本文提供了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）在体外生成神经肌肉接头（NMJs）的实验方案。该方法可在单个孔中于一个月内诱导形成具有成熟形态和功能的神经肌肉接头。所获得的神经肌肉接头有望用于相关疾病的建模、病理机制的研究，或用于药物化合物的治疗性筛选。
本文内容
摘要
摘要
神经肌肉接头（NMJ）是一种特化的突触结构，可将动作电位从运动神经元传递至骨骼肌，从而引发机械性运动。NMJ的结构构象影响着神经元、肌肉及其相互作用的功能。以往的研究通过共培养运动神经元与肌管以在体外构建NMJ，但这些方法通常诱导过程复杂、培养周期较长，且难以重现成熟NMJ的形态与功能。我们的体外NMJ诱导系统通过在单一培养皿中诱导人诱导多能干细胞（iPSC）分化而建立。通过切换成肌与成神经诱导培养基进行诱导，在一个月的培养后，所形成的NMJ包含突触前和突触后组分，包括运动神经元、骨骼肌细胞以及施万细胞。NMJ的功能检测显示，肌管的收缩可由Ca++触发，并可被箭毒（一种乙酰胆碱受体（AChR）抑制剂）所抑制，表明刺激信号经由NMJ传递。这一简单且稳健的方法成功获得了具有功能性连接的复杂NMJ结构。这种具备完整结构与功能的体外人源NMJ模型，在研究疾病病理机制及化合物筛选方面具有广阔的应用前景。
引言
神经肌肉接头（NMJ）是一种特化的突触结构，可将信号从运动神经元传递至骨骼肌，从而控制随意肌的运动1,2。该突触由突触前和突触后两部分组成。在突触前部分，运动神经元通过胞吐作用从突触小泡中释放乙酰胆碱（ACh）。ACh 释放后穿过突触间隙，与突触后膜上的乙酰胆碱受体（AChR）结合，从而触发动作电位，引起肌肉收缩3,4。该精细结构的任何功能障碍均可导致神经肌肉接头疾病，包括脊髓性肌萎缩症（SMA）、先天性肌无力综合征（CMS）、重症肌无力（MG）5,6,7等。这些疾病严重损害患者的生活质量，且由于对病理机制缺乏了解，目前尚无有效的治疗方法。在本研究中，我们旨在利用人诱导多能干细胞（iPSCs）体外构建人源神经肌肉接头，以实现精确的疾病建模及治疗化合物的筛选。
既往研究已证实，通过共培养策略可在体外构建神经肌肉接头（NMJ）。运动神经元和骨骼肌肌管可分别生成，这些细胞类型可来源于人或小鼠的原代组织培养，也可由干细胞诱导分化而来8,9,10,11，随后进行共培养以促进NMJ的形成。进一步的应用包括将共培养的NMJ整合至微流控三维装置中，并利用光遗传学元件进行可量化的功能检测12,13。然而，这些策略需要较长的培养周期，且难以同时获得NMJ的主要组成成分——无论是运动神经元还是骨骼肌肌管。此外，NMJ的另一重要组分——施万细胞，在这些培养体系中亦无法生成。因此，包含肌管、运动神经元和施万细胞的先进培养系统备受期待，因其可为NMJ研究提供一个可靠且稳定的模型。
成肌分化因子1（MYOD1）是一种广为人知的成肌调控因子，参与肌生成过程14。此前已有研究建立了一种高效的成肌分化方法，利用MYOD1驱动诱导性多能干细胞（iPSC）向肌管细胞分化15。因此，我们通过在iPSC中过表达MYOD1来诱导生成肌管细胞15，并实现了高效的成肌分化。有趣的是，在第10天后，神经元细胞在肌管细胞培养过程中自发出现。成肌培养体系中出现神经元细胞促使我们开发出在同一培养皿中体外构建神经肌肉接头（NMJ）的策略。本文提供了一种通过在人iPSC中过表达MYOD1，在同一培养体系中同时诱导成肌细胞和运动神经元的NMJ构建策略。运动神经元在多种神经营养因子（GDNF、BDNF、NT3等）的作用下自发诱导生成8，同时雪旺细胞也可被诱导产生16,17。通过肌管细胞、运动神经元和雪旺细胞之间的相互作用，最终形成成熟的神经肌肉接头18。该方法能够高效生成具有功能性的神经肌肉接头，为研究疾病发病机制及筛选治疗性化合物提供了潜在平台。
方案
1. 细胞外基质（ECM）包被板的制备
- 用预冷的1×PBS将ECM（参见材料表）稀释至终浓度为2%。
- 在50 mL塑料管中，将1 mL ECM加入49 mL 1×PBS中，通过反复吹打混匀数次。
- 在6孔板的每个孔中放入1个盖玻片，每孔加入1.5 mL 2% ECM溶液。
- 将6孔板置于37 °C孵育2 h。
- 吸除孔板中的ECM溶液，将板置于4 °C保存备用。
2. 诱导多能干细胞向神经肌肉接头的分化
- 在第1节中准备的6孔板中，每孔接种4 × 105个iPSCs。确保将细胞接种在预先置于孔内的盖玻片上。
注意：本研究中使用的201B7MYOD iPS细胞系由Sakurai博士实验室惠赠15。- 从6 cm培养皿中的iPSCs中移除培养基，并用1× PBS洗涤iPSCs一次。
- 向培养皿中加入1 mL细胞解离溶液，在37 °C下孵育10分钟。
- 向培养皿中加入3 mL灵长类胚胎干细胞（ES）培养基，轻轻吹打3次。
- 收集含有解离iPSCs的上清液至50 mL塑料管中，在4 °C下以160 × g离心5分钟。
- 小心吸除上清液，将iPSCs重悬于3 mL含10 µM Y27632的灵长类ES细胞培养基中，并使用血细胞计数板计数细胞数量。
- 用含10 µM Y27632的灵长类ES细胞培养基将iPSCs稀释至浓度为2 × 105个细胞/mL。向第1节所述的预先置于孔内的盖玻片上加入2 mL细胞悬液。
- iPSCs向神经肌肉接头（NMJ）的诱导
- 第1天，在将iPSCs接种至6孔板24小时后，移除培养基，每孔更换为2 mL含1 µg/mL多西环素的新鲜灵长类ES细胞培养基。
- 从第2天到第10天，每天更换培养基，每孔加入2 mL含1 µg/mL多西环素（终浓度）的成肌分化培养基（MDM）（表1）。
- 从第11天开始，每孔更换为2 mL神经肌肉接头培养基（NMJ培养基）（表1）。此后每3–4天更换一次培养基，直至第30天。
- 在第30天使用倒置相差显微镜观察分化的神经肌肉接头。所得神经肌肉接头可用于后续分析。
3. 免疫荧光（IF）染色
- 第30天，从6孔板中吸除培养基。每孔加入2 mL 4%多聚甲醛，在室温下固定NMJ培养物30分钟。
- 用1×PBS溶液洗涤样本3次，每次向每孔加入2 mL PBS，每次洗涤3分钟。
- 用0.1% Triton/PBS溶液对样本进行10分钟的通透处理。
- 重复步骤3.2。
- 用0.5% BSA在室温下封闭样本1小时。
- 重复步骤3.2。
- 加入一抗，在4 °C下孵育过夜。抗体稀释比例如下：Islet 1（1 µg/mL）、肌球蛋白重链（MYH）（1/300）、神经丝蛋白（NF）（1 µg/mL）、S-100（1/300）、突触小泡蛋白2（SV2）（1 µg/mL）、Tuj1（1/1000）。
- 重复步骤3.2。
- 加入二抗，在室温下孵育1小时。二抗使用浓度如下：抗小鼠IgG 488标记抗体（0.1 µg/mL）、抗兔IgG 488标记抗体（0.1 µg/mL）。
- 重复步骤3.2。
- 加入aBTX-647（0.5 µg/mL）对乙酰胆碱受体（AChR）进行染色，同时加入DAPI（1 µg/mL）对细胞核进行染色。
- 重复步骤3.2。
- 用镊子从6孔板中取出盖玻片，将其置于含50%甘油/PBS溶液的载玻片上封片。
4. 扫描电子显微镜（SEM）
- 在室温下，用 0.1 M 磷酸钾缓冲液配制的 4% 多聚甲醛和 1% 戊二醛固定 NMJ 培养物，固定时间为 1 小时。
- 将样品浸入 0.1 M 磷酸钾缓冲液中，室温下洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 用递增浓度的乙醇（50%、70%、90%、95% 和 100% 两次）对样品进行脱水处理，每种浓度乙醇中浸泡 10 分钟。
- 使用临界点干燥仪对样品进行干燥（-30 °C，0.1 Torr）。
- 使用铂（Pt）离子溅射镀膜仪对样品进行镀膜（30 mA，3 分钟；铂层厚度约为 20 nm）。
- 在 5 kV 条件下，使用扫描电子显微镜（SEM）观察样品。
5. 透射电子显微镜（TEM）
- 使用细胞刮刀从NMJ培养板上收集组织。将组织团成一个小团块（3 mm3用剃刀刀片切割并用凝胶包裹形成凝胶包裹的样品。将凝胶包裹的样品置于4 °C条件下，用0.1 M磷酸钾缓冲液配制的2%多聚甲醛和2%戊二醛固定液过夜。
- 将样品浸入0.1 M磷酸钾缓冲液中，在室温下洗涤3次，每次15分钟。
- 用双蒸水配制的1%四氧化锇处理样品2室温下孵育1小时。
注意：此步骤必须在化学通风橱中进行。 - 重复步骤 5.2。
- 使用递增浓度的乙醇（50%、70%、90%、95% 和 100% 两次）对样品进行脱水处理，每个乙醇浓度浸泡 10 分钟。
- 吸除100%乙醇。用环氧树脂与100%乙醇按体积比递增的混合液（1:3、1:1 和 3:1）对样品进行渗透。每种混合液在室温下以10 rpm轻柔振荡1小时。
- 将环氧树脂-乙醇混合液替换为纯环氧树脂，在室温下以10 rpm轻轻振荡4小时。
- 孵育4小时后，更换为新鲜环氧树脂，在室温下以10 rpm轻轻振荡过夜。
- 将样本置于包埋胶囊中，加入新鲜环氧树脂包埋，并在65 °C烘箱中过夜固化。
- 超薄切片技术
- 在解剖显微镜下对样本块进行粗切，以获得正确的方向。
- 使用超薄切片机上的玻璃刀对粗修整后的组织块进行精细修块，以获得光滑的表面。
- 使用金刚石刀从修整良好的包埋块制备70 nm的超薄切片。用200目碳-火棉胶支持膜铜网捞取超薄切片。
- 用双蒸水配制的饱和醋酸铀对载网上的超薄切片进行染色2O孵育30分钟，然后用双蒸水洗涤网格3次2O（每次洗涤10分钟）。
- 此外，使用Reynold's柠檬酸铅对超薄切片进行对比染色19 (2.5%) 5 分钟，用煮沸的 H 洗涤2O 预冷至室温，重复3次（每次洗涤10分钟）。在染色区域周围放置数粒氢氧化钠颗粒，以防止CO₂干扰2 切片上的沉淀
- 在70 kV下通过透射电子显微镜观察超薄切片。
6. 肌肉收缩与筒箭毒碱处理
- 为诱导肌管收缩，在步骤 2.3 的培养基中加入 25 mM CaCl2。肌管的运动可在 1‒2 分钟内观察到。
- 将 6 孔板置于倒置显微镜载物台上，通过活细胞显微镜记录肌管收缩的视频。
- 为终止肌管收缩，向培养基中加入筒箭毒碱（300 ng/mL），然后按照步骤 6.2 记录视频。
- 使用运动矢量分析软件打开视频文件，点击 运动分析 按钮以分析视频。
注意：肌管收缩以时间-运动图形式显示。视频采用颜色编码以显示肌管的运动速度，其中彩色闪烁信号代表肌管的运动，红色表示最快运动速度，蓝色表示最慢运动速度。
结果
采用我们的分化策略，培养物在第30天显示出神经肌肉接头（NMJ）的突触前和突触后组分。在单个孔中，NMJ组分被成功诱导并良好发育，其形态及在NMJ中的位置通过免疫荧光显微镜（IF）得以展示（图1）。图1A中的流程图总结了NMJ分化过程的时间线。神经丝蛋白（NF）、突触小泡（SV2）和乙酰胆碱受体（AChR）的染色（图1B,C）用于标记神经元。NF和SV2的单独染色图像见于补充图1。α-银环蛇毒素染色用于标记AChR（图1C）。合并图像展示了运动神经元与AChR在NMJ中的相对位置（图1D,E）。第二组免疫荧光染色使用Tuj1和Islet 1标记运动神经元（图1G,H），使用肌球蛋白重链标记突触后肌管（图1I）。在NMJ培养物中，施万细胞也通过S-100抗体进行了标记（补充图2）。
为了进一步确认神经肌肉接头（NMJ）组分的身份，我们使用扫描电镜（SEM）进行详细的形态学分析。图2A、B展示了具有扩展的轴突末梢、轴突和肌纤维的成熟神经肌肉接头形态。透射电镜（TEM）用于揭示神经肌肉接头组分的成熟超微结构，包括含有突触小泡的突触前轴突末梢和被突触间隙分隔的突触后部分（图2C‒E）。黄色虚线标示的接头皱褶指示了神经元与肌纤维的连接部位（图2C）。含有突触小泡的成熟轴突末梢如图中黄色箭头所示（图2D、E）。形态学结果表明，神经肌肉接头组分得到了良好诱导并趋于成熟。
为了评估体外神经肌肉接头（NMJ）的功能，我们通过用 CaCl2 刺激运动神经元以诱导肌管收缩，并进行运动分析。结果显示，Ca2+ 可触发肌肉收缩，而该收缩可被筒箭毒所中断。神经肌肉接头表现出显著的运动信号，经筒箭毒处理后信号消失（图3）。这一效应证实，运动神经元信号通过神经肌肉接头传递，从而引发肌肉收缩。综上所述，免疫荧光显微镜（IF）、扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）数据展示了上述方案所构建的体外神经肌肉接头中各组分的空间分布、形态特征及成熟度。运动分析验证了该体外神经肌肉接头的功能，提示其在治疗策略开发中具有潜在应用价值。
图1：神经肌肉接头（NMJ）诱导流程图及NMJ培养的免疫荧光图像。（A）NMJ分化的流程图。（B‒F）NMJ组分的检测，包括神经丝蛋白（NF）、突触小泡（SV2）和乙酰胆碱受体（AChR）。D图中的白色箭头指示神经肌肉接头位置。（G‒K）NMJ的突触前和突触后组分。Tuj1和Islet1标记运动神经元，肌球蛋白重链（MYH）标记肌管。a-BTX为α-银环蛇毒素。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：成熟的神经肌肉接头（NMJ）的扫描电镜和透射电镜图像。（A）NMJ 组成部分的空间分布显示轴突末梢锚定在肌纤维（Mf）表面。（B）NMJ 的高倍放大图像显示轴突末梢。（C）成熟 NMJ 的超微结构，包括突触前轴突末梢（红色箭头头）、突触小泡（Sv）、突触间隙（Sc）和突触后部分（红色箭头）。连接皱褶（jf）由黄色虚线标示。Ax，轴突。（D、E）高倍放大图像显示轴突末梢中的突触小泡（黄色箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：体外神经肌肉接头中肌管收缩分析。使用25 mM CaCl2溶液（绿色线）可触发肌管收缩，经箭毒处理后收缩受到抑制（黄色线）。另请参见补充视频1和补充视频2。请点击此处查看此图的放大版本。
补充视频1：由Ca++引发的肌管收缩。 请点击此处下载该视频。
补充视频 2：显示经箭毒处理后肌管的收缩明显减弱。 请点击此处下载该视频。
补充图1：神经肌肉接头（NMJ）培养中神经丝（NF，白色箭头）的单染图像。 神经肌肉接头（NMJ）培养中突触小泡（SV2，白色箭头）的单染图像。请点击此处下载该图。
补充图2：NMJ培养物中由S-100抗体标记的施万细胞。 请点击此处下载该图。
| 成肌分化培养基 (MDM) | MEM-alpha | 500mL |
| 100mM 2-ME | 1117μL | |
| 多西环素 | 1μg/mL | |
| KSR | 56mL（终浓度为10%） | |
| 青霉素/链霉素 | 2.5mL | |
| 总量 | 560mL | |
| 100mM 2-巯基乙醇 | 2-巯基乙醇 | 7μL |
| 双蒸水 | 993μL | |
| 总量 | 1000μL | |
| 神经肌肉接头培养基 (NMJ 培养基) | Neurobasal 培养基 (NB) | 500mL |
| B27 | 1x（储存液为50x） | |
| BDNF | 10ng/mL | |
| GDNF | 10ng/mL | |
| N2 | 1x（储存液为100x） | |
| NT3 | 10ng/mL | |
| 青霉素/链霉素 | 2.5mL | |
表1：培养基配方。
讨论
既往研究已报道了利用复杂方法在体外形成功能性神经肌肉接头（NMJ）的技术，但这些方法需要长期培养8,10,12,13,20。这些成果推动了体外神经肌肉接头模型的发展。然而，复杂的实验流程限制了NMJ研究的广泛应用。本方案无需共培养，可在单孔中高效且稳定地生成神经肌肉接头。在我们的诱导体系中，观察到构成神经肌肉接头的三种细胞类型，包括肌管、运动神经元和施万细胞18。此外，还验证了其成熟的形态特征与功能。
根据我们之前的研究，初始细胞密度是神经肌肉接头（NMJ）形成的关键因素，不同细胞密度会在培养中诱导产生数量各异的NMJ18。较低的细胞密度（< 1 × 104/cm2）会导致神经元数量较少，不利于NMJ的形成。尽管制备更高密度的细胞（> 1 × 105/cm2）需要更多时间和资源，但我们建议在本方案中采用1.5 × 104/cm2至5 × 104/cm2之间的细胞密度。通过该方案生成的NMJ是一种包含多种细胞类型的异质性组织，更接近生理条件。在培养皿中，肌管分布较为均匀，而运动神经元则随机出现，这一现象导致NMJ在培养体系中分布不均。因此，该NMJ模型适用于定性研究，而不适用于需要均一化培养系统的研究分析。我们还使用了其他细胞系，例如H9（胚胎干细胞系）18和A11（诱导多能干细胞系，数据未显示），通过本方案成功生成了NMJ。这些NMJ在形态和功能上均能正常形成，但不同细胞系的培养条件仍需进一步优化。
化学诱导的肌管收缩及筒箭毒碱依赖性抑制证实了我们构建的体外神经肌肉接头具有功能，并可潜在地应用于实际检测。在培养3‒4周时可随机观察到自发性肌肉收缩，但通过将培养时间延长至长达两个月可避免该现象18。
已有多种策略被报道用于构建不同成熟阶段的体外神经肌肉接头（NMJ），但本系统中生成的体外NMJ表现出显著的成熟特征，因为在培养过程中可观察到乙酰胆碱受体（AChR）γ亚基向ε亚基的转变18。成熟度是利用体外NMJ进行疾病建模时的重要考量因素21。综上所述，具有完整结构组分、成熟特征和功能的体外NMJ在治疗开发方面具有潜在应用价值。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢酒井博士慷慨提供201B7MYOD细胞。电子显微镜研究得到了京都大学医学研究生院解剖学研究中心电子显微镜研究部的大冈子冈和春保柯田的支持。单克隆抗体由霍华德·休斯医学研究所/哥伦比亚大学开发，来源于发育研究杂交瘤库（该库由美国国立卫生研究院下属的国家儿童健康与人类发育研究所创建，并由爱荷华大学生物学系维护）。我们还感谢大岛志织、中川一博和松井绘里子在运动矢量分析方面的协助。本研究获得了日本促进科学基金（JSPS KAKENHI）的资助，资助编号为16H05352和20H03642（授予MKS）；iPS细胞研究基金（授予CYL和MKS）；持田纪念医药研究基金会（授予MKS）；武田科学基金会（授予MKS）；以及日本医疗研究与开发署支持的“利用疾病特异性iPS细胞进行难治性疾病研究项目”的资助（资助编号17935400授予CYL和MKS，17935423授予MKS）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养基、生长因子和试剂 | 物品 | 品牌 | 货号 |
| 2-巯基乙醇 | Nacalai tesque | 21418-42 | |
| B27，Gibco | Gibco | 12587-001 | |
| BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
| 细胞解离液，Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
| 临界点干燥仪 | Hitachi | ES-2030 | |
| 多西环素 | Takara | 631311 | |
| 细胞外基质，Matrigel（生长因子减少型） | Corning | 356230 | |
| GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
| 凝胶化，IP凝胶 | Geno Staff | PG20-1 | |
| 离子溅射镀膜仪 | JEOL | JEC3000FC | |
| iPSC培养基，mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| KnockOut SR（KSR） | Gibco | 10828-028 | |
| 活细胞显微镜 | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| MEM-α | Gibco | 12571-071 | |
| 运动矢量分析软件 | Sony | SI8000 | |
| N2，Gibco | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal培养基 | Gibco | 21103-049 | |
| NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
| 灵长类动物ES细胞培养基 | ReproCell | RCHEMD001 | |
| SEM | Hitachi | S-4700 | |
| TEM | Hitachi | H7650 | |
| Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
| 抗体 | 品牌 | 货号 | 稀释比例 |
| Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
| Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
| 肌球蛋白重链（MYH） | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
| 神经丝蛋白（NF） | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
| S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
| 突触小泡蛋白2（SV2） | DSHB | SV2 | 1/50 |
| Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |
参考文献
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