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方法文章

小鼠分离并孵育的成熟骨骼肌中胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取测定

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DOI：

10.3791/61398

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2021年5月16日

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1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

本文内容

摘要

肌肉葡萄糖摄取的完整调控对维持机体葡萄糖稳态至关重要。本方案介绍了在分离并孵育的成熟骨骼肌中，评估胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取方法，用于阐明各种生理干预对机体葡萄糖代谢的影响。

摘要

骨骼肌是一种胰岛素响应性组织，通常在餐后摄取进入血液的大部分葡萄糖。此外，已有研究报道，与静息状态相比，骨骼肌在运动期间从血液中摄取葡萄糖的能力可增加高达50倍。运动和胰岛素刺激引起的肌肉葡萄糖摄取增加依赖于葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）从细胞内区室向肌细胞表面膜的转位，以及己糖激酶II将葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸的过程。m. soleus 和 m. extensor digitorum longus（EDL）等小鼠肌肉的分离与孵育是一种合适的离体模型，可用于研究胰岛素和电刺激收缩（运动的模型）对成熟骨骼肌葡萄糖摄取的影响。因此，该离体模型可用于评估肌肉的胰岛素敏感性，并能够在收缩过程中匹配肌肉力量输出，确保在测量肌肉葡萄糖摄取时肌纤维被均匀募集。此外，所述模型适用于测试可能影响肌肉胰岛素敏感性的药理化合物，也有助于解析骨骼肌葡萄糖摄取调控机制的复杂性。

本文介绍并提供了详细的实验方案，用于通过放射性标记的[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和作为细胞外标记物的[14C]甘露醇，测定分离后孵育的小鼠比目鱼肌和趾长伸肌组织中胰岛素刺激和收缩刺激的葡萄糖摄取。该方法可在排除完整动物模型中可能干扰因素的情况下，准确评估成熟骨骼肌的葡萄糖摄取。此外，我们还提供了关于孵育小鼠骨骼肌代谢活性的信息，提示该方法 在特定条件下研究肌肉能量代谢时存在某些局限性。

引言

骨骼肌具有在胰岛素和运动刺激下从细胞外空间大量摄取葡萄糖的能力。这一过程有助于维持全身葡萄糖稳态，并在能量需求较高时保障葡萄糖的供应。由于骨骼肌葡萄糖摄取的正常调控已被证实对整体健康和身体机能至关重要1,2在不同条件下对肌肉葡萄糖摄取的测量已受到广泛关注。在人体和动物研究中，高胰岛素-正常血糖钳夹技术已被用作评估体内胰岛素敏感性的金标准方法。3,4与口服葡萄糖耐量试验所得结果不同，高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术不依赖完整的胃肠道功能或胰腺胰岛素分泌，因此可在胃肠道和/或胰腺功能存在差异的受试者之间比较胰岛素反应。肌肉葡萄糖摄取的测量 自20世纪60年代以来，已在人体运动过程中频繁开展体内研究5首先通过动静脉平衡技术6 随后通过正电子发射断层扫描（PET）成像结合正电子发射型葡萄糖类似物（如 18F-氟脱氧葡萄糖7在啮齿类动物中，体内运动刺激的肌肉葡萄糖摄取通常通过使用放射性或稳定同位素标记的葡萄糖类似物来实现。8,9,10.

一种与体内肌肉葡萄糖摄取测量方法互补的技术，是分离并孵育来自啮齿类动物的小块肌肉，随后使用放射性或稳定同位素标记的葡萄糖类似物来测定葡萄糖摄取量11,12,13该方法可对成熟骨骼肌的葡萄糖摄取速率进行准确且可靠的定量分析，并可在不同胰岛素浓度存在的情况下，以及通过电刺激诱导肌肉收缩的过程中进行。更重要的是，在研究经过各种干预（例如 营养、体力活动、感染、治疗）。分离的骨骼肌模型也是用于测试可能影响葡萄糖摄取的药理学化合物的合适工具。 本身 和/或调节胰岛素敏感性12,14通过这种方式，可在高度可控的环境中测试和评估旨在调节肌肉葡萄糖代谢的化合物的疗效，然后再在临床前动物模型中进行体内实验。

在某些条件下，离体孵育的骨骼肌模型系统中的代谢活力可能面临挑战。事实上，由于孵育肌肉缺乏循环系统，底物（例如 氧气和营养物质）的输送完全依赖于肌纤维与周围环境之间的简单扩散。因此，孵育的肌肉应尽可能小而薄，以减少孵育过程中氧气扩散的障碍15。尤其是在持续数小时的长时间孵育过程中，由于氧气供应不足，可能产生缺氧状态，导致肌肉能量耗竭15。尽管此前已有研究报道了孵育大鼠肌肉中多种代谢活力的指标，并确定了有助于维持大鼠肌肉活力的关键变量15，但对小型孵育小鼠肌肉的代谢活力进行全面评估仍十分必要。因此，目前主要采用糖原含量作为孵育小鼠骨骼肌代谢活力的指标16,17。

本文介绍了一种详细方案，用于通过放射性标记的[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇作为细胞外标记物。在本研究中，葡萄糖摄取的测量持续10分钟，本文展示了在亚最大和最大有效胰岛素浓度以及单次收缩方案下该方法的应用。然而，文中所述方案可轻松针对孵育时间、胰岛素剂量和电刺激方案进行调整。此外，我们对孵育后的小鼠比目鱼肌和趾长伸肌中多种代谢活性标志物进行了全面表征 肌肉。结果表明，在孵育缓冲液中添加葡萄糖对于维持肌肉在孵育1小时后的代谢活性至关重要。

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方案

涉及实验动物的研究操作应遵循相关指南和当地法律法规。本研究中使用的所有动物实验均符合《欧洲实验和其他科学用途脊椎动物保护公约》，并已获得丹麦动物实验监察局的批准。 

1. 实验装置与缝合环的制备

注意：本研究使用配备定制孵育钩的集成化肌肉条肌动图系统来孵育分离的小鼠骨骼肌（图1）。该系统可使肌肉浸浴于持续供氧（95% O2 和 5% CO2）并保持恒温的生理溶液中。肌肉组织浴槽连接力传感器，用于测量肌肉收缩期间产生的力量。为诱发并记录收缩过程中的肌机械反应，分别采用电脉冲刺激器和数据采集程序。通过位于肌肉中央及两侧的铂电极对孵育中的肌肉施加刺激以引发收缩。

  1. 开启肌动图系统并将温控室预热至 30 °C。打开与肌动图系统兼容的数据采集软件，并校准力传感器，以确保不同数据集之间的可比性。
  2. 首先剪取约 16 cm 长的不可吸收外科尼龙缝合线。用镊子将单股缝线弯成直径约 0.4 cm 的环状结构。重复此操作直至制备出足够数量的环。每块肌肉需要两个环，分别用于近端和远端肌腱。

2. 溶液与培养基的制备

  1. 基础孵育培养基的制备
    1. 配制以下储备液：2.5 M 氯化钠（NaCl，250 mL）、0.5 M 碳酸氢钠（NaHCO₃，200 mL）3，250 mL），0.5 M 氯化钾（KCl，50 mL），0.25 M 氯化钙（CaCl2，50 mL），0.25 M 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4，50 mL），0.25 M 硫酸镁（MgSO₄）4，50 mL）、110 mM 丙酮酸钠（Na-Pyruvate，100 mL）、500 mM D-甘露醇（100 mL）、1 M 2-脱氧-D-葡萄糖（4 mL）、15% 牛血清白蛋白（BSA）溶液（用 Krebs-Ringer-Henseleit（KRH）缓冲液透析，透析方法见下文步骤4）（100 mL）。
      ​注意：测量静息状态和收缩刺激下的葡萄糖摄取需要两种溶液。此外，每一种用于评估胰岛素刺激下葡萄糖摄取的单一胰岛素浓度均需要两种溶液。因此，总共需要六种不同的溶液，以分别测量离体小鼠骨骼肌的基础状态、亚最大浓度胰岛素刺激、最大浓度胰岛素刺激以及肌肉收缩刺激下的葡萄糖摄取。以下所述中，“基础孵育液”指不含胰岛素或放射性示踪剂的孵育液；“孵育液”指含有胰岛素的孵育液；“葡萄糖摄取孵育液”指在与“孵育液”相同胰岛素浓度的基础上，额外添加2-脱氧-D-葡萄糖和放射性示踪剂的孵育液。
    2. 通过在超纯水（ddH₂O）中添加组分来配制 KRH 缓冲液2O) 与 NaCl（117 mM）、NaHCO₃3 （24.6 mM）、KCl（4.7 mM）、CaCl2 （2.5 mM），KH2PO4 （1.2 mM）和 MgSO₄4 （1.2 mM）。随后，用95% O₂2 和 5% CO2 至少10分钟。KRH缓冲液在30 °C时的理想pH值应为7.35–7.45。若在室温下进行pH值调节，则KRH缓冲液的pH值应为7.25–7.35。
    3. 向已通气并调节pH值的KRH缓冲液中加入BSA（0.1%）、Na-丙酮酸盐（2 mM）和D-甘露醇（8 mM），以配制基础孵育培养基。将基础孵育培养基储存于密封容器中，以尽量减少O₂的脱气。2 和 CO2 并将培养基置于30 °C。
      注意：通常情况下，KRH 补充剂的渗透压（即 Na-丙酮酸、D-甘露醇和D-葡萄糖）在整个实验过程中保持恒定，以避免肌细胞收缩或膨胀。本方案中所述方法使用10 mM的KRH添加剂渗透浓度。若需含葡萄糖的缓冲液，可调整KRH添加剂以满足需求，例如使用5 mM D-葡萄糖和5 mM D-甘露醇。
    4. 为避免孵育缓冲液中可能存在的牛血清白蛋白（BSA）相关污染物，需将 BSA 对 KRH 缓冲液进行透析。
      1. 配制用KRH缓冲液透析的15% BSA储备液时，首先将300 g分析纯无脂BSA溶解于900 mL KRH缓冲液中。接着，将透析管在重蒸水中煮沸，直至透析管变软。
      2. 用 BSA-KRH 溶液填充管道并固定管道两端。将装有 BSA-KRH 的管道置于 5 L KRH 缓冲液中，于 4 °C 静置过夜。次日更换 KRH 缓冲液，将装有 BSA-KRH 的管道继续置于 KRH 缓冲液中，于 4 °C 静置过夜。
      3. 最后，收集管路中的BSA-KRH溶液，并加入KRH缓冲液至终体积为2 L（即15% BSA-KRH储存溶液）。 将15% BSA-KRH储备液分装成若干份，于约-20 °C冷冻保存。
  2. 含胰岛素培养基的制备
    1. 对于含有亚最大有效浓度胰岛素的孵育培养基，每毫升基础孵育培养基中加入1 µL的100 mU/mL胰岛素储备液（终浓度为100 µU/mL胰岛素）。
    2. 对于含有最大有效胰岛素浓度的孵育培养基，每毫升基础孵育培养基中加入1 µL的10 U/mL胰岛素储备液（终浓度为10 mU/mL胰岛素）。
  3. 葡萄糖摄取孵育培养基的制备
    警告：放射性物质的操作仅允许经授权的人员在受限且受控的区域内进行，部分大学、研究机构和公司可能要求取得相关许可。 "放射性物质使用许可证"材料和废弃物的处理必须遵循相应的当地程序、指南和法律法规。
    1. 按照第 2.1.2 节所述的相同步骤进行操作。
    2. 向充气并调节pH值的KRH缓冲液中加入BSA（0.1%）、Na-丙酮酸盐（2 mM）、D-甘露醇（7 mM）和2-脱氧-D-葡萄糖（1 mM）。
    3. 添加 [3H]2-脱氧-D-葡萄糖（0.028 MBq/mL）和[14C]甘露醇（0.0083 MBq/mL）加入补充KRH缓冲液中，配制完成葡萄糖摄取孵育液。于30 °C保存。如果[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇溶于乙醇后，通过氮气去除乙醇2 使用前经介导蒸发处理。
    4. 在含有亚最大有效浓度胰岛素的葡萄糖摄取孵育培养基中，每毫升葡萄糖摄取孵育培养基加入1 µL的100 mU/mL胰岛素储备液（终浓度为100 µU/mL胰岛素）。
    5. 对于含有最大有效胰岛素浓度的葡萄糖摄取孵育培养基，每毫升葡萄糖摄取孵育培养基中加入 1 µL 的 10 U/mL 胰岛素储备液（终浓度为 10 mU/mL 胰岛素）。

3. 用于孵育的小鼠比目鱼肌和趾长伸肌的动物准备与解剖

注意：涉及实验动物的研究操作应遵循相关指南和当地法律法规。所述操作可用于实验室自繁或商业获取的多种品系和遗传背景的雄性和雌性小鼠。以下操作以饲喂状态的雌性 C57Bl/6J 小鼠为例。小鼠平均年龄为 19 周，体重为 25 g。小鼠饲养于 12 小时光照-12 小时黑暗循环环境中，可自由摄取标准啮齿类动物饲料和水。动物实验在当地时间约上午 9:00 开始，所有动物均在 2 小时内完成处死。

  1. 向每个孵育室中加入 4 mL 预热（30°C）的基础孵育培养基，并确保基础孵育培养基持续以 95% O2 和 5% CO2 进行氧合。
  2. 通过腹腔注射戊巴比妥（10 mg/100 g 体重）或其他可用麻醉剂（例如 三溴乙醇）对小鼠进行麻醉。
    ​注意：请注意，在某些国家，操作戊巴比妥及其他麻醉药物可能需要持有许可证。在开始肌肉解剖前，必须确保每只动物均已正确进入麻醉状态。为此，需测试尾部和腿部反射。为获得最佳效果，解剖操作应经过充分练习，以避免在取出过程中 损伤肌肉。
  3. 将麻醉后的小鼠俯卧于解剖托盘（例如 聚苯乙烯泡沫盖）上，并根据需要使用针固定前肢和后肢。
  4. 去除小腿部位的皮肤，并确保跟腱和膝关节均清晰可见。
    1. 解剖比目鱼肌时，首先在跟腱上系一个单线环。在线环远端将止血钳固定于跟腱，并剪断以释放比目鱼肌和腓肠肌。小心地沿小鼠身体滑动止血钳，从而暴露比目鱼肌。
    2. 固定止血钳，并在比目鱼肌近端肌腱处放置第二个线环。随后剪断近端肌腱，将比目鱼肌（包括两个附着的线环）从腓肠肌中完整分离。迅速将比目鱼肌放入孵育室，将每个线环分别固定在相应的挂钩上。
  5. 使用镊子去除覆盖在胫前肌（m. tibialis anterior，TA）上的筋膜。若操作正确，TA 肌与 EDL 肌的远端肌腱应呈清晰的白色，彼此分离且清晰可见。
  6. 剪断 TA 肌的远端肌腱，并将其完整取出用于后续分析（例如 基因分型）。使用镊子轻轻分离 EDL 肌周围的组织，但保持肌肉完整，不要剪断肌腱。在 EDL 肌远端肌腱处放置一个线环，在近端肌腱处放置第二个线环。
  7. 随后剪断肌腱，使 EDL 肌带有两个附着的线环被释放，并迅速将其放入孵育室，将每个线环分别固定在相应的挂钩上。为防止在孵育期间，尤其是在电刺激诱导比目鱼肌和 EDL 肌收缩过程中失去张力，必须将线环在肌腱上牢固打结固定。
  8. 最后，通过例如颈椎脱位法处死动物。
  9. 当肌肉被解剖并放置于孵育室后，将每块肌肉的静息张力调整至约 5 mN，并在启动实验方案前至少预孵育 10 分钟。

4. 胰岛素刺激下分离的小鼠骨骼肌葡萄糖摄取

  1. 步骤3.9之后 将基础孵育培养基更换为不含胰岛素的基础孵育培养基、含亚最大有效浓度胰岛素的孵育培养基或含最大有效浓度胰岛素的孵育培养基，放入孵育室中孵育20分钟。每个孵育室间隔1分钟放置，以便后续依次收获肌肉组织。
  2. 在20分钟刺激期结束时，将孵育液更换为含有相同浓度胰岛素的葡萄糖摄取孵育液，并将样本继续置于孵育腔中孵育10分钟，各孵育腔之间仍保持1分钟的时间间隔。
  3. 孵育10分钟后，从孵育室中轻轻取出肌肉，并用预冷的基础孵育液洗涤。随后，将肌肉在滤纸上快速吸干，剪除缝线环后立即置于液氮中速冻。若需在检测葡萄糖摄取的同时进一步分析各种细胞内代谢物及蛋白质信号通路，则必须迅速采集孵育后的肌肉组织。
  4. 从每个孵育室中收集 100 µL 葡萄糖摄取孵育液，并于 -20 °C 保存。这些样品中的放射性计数将用于肌肉葡萄糖摄取量的计算。

5. 离体小鼠骨骼肌收缩刺激的葡萄糖摄取

注意：为诱导分离的小鼠骨骼肌收缩，请使用以下方案：每15秒给予1次刺激，每次刺激持续1秒，由持续0.2毫秒、频率100赫兹的脉冲组成。然而，其他类似的能够诱导分离小鼠骨骼肌收缩的刺激方案也可能有效。重要的是，应调整电压以使孵育中的肌肉产生最大收缩力，该参数取决于具体的实验装置。若未确保达到最大收缩力，则可能存在肌肉中并非所有纤维均发生收缩的风险，进而可能引入数据偏差。

  1. 步骤 3.9 之后 将铂电极置于肌肉两侧中央位置。在用葡萄糖摄取孵育液替换基础孵育液后，立即启动肌肉收缩。若条件允许，每次孵育间隔1分钟，以便后续依次收获肌肉。务必记录每块孵育肌肉的张力产生情况。
  2. 在葡萄糖摄取孵育液中收缩10分钟后，移除铂电极，轻轻从孵育室中取出肌肉，并用预冷的基础孵育液清洗。随后，将肌肉在滤纸上迅速吸干，去除缝线环后立即在液氮中冷冻。整个肌肉采集过程应尽可能快速完成。
  3. 从每个孵育腔室中收集 100 µL 葡萄糖摄取孵育液，并于 -20 °C 保存。这些样品中的放射性计数将用于肌肉葡萄糖摄取率的计算。

6. 骨骼肌组织匀浆与处理

注意： 以下肌肉匀浆处理步骤可实现利用同一批肌肉样本，通过蛋白质印迹法同时检测葡萄糖摄取和肌细胞内信号通路。

  1. 使用钢珠和组织破碎仪（在30 Hz条件下处理2次，每次45 秒），在400 µL冰浴、pH 7.5的缓冲液中均质化每块肌肉组织。缓冲液含有10%甘油、20 mM焦磷酸钠、1% IGEPAL CA-630（NP-40）、2 mM苯甲基磺酰氟（溶于异丙醇）、150 mM NaCl、50 mM HEPES、20 mM β-甘油磷酸钠、10 mM氟化钠（NaF）、1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、1 mM乙二醇双（2-氨基乙基）四乙酸（EGTA）、10 µg/mL抑肽酶、10 µg/mL亮抑蛋白酶肽、3 mM苯甲脒和2 mM正钒酸钠。所有匀浆样品在4 °C下旋转（端对端）孵育1小时，随后在4 °C下以16,000 ×g离心20分钟。收集上清液（裂解物），用于测定肌肉组织葡萄糖摄取。

7. 放射性标记的2-脱氧葡萄糖和甘露醇的测定

  1. 将每种肌肉裂解液各150 µL，以及每个孵育腔室中的葡萄糖摄取孵育液各25 µL，分别加入含有2 mL液体闪烁液的液体闪烁计数小瓶中。此外，准备两个空白对照小瓶，仅含3 mL液体闪烁液。盖紧所有小瓶，通过涡旋振荡约5秒，充分混匀。
  2. 将小瓶放入液体闪烁计数器中，根据制造商的指南测定[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇的放射活性。记录每个液体闪烁小瓶的DPM（每分钟衰变数）。

8. 肌肉葡萄糖摄取速率的计算

  1. 使用步骤6.1获得的裂解液，采用标准蛋白质定量方法（如二辛可宁酸法或Bradford法）测定每份肌肉样本中的总蛋白浓度。计算加入每个闪烁瓶中的蛋白量（mg）。
    注意：每份肌肉样本的葡萄糖摄取速率通过从总摄取量中减去[3H]2-脱氧-D-葡萄糖位于细胞外空间的量占总量的比例3使用[³H]2-脱氧-D-葡萄糖测定肌肉样品中的葡萄糖摄取14C]甘露醇作为细胞外标记物。假设[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇在孵育期间于肌肉组织中表现出相似的扩散特性。进行以下计算：
  2. 首先减去[3H] 和 [14C] 所有肌肉和培养基样本的盲法对照样品的每分钟衰变数（DPM）。
  3. 测定肌肉细胞外液空间（µL-ECS，单位为 µL）：
    [14C]DPM肌肉 / ([14C]DPM培养基 / M体积)
  4. 计算 [3肌肉细胞外空间中的[H]DPM浓度([3H]DPMECS):
    µL-ECS × ([3H]DPM培养基 / M体积)
  5. 计算 [3肌肉细胞内空间中的[H]DPM（[3H]DPMICS):
    [3H]DPM肌肉− [3H]DPMECS
  6. 计算肌肉葡萄糖摄取率（µmol / g 蛋白质 / 小时）：
    [3H]DPMICS / ([3H]DPM培养基 / M体积) / [2-脱氧-D-葡萄糖])) / mg 蛋白质) / Th
    注意：对于上述所有公式，
    [14C]DPM肌肉 是[的量14肌肉样品中的甘露醇放射性活度；
    [14C]DPM培养基 是[的量14C]甘露醇在培养基样品中的放射活性；
    [3H]DPM肌肉 是[的量3肌肉样品中[H]2-脱氧-D-葡萄糖的放射性活性；
    [3H]DPM培养基是[的量3培养基样品中[H]2-脱氧-D-葡萄糖的放射活性；
    [3H]DPMECS 是[的量3肌肉细胞外空间中[H]2-脱氧-D-葡萄糖的放射活性；
    [3H]DPMICS 是[的量3肌肉细胞内空间中的[H]2-脱氧-D-葡萄糖放射性；
    µL-ECS 是以 µL 为单位的肌肉细胞外空间；
    M卷 是用于闪烁计数的孵育培养基体积（µL）（例如上述的“25”）；
    Th 是用于计算每小时摄取速率的时间因子（例如，当肌肉与葡萄糖摄取培养基孵育10分钟时，该因子为“1/6”）
  7. 请考虑以下示例计算。该[3H] 和 [14C] 盲法对照样品（分别为17和6）的DPM值已从下述DPM值中扣除。
    [14C]DPM肌肉: 343
    [14C]DPM培养基: 11846
    [3H]DPM肌肉: 4467
    [3H]DPM培养基: 39814
    M体积: 25
    mg 蛋白质：0.396（在 150 µL 肌肉蛋白裂解液中）
    [2-脱氧-D-葡萄糖]：1 (mM)
    Th1/6 (h)
    µL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 µL) = 0.724 µL
    [3H]DPMECS0.724 µL × (39814 DPM / 25 µL) = 1153 DPM
    [3H]DPMICS3314 DPM
    葡萄糖摄取率：((3314 DPM / (39814 DPM / 25 µL) / 1 mmol/L) / 0.396 mg 蛋白质) / (1/6 小时) = 31.53 µmol / g 蛋白质 / 小时

9. SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析

  1. 用Laemmli缓冲液制备比目鱼肌和趾长伸肌组织裂解液，并于96 °C加热5分钟。
  2. 将等量的肌肉蛋白通过自制SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，随后采用半干法转膜将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
  3. 随后，将膜置于含0.05% Tween 20和2%脱脂奶粉的Tris缓冲盐溶液中孵育，并用相应的特异性一抗和二抗进行杂交检测。
  4. 使用化学发光法检测目标蛋白，并通过数字成像系统进行可视化分析。

10. 肌肉糖原、核苷酸、乳酸、肌酸和磷酸肌酸

  1. 使用高氯酸提取EDL和比目鱼肌肌肉样本。
  2. 随后中和样本，并按照先前所述方法分析乳酸、肌酸和磷酸肌酸含量18。
  3. 通过反相高效液相色谱法（HPLC）分析经高氯酸提取后的EDL和比目鱼肌肌肉中的核苷酸含量。
  4. 采用荧光法测定全肌肉匀浆中经酸水解后的糖基单位，以确定肌肉糖原含量，具体方法如前所述18。

11. 统计学

  1. 使用统计分析软件进行统计分析。
  2. 采用双因素方差分析（ANOVA）检验评估表1中数据之间的统计学差异。
  3. 采用非配对Student t 检验评估每组中EDL与比目鱼肌之间葡萄糖摄取的统计学差异，结果见图2。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。

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结果

如图2所示，雌性小鼠分离的比目鱼肌和趾长伸肌的基础葡萄糖摄取速率相似。这一现象此前已被多次报道12,13,19,20。在亚最大有效胰岛素浓度（100 µU/mL）刺激下，比目鱼肌和趾长伸肌的葡萄糖摄取分别增加约0.8倍和约0.6倍，达到12和9 µmol/g蛋白/h。当使用最大有效胰岛素浓度（10 mU/mL）刺激时，葡萄糖摄取的增幅更为显著（比目鱼肌和趾长伸肌分别增加约4倍和约2倍，达到33和19 µmol/g蛋白/h）。此外，无论是亚最大还是最大浓度胰岛素刺激下的葡萄糖摄取，比目鱼肌均显著高于趾长伸肌，表明比目鱼肌相较于趾长伸肌具有更高的胰岛素敏感性和反应性。这可能与比目鱼肌中葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）以及胰岛素信号转导蛋白激酶B（Akt）的表达水平高...

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讨论

骨骼肌葡萄糖摄取的完整调控对维持整体健康至关重要1。因此，在评估各种影响健康的干预措施时，常将肌肉葡萄糖摄取作为主要的观测指标。本文介绍一种离体方法，用于测量小鼠离体孵育的比目鱼肌和趾长伸肌在胰岛素和电刺激诱导收缩条件下的葡萄糖摄取。该方法快速、可靠，能够精确控制孵育肌肉周围环境，从而在排除血液中可能存在的激素和底物等混杂因素影响的情况下，准确研究肌肉葡萄糖摄取速率。该方法已被多个研究广泛采用多年，现已成为肌肉研究领域普遍接受的技术。

离体孵育模型通常被视为一种评估骨骼肌葡萄糖转运能力而非葡萄糖摄取的方法。通过测定一段时间内累积的D-葡萄糖，可确定孵育肌肉中的葡萄糖转运能力。然而，这种方法存在一个问题，即D-葡萄糖在被细胞摄取后会迅速在肌细胞内发生代谢。为克服这一问题，可采用葡萄糖类似物3-O甲基-D-葡萄糖（3-MG）已被广泛用于评估葡萄糖转运能力，因为3-MG在穿过细胞膜进入细胞后不会被进一步代谢。因此，细胞内3-MG的初始累积速率可作为细胞葡萄糖转运能力的指标 本身 因为其不受葡萄糖代谢途径中...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

本研究得到了丹麦独立研究理事会—医学科学（FSS8020-00288B）和诺和诺德基金会（NNF160C0023046）的资助。此外，拉斯穆斯·克约布斯泰德（Rasmus Kjøbsted）还获得了由诺和诺德基金会资助的丹麦糖尿病学院的研究资助，项目编号为NNF17SA0031406。作者谨此感谢哥本哈根大学理学院营养、运动与健康系的卡琳娜·奥尔森（Karina Olsen）、贝蒂娜·博尔姆格伦（Betina Bolmgren）和艾琳·贝赫·尼尔森（Irene Bech Nielsen）提供的专业技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
[14C]D-甘露醇American Radiolabeled Chemicals, Inc.ARC 0127
[3H]2-脱氧-D-葡萄糖 American Radiolabeled Chemicals, Inc.ART 0103A
2-脱氧-D-葡萄糖SigmaD8375
4-0 USP 非无菌外科尼龙缝线Harvard Apparatus51-7698
链霉亲和素/辣根过氧化物酶（偶联物）DAKOP0397用于检测 ACC 蛋白
Akt2 抗体Cell Signaling3063
AMPKα2 抗体Santa CruzSC-19131
抑肽酶SigmaA1153
苯甲脒SigmaB6505
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA7030
CaCl₂Merck1020831000
校准套件（力）Danish Myo Technology A/S300041
化学发光试剂MilliporeWBLUF0500
D-葡萄糖Merck1084180100
D-甘露醇SigmaM4125
数据采集程序National InstrumentsLabVIEW 软件版本 7.1
透析管ViskingDTV.12000.09 型号 No.9
数字成像系统BioRadChemiDoc MP
EDTASigma EDSE9884
EGTASigmaE4378
电脉冲刺激器DigitimerD330 MultiStim 系统
甘油SigmaG7757
HEPESSigmaH7637
IGEPAL CA-630 SigmaI8896
胰岛素Novo NordiskActrapid，100 IE/mL
KClMerck1049361000
KH₂PO₄Merck104873025
亮抑蛋白酶肽SigmaL2884
MgSO₄Merck1058860500
肌肉条张力测定系统Danish Myo Technology A/S型号 820MS
正钒酸钠SigmaS6508
焦磷酸钠Sigma221368
丙酮酸钠SigmaP2256
NaClMerck106041000
NaFSigmaS1504
NaHCO₃VWR27778260
pACC Ser212 抗体Cell Signaling3661
pAkt Thr308 抗体Cell Signaling9275
pAMPK Thr172 抗体Cell Signaling2531
苯甲基磺酰氟SigmaP7626
铂电极Danish Myo Technology A/S300145
pTBC1D4 Ser588 抗体Cell Signaling8730
闪烁计数器Perkin ElmerTri-Carb-2910TR
闪烁液 Perkin Elmer6013329
统计分析软件SystatSigmaPlot 版本 14
TBC1D4 抗体Abcamab189890
TissueLyser II Qiagen85300
超纯水MerckMilli-Q Reference A+ 系统
β-甘油磷酸SigmaG9422

参考文献

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