植物微小RNA的检测与定量分析：RNA印迹分析法

摘要

本方法展示了利用Northern杂交技术从总RNA提取物中检测miRNA。

摘要

microRNA（miRNA）是一类内源性表达的非编码小RNA，长度约为21个核苷酸（nt），参与调控动植物中的基因表达。大多数miRNA作为负向调控开关，靶向关键基因。在植物中，初级miRNA（pri-miRNA）转录本由RNA聚合酶II生成，并形成长度各异的稳定茎环结构，称为前体miRNA（pre-miRNA）。一种内切核酸酶Dicer-like1将pre-miRNA加工成miRNA-miRNA*双链体。miRNA-miRNA*双链体中的一条链被选择并装载到Argonaute 1蛋白或其同源蛋白上，介导靶标mRNA的切割。尽管miRNA是重要的信号分子，但其检测通常采用灵敏度较低的基于PCR的方法，而非更灵敏的Northern印迹分析。本文介绍一种简单、可靠且极其灵敏的Northern印迹方法，非常适合以极高灵敏度定量任意植物组织中的miRNA水平。此外，该方法还可用于确认miRNA及其前体的大小、稳定性和丰度。

引言

近年来，小调控RNA——microRNA的发现推动了相关研究，以深入理解其在植物和动物中的作用¹。miRNA的长链前体在HYL1和特定的Dicer样蛋白作用下，被加工为21至24 nt的成熟miRNA^2,3。一条22 nt的miRNA可通过产生次级siRNA引发级联沉默效应⁴。研究表明，miRNA及次级siRNA在发育过程、细胞命运决定以及应激反应中均发挥重要作用^5,6。

Northern 杂交是一种常规用于检测特定 RNA 分子的实验方法。该方法经过优化，可用于从总 RNA 混合物中检测长度约为 19–24 nt 的小 RNA⁷。在本演示中，我们展示了该技术用于 microRNA（miRNA）的检测与定量。该方法采用放射性同位素标记探针，因此可显著提高样品中 miRNA 水平的检测灵敏度。与基于 PCR 的方法不同，该方法不仅能实现 miRNA 表达量的准确定量，还可确定其分子大小。在本实验方案中，我们展示了若干关键步骤，以提升 miRNA 的检测效果。我们对印迹和杂交步骤进行了优化，以获得高分辨率的....

方案

1. 制备15%变性聚丙烯酰胺凝胶

1. 称取并加入 4.8 g 尿素，加入 3.75 mL 40% 丙烯酰胺:双丙烯酰胺（19:1）溶液以及 1 mL 10× TBE（pH 8.2）溶液至一个无菌的 50 mL 离心管中。
2. 将离心管置于 60 °C 的水浴中，使尿素溶解，形成澄清溶液。
3. 用新灭菌的去离子水定容至 10 mL，并将凝胶混合液冷却至室温。
4. 配制新鲜的 10%（w/v）过硫酸铵溶液。

2. 玻璃板和电泳装置的组装

1. 用洗涤剂清洗凝胶电泳和电转移所需的全部装置。使用软海绵轻轻擦洗，以去除残留的缓冲液和丙烯酰胺，然后用水冲洗并晾干。
2. 将两块玻璃板组装在一起，并牢固地放置在海绵上。本实验装置使用厚度为1 mm的玻璃板。确保两块玻璃板处于同一水平，以防止漏液。
3. 向10 mL凝胶混合液中加入8 µL TEMED和80 µL新配制的10% (w/v) 过硫酸铵溶液。
4. 立即轻轻混匀，并将混合液缓慢注入组装好的玻璃板之间。小心插入梳子。此步骤应避免产生气泡。
5. 让凝胶聚合约45分钟。
6. 在将凝胶放入电泳装置前，用无菌水冲洗聚合后的凝胶。
7. 将玻璃板装入电泳夹心中，小心移除梳子。
8. 向电泳槽中加入新配制的无菌1x TBE缓冲液（pH 8.2....

结果

在本实验中，我们检测并定量了indica水稻var whiteponni不同组织中miR397的表达（图1）。miR397是一种长度为22 nt的保守miRNA。在所有检测的样品中均可检测到miR397的表达。根据高通量测序数据，样品1（幼苗组织）中miR397的表达量为每百万序列中5个读段（rpm）。我们能够清晰地检测到其信号，表明该方法具有很高的灵敏度，可用于检测丰度极低的miRNA。在本实验中，我们使用miR168和U6作为上样对照。

在此印迹中（图1），使用ImageJ对信号强度进行定量。miR397在营养生长期的叶鞘中表达量最高。

讨论

该方法可广泛用于检测和定量小RNA，包括丰度较低的miRNA。本实验方案主要描述了在上样缓冲液中对总RNA进行变性、通过凝胶电泳按大小分离RNA、将RNA转移至膜上、将RNA交联固定于膜上，并使用所需的放射性标记寡核苷酸探针进行杂交的步骤。

任何印迹实验的关键步骤是使用高质量的RNA进行样品制备。在上样到凝胶之前，必须确保样品流动性良好，不会粘附在加样枪头。加样时应小心操作，枪头应刚好插入加样孔底部上方，使样品在孔内形成一层薄层。为了检测丰度极低的miRNA，杂交炉的温度必须维持在35 °C。若需对印迹膜进行多次杂交，应将膜保存在4 °C，置于湿润的2x SSC溶液中以保持湿润。

该方法可用于检测富含多糖和多酚组织中的小RNA⁸。在本实验方案中，采用真空干燥浓缩RNA样品，与以往其他方法相比，具有更高的稳定性且样品损失更少⁹。本方法的另一项改进是在电转移过程中，将膜在浸入1× TBE缓冲液前先在水中铺展。这有助于提高RNA转移效率，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液	Sigma	A9926
过硫酸铵（APS）	BioRad	1610700
吸水纸	whatmann blotting paper I	1001-125
溴酚蓝	Sigma	B5525-5G
毛细管上样尖端	BioRad	2239915
去离子甲酰胺	Ambion	AM9342
加热金属块	Eppendorff	5350
Hybond N+ 尼龙膜	GE	RPN203B
杂交瓶	Sigma	Z374792-1EA
杂交炉	Thermo Scientific	1211V79
N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma	T7024-25ml
磷屏成像仪	GE- Typhoon scanner	29187194
磷屏成像仪屏幕和暗盒	GE healthcare	GE28-9564-75
移液器	Gilson, 型号：P20 和 P10	FA10002M, FA10003M
塑料移液管	Falcon	357550
聚丙烯酰胺凝胶装置	BioRad	1658003EDU
Sephadex G-25 柱	GE healthcare	27532501
真空浓缩仪	Thermo Scientific	20-548-130
Spinwin	Tarsons	1010
T4 多核苷酸激酶（PNK）	NEB	M0201S
转印装置（Transblot）	BioRad	1703946
ULTRAHyb 杂交缓冲液	Ambion	AM8670
尿素	Fischer Scientific	15985
紫外交联仪	UVP	CL-1000L
涡旋振荡器	Tarsons	3020
水浴锅	NEOLAB	D-8810
二甲苯青	Sigma	X4126-10G