杂交瓶内。
2. 大力混合超敏感杂交缓冲液，加入10 mL，并在保持在35°C的杂交炉内孵化印迹，旋转。
3. 执行预杂交 20 分钟。
4. 将瓶子从烤箱中取出，并轻轻地将贴标探针添加到杂交缓冲液中。
5. 在35°C下混合印迹，旋转12小时。
6. 杂交后，小心地将杂交溶液转移到15 mL管中。此溶液可储存在 4 °C，直到重新使用。
7. 通过添加 2x SSC 缓冲液加 0.5% SDS，快速清洗印迹 2 分钟，以消除多余的杂交解决方案。丢弃解决方案。
8. 用 2x SSC 缓冲液加上 0.5% SDS 孵育 35 °C 的印迹，旋转 30 分钟。
9. 再次用 0.5 倍 SSC 缓冲液加上 35°C 的 0.5% SDS 洗涤污点，旋转 30 分钟。
10. 将印迹放在杂交盖内，拆下多余的缓冲液并密封。
11. 在盒式磁带内隔夜将其暴露在无辐射荧光成像器屏幕上。
12. 使用生物分子成像器检测杂交信号，使用合适的软件分析结果。
13. 在 80 °C 下孵育污点，旋转 30 分钟，0.5 X SSC 缓冲液加 0.1% SDS 和 0.1 X SSC 缓冲器加 0.1% SDS 30 分钟。

结果

在本次演示中，我们检测并量化了miR397在稻谷白粉不同组织中的表现（图1）。 varmiR397 是一个 22 nt miRNA 和保存的 miRNA。可以在所有测试的样品中检测到miR397的表达。根据下一代测序数据，样本 1（幼苗组织）具有 miR397，每百万（rpm）读取 5 次。我们舒适地检测到其信号，表明该方法非常敏感，可用于检测甚至非常低的丰富的miRNA。在此实验中，我们使用 miR168 和U6 作为加载控件。

在此印迹（图1）中，信号强度使用 ImageJ 进行量化。miR397的表达在植物叶护套中最高。

讨论

该方法可广泛用于检测和定量小RNA，包括不太丰富的miRNA。该协议主要描述了在加载缓冲液中变性总RNA的步骤，通过凝胶电泳进行大小分离，将RNA转移到膜上，将RNA交叉链接到膜，并使用所需的放射性标记寡聚探针进行杂交。

任何印迹实验的关键步骤是使用优质RNA进行样品制备。在装载凝胶之前，必须确保样品自由流动，不要粘在装料尖端。装载样品时必须小心，尖端应插入井底的上方，使样品在井中占据一层薄层。杂交炉的温度必须保持在35°C，以检测非常不丰富的miRNA。对于印迹的重复杂交，将膜存放在 4°C 下，将其保持 2 倍 SSC 的潮湿。

此方法可用于检测富含多糖和多酚⁸的组织中的小RNA。在该协议中，与其他较旧的方法相比，使用真空干燥来浓缩RNA样品，可提供更好的稳定性和更少的样品^损失。该方法中的其他修改包括，在电传输过程中浸入1x TBE之前将膜在水中扩散。这提高了RNA传输的效率，提供了更好的污点分辨率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液	Sigma	A9926
过硫酸铵 （APS）	BioRad	1610700
印迹纸	Whatmann 印迹纸 I	1001-125
溴酚蓝	Sigma	B5525-5G
毛细管上样提示	BioRad	2239915
去离子甲酰胺	Ambion	AM9342
加热块	Eppendorff	5350
Hybond N+尼龙膜	GE	RPN203B
杂交瓶	Sigma	Z374792-1EA
杂交炉	Thermo Scientific	1211V79
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺 （TEMED）	Sigma	T7024-25ml
PhosphorImager	GE-台风扫描仪	29187194
PhosphorImager 屏幕和盒式	GE Healthcare	GE28-9564-75
移液器	Gilson，型号：P20 和 P10	FA10002M，FA10003M
塑料移液器	Falcon	357550
聚丙烯酰胺凝胶仪	BioRad	1658003EDU
Sephadex G-25 色谱柱	GE 医疗保健	27532501
速真空浓缩器	Thermo Scientific	20-548-130
Spinwin	Tarsons	1010
T4 多核苷酸激酶 （PNK）	NEB	M0201S
Transblot 仪	BioRad	1703946
ULTRAHyb杂交缓冲液	Ambion	AM8670
Urea	Fischer Scientific	15985
紫外线交联剂	UVP	CL-1000L
涡旋	Tarsons	3020
水浴	NEOLAB	D-8810
二甲苯青	Sigma	X4126-10G