肌肉葡萄糖摄取的完整调控对维持机体葡萄糖稳态至关重要。本方案介绍了在分离并孵育的成熟骨骼肌中，评估胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取方法，用于阐明各种生理干预对机体葡萄糖代谢的影响。
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摘要
摘要
骨骼肌是一种胰岛素响应性组织，通常在餐后摄取进入血液的大部分葡萄糖。此外，已有研究报道，与静息状态相比，骨骼肌在运动期间从血液中摄取葡萄糖的能力可增加高达50倍。运动和胰岛素刺激引起的肌肉葡萄糖摄取增加依赖于葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）从细胞内区室向肌细胞表面膜的转位，以及己糖激酶II将葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸的过程。m. soleus 和 m. extensor digitorum longus（EDL）等小鼠肌肉的分离与孵育是一种合适的离体模型，可用于研究胰岛素和电刺激收缩（运动的模型）对成熟骨骼肌葡萄糖摄取的影响。因此，该离体模型可用于评估肌肉的胰岛素敏感性，并能够在收缩过程中匹配肌肉力量输出，确保在测量肌肉葡萄糖摄取时肌纤维被均匀募集。此外，所述模型适用于测试可能影响肌肉胰岛素敏感性的药理化合物，也有助于解析骨骼肌葡萄糖摄取调控机制的复杂性。
本文介绍并提供了详细的实验方案，用于通过放射性标记的[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和作为细胞外标记物的[14C]甘露醇，测定分离后孵育的小鼠比目鱼肌和趾长伸肌组织中胰岛素刺激和收缩刺激的葡萄糖摄取。该方法可在排除完整动物模型中可能干扰因素的情况下，准确评估成熟骨骼肌的葡萄糖摄取。此外，我们还提供了关于孵育小鼠骨骼肌代谢活性的信息，提示该方法 在特定条件下研究肌肉能量代谢时存在某些局限性。
引言
骨骼肌具有在胰岛素和运动刺激下从细胞外空间大量摄取葡萄糖的能力。这一过程有助于维持全身葡萄糖稳态，并在能量需求较高时保障葡萄糖的供应。由于骨骼肌葡萄糖摄取的正常调控已被证实对整体健康和身体机能至关重要1,2在不同条件下对肌肉葡萄糖摄取的测量已受到广泛关注。在人体和动物研究中，高胰岛素-正常血糖钳夹技术已被用作评估体内胰岛素敏感性的金标准方法。3,4与口服葡萄糖耐量试验所得结果不同，高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术不依赖完整的胃肠道功能或胰腺胰岛素分泌，因此可在胃肠道和/或胰腺功能存在差异的受试者之间比较胰岛素反应。肌肉葡萄糖摄取的测量 自20世纪60年代以来，已在人体运动过程中频繁开展体内研究5首先通过动静脉平衡技术6 随后通过正电子发射断层扫描（PET）成像结合正电子发射型葡萄糖类似物（如 18F-氟脱氧葡萄糖7在啮齿类动物中，体内运动刺激的肌肉葡萄糖摄取通常通过使用放射性或稳定同位素标记的葡萄糖类似物来实现。8,9....
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方案
涉及实验动物的研究操作应遵循相关指南和当地法律法规。本研究中使用的所有动物实验均符合《欧洲实验和其他科学用途脊椎动物保护公约》，并已获得丹麦动物实验监察局的批准。
1. 实验装置与缝合环的制备
注意：本研究使用配备定制孵育钩的集成化肌肉条肌动图系统来孵育分离的小鼠骨骼肌（图1）。该系统可使肌肉浸浴于持续供氧（95% O2 和 5% CO2）并保持恒温的生理溶液中。肌肉组织浴槽连接力传感器，用于测量肌肉收缩期间产生的力量。为诱发并记录收缩过程中的肌机械反应，分别采用电脉冲刺激器和数据采集程序。通过位于肌肉中央及两侧的铂电极对孵育中的肌肉施加刺激以引发收缩。
- 开启肌动图系统并将温控室预热至 30 °C。打开与肌动图系统兼容的数据采集软件，并校准力传感器，以确保不同数据集之间的可比性。
- 首先剪取约 16 cm 长的不可吸收外科尼龙缝合线。用镊子将单股缝线弯成直径约 0.4 cm 的环状结构。重复此操作直至制备出足够数量的环。每块肌肉需要两个环，分别用于近端和远端肌腱。
2. 溶液与培养基的制备
- 基础孵育培养基的制备
- 配制以下储备液：2.5 M 氯化钠（N....
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结果
如图2所示，雌性小鼠分离的比目鱼肌和趾长伸肌的基础葡萄糖摄取速率相似。这一现象此前已被多次报道12,13,19,20。在亚最大有效胰岛素浓度（100 µU/mL）刺激下，比目鱼肌和趾长伸肌的葡萄糖摄取分别增加约0.8倍和约0.6倍，达到12和9 µmol/g蛋白/h。当使用最大有效胰岛素浓度（10 mU/mL）刺激时，葡萄糖摄取的增幅更为显著（比目鱼肌和趾长伸肌分别增加约4倍和约2倍，达到33和19 µmol/g蛋白/h）。此外，无论是亚最大还是最大浓度胰岛素刺激下的葡萄糖摄取，比目鱼肌均显著高于趾长伸肌，表明比目鱼肌相较于趾长伸肌具有更高的胰岛素敏感性和反应性。这可能与比目鱼肌中葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）以及胰岛素信号转导蛋白激酶B（Akt）的表达水平高.......
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讨论
骨骼肌葡萄糖摄取的完整调控对维持整体健康至关重要1。因此，在评估各种影响健康的干预措施时，常将肌肉葡萄糖摄取作为主要的观测指标。本文介绍一种离体方法，用于测量小鼠离体孵育的比目鱼肌和趾长伸肌在胰岛素和电刺激诱导收缩条件下的葡萄糖摄取。该方法快速、可靠，能够精确控制孵育肌肉周围环境，从而在排除血液中可能存在的激素和底物等混杂因素影响的情况下，准确研究肌肉葡萄糖摄取速率。该方法已被多个研究广泛采用多年，现已成为肌肉研究领域普遍接受的技术。
离体孵育模型通常被视为一种评估骨骼肌葡萄糖转运能力而非葡萄糖摄取的方法。通过测定一段时间内累积的D-葡萄糖，可确定孵育肌肉中的葡萄糖转运能力。然而，这种方法存在一个问题，即D-葡萄糖在被细胞摄取后会迅速在肌细胞内发生代谢。为克服这一问题，可采用葡萄糖类似物3-O甲基-D-葡萄糖（3-MG）已被广泛用于评估葡萄糖转运能力，因为3-MG在穿过细胞膜进入细胞后不会被进一步代谢。因此，细胞内3-MG的初始累积速率可作为细胞葡萄糖转运能力的指标 本身 因为其不受葡萄糖代谢途径中.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本研究得到了丹麦独立研究理事会—医学科学（FSS8020-00288B）和诺和诺德基金会（NNF160C0023046）的资助。此外，拉斯穆斯·克约布斯泰德（Rasmus Kjøbsted）还获得了由诺和诺德基金会资助的丹麦糖尿病学院的研究资助，项目编号为NNF17SA0031406。作者谨此感谢哥本哈根大学理学院营养、运动与健康系的卡琳娜·奥尔森（Karina Olsen）、贝蒂娜·博尔姆格伦（Betina Bolmgren）和艾琳·贝赫·尼尔森（Irene Bech Nielsen）提供的专业技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| [14C]D-甘露醇 | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-脱氧-D-葡萄糖 | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP 非无菌外科尼龙缝线 | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| 链霉亲和素/辣根过氧化物酶（偶联物） | DAKO | P0397 | 用于检测 ACC 蛋白 |
| Akt2 抗体 | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 抗体 | Santa Cruz | SC-19131 | |
| 抑肽酶 | Sigma | A1153 | |
| 苯甲脒 | Sigma | B6505 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A7030 | |
| CaCl₂ | Merck | 1020831000 | |
| 校准套件（力） | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| 化学发光试剂 | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-葡萄糖 | Merck | 1084180100 | |
| D-甘露醇 | Sigma | M4125 | |
| 数据采集程序 | National Instruments | LabVIEW 软件版本 7.1 | |
| 透析管 | Visking | DTV.12000.09 型号 No.9 | |
| 数字成像系统 | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| 电脉冲刺激器 | Digitimer | D330 MultiStim 系统 | |
| 甘油 | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| 胰岛素 | Novo Nordisk | Actrapid，100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH₂PO₄ | Merck | 104873025 | |
| 亮抑蛋白酶肽 | Sigma | L2884 | |
| MgSO₄ | Merck | 1058860500 | |
| 肌肉条张力测定系统 | Danish Myo Technology A/S | 型号 820MS | |
| 正钒酸钠 | Sigma | S6508 | |
| 焦磷酸钠 | Sigma | 221368 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO₃ | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 抗体 | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 抗体 | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 抗体 | Cell Signaling | 2531 | |
| 苯甲基磺酰氟 | Sigma | P7626 | |
| 铂电极 | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 抗体 | Cell Signaling | 8730 | |
| 闪烁计数器 | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| 闪烁液 | Perkin Elmer | 6013329 | |
| 统计分析软件 | Systat | SigmaPlot 版本 14 | |
| TBC1D4 抗体 | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 超纯水 | Merck | Milli-Q Reference A+ 系统 | |
| β-甘油磷酸 | Sigma | G9422 |
参考文献
- DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
- Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feed....
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