功能性与极化胆囊肿的生成与定量特征

Summary

三维（3D）细胞系统是研究器官生成的相关模型。提出了一种基于水凝胶的胆囊肿产生及其表征方法。该协议通过一种简单可靠的方法来评估囊肿形成效率、尺寸并测试其功能，解开了 3D 表征的障碍。

Abstract

胆结细胞，在肝脏中排行胆管的上皮细胞，监督胆汁的形成和修饰。近二十年来，在肝脏疾病的背景下，基于胆血管细胞的三维（3D）模型已经出现，如囊肿、球状体或管状结构，以模拟组织拓扑进行器官生成、疾病建模和药物筛选研究。这些结构主要是通过在水凝胶中嵌入胆血管细胞获得的。主要目的是通过解决上皮极性、功能性和形态特性来研究自组织性。然而，很少有研究侧重于囊肿形成效率。在这种情况下，效率通常从单个平面的图像中量化。进行功能测定和结构分析时不表示水凝胶聚合异质性和副作用引起的囊肿分布的潜在异质性。因此，定量分析一完成，不能用于比较一个条款到另一个。此外，此方法不允许比较不同矩阵和细胞类型的 3D 增长潜力。此外，没有提及免疫抑制囊肿的实验故障排除。本文提供了一种可靠而通用的方法，表明初始细胞分布与囊肿形成的异质垂直分布有关。在10天的时间过程中，沿水凝胶深度进行Z-堆栈分析，随后对嵌入在水凝胶中的胆血管细胞细胞进行跟踪分析。该方法可获得囊肿形成效率和生长的强健动力学。我们还提出了评估囊肿极性和分泌函数的方法。最后，还提供了优化免疫抑制方案的其他提示，以限制成像的囊肿崩溃。这种方法可以应用于其他三D细胞培养研究，从而打开将一个系统与另一个系统进行比较的可能性。

Introduction

近三十年来，体外研究领域向3D培养系统发展。出现了许多协议，用于在支架/矩阵存在或不存在的情况下，在一滴、搅拌、微流体装置或浮式 1 中，将 3D 中的细胞培养为^{球体或聚合}体。3D 培养方法的使用已经证明了其比二维 （2D） 培养物的优势，尤其是上皮细胞，这些细胞在 3D 结构（称为囊肿或囊肿）中表现出自组织。在这种情况下，细胞形成一个包围流明的单层，其中细胞获得其完整的上皮表型与改善的生理特异性功能^2。

许多研究有助于开发在自然基质中形成这些上皮器官的方法。这允许重新综述体内细胞和细胞-微环境相互作用，得到上皮表型^{3，4，5，6，7}的建立^和稳定性。最近，特别是为了开发可移植器官和破译微环境对上皮程序的要求，开发了合成水凝胶，以增强上皮^8、9、10的形成。不幸的是，这些研究报告定性数据，或目前计算方法使用内部参考，如囊肿与非囊肿的比例在2D平面^{8，9，10。}这排除了上皮器官的效率、稳定性或形态和生理表征方面的不同研究之间的任何比较。

使用微流体装置对珠子上皮细胞进行微封装，取得了更逼真的定量和比较结果。利用这项技术，根据不同3D细胞结构^11、12的形态，形成并分化了不同细胞类型的^器官。然而，这项技术不容易使用，需要使用洁净室来生产微流体设备。这项技术已为几种水凝胶建立，但需要技术适应才能应用于其他水凝胶，从而限制其多功能性。因此，大多数旨在开发上皮器官的研究都依赖于将上皮细胞嵌入到水凝胶中。在这些方法中，整个三生培养培养中凝胶结构和细胞分布的高异质性往往被忽视。因此，大多数分析都与单个 2D 图像相关，这些图像仅非常粗略地表示整个 3D 体积中各种蜂窝对象的分布。

影响胆管的疾病，如胆管癌、胆道炎、原发性鼻窦炎等，是导致死亡和发病的主要原因。除了肝移植，没有有效的治疗方法，这些情况^13。努力调查胆管的形成，疾病的原因，和进展将允许开发新的疗法^14。

使用正常或患者衍生、分化或祖传细胞系的囊肿、球状体或管状结构的胆管状模型已开发15、16、17、18、19、20。各种研究有重述胆血管细胞极性，胆血管细胞标记的表达，胆碱的存在，胆血管细胞分泌和再吸收能力，以及流明的形成和阻塞;所有这些都代表了胆血管细胞表型、形态学和功能^{15、17、19的重要特征}。其他人报告说，维持患者衍生的胆道器官长时间^20。最近，我们调查了生化和生物物理线索对胆囊肿器官形成^{21中的作用}。重要的是，在胆道球类和管7，22中研究了胆道^{间闭塞的发病机。}此外，还利用胆道球体^15、20成功研究了主性胆囊炎的主要特征，如胆管细胞衰老、亲炎细胞因子的分泌^以及巨噬细胞的^招募。然而，在生理上调节胆血管细胞表型、生理学和微环境的可重复体外三维定量模型仍需要解决这些问题。此外，只有少数出版物报告囊肿形成效率^21，23。这是一个重要点，特别是在调查器官发生，疾病原因，以及药物反应与胆血管细胞功能和极化的相关性。此外，由于从协议到协议使用的基架/矩阵存在差异，因此很难在系统之间进行比较。为了解决这些问题，我们提出了一种定量、可靠和通用的方法，用于产生一种模拟流明形成、胆血管细胞极化和胆血管细胞分泌功能的胆道囊肿。重要的是，在评估随时间、囊肿形成效率、尺寸、可行性、极化和功能时，我们通过 3D 凝胶沿 Z 轴进行系统分析。此外，我们使用天然水凝胶和普通大鼠胆结细胞（NRC）作为协议的例子，但其他天然或合成水凝胶，以及上皮细胞可用于形成三维囊结构。

Protocol

1. 囊肿的生成

注:如果凝胶允许嵌入细胞，则此协议可与任何类型的水凝胶一起执行。

1. 水凝胶涂层
   注:室滑道适当的水凝胶涂层是避免在井底形成 2D 细胞层的关键步骤，这可能会干扰后续囊肿成像并影响囊肿形成效率的计算。
   1. 为确保凝胶溶液的均匀性，在4°C（O/N）下解冻水凝胶。
   2. 在 -20 °C 下，在冰或 O/N 上预冷移液器尖端，在 -20°C O/N 下使用 8 井室滑动器。
   3. 将水凝胶和 8 井室滑轨放在装满冰的冰桶上。
   4. 在 15 mL 锥形管中，在冷 NRC 完整介质中准备含有 40% 水凝胶 （V/V） 的溶液（参见材料 表），然后将管放在冰上。
   5. 要涂上腔室滑轨，使用冷移液器尖端，在每一个井的中心添加50μL的水凝胶溶液，并使用移液器尖端铺向整个表面，同时将腔室滑轨放在冰上（图1A）。
      注:尽可能均匀地摊开水凝胶溶液，避免气泡。
   6. 要聚合水凝胶，在37°C、5%CO 2下孵育腔室滑_轨至少15分钟。
2. 细胞制备
   1. 在水浴预热NRC完整介质、磷酸盐缓冲盐水（PBS）和三聚氰胺四乙酸（三聚氰胺-EDTA）中预热至37°C。
   2. 当水凝胶聚合时，确保NRC在T-25厘米2胶原蛋白涂层烧瓶²¹ 中生长到70%的^汇合。用预热的1xPBS清洗细胞一次。
   3. 用5 mL预热1x PBS（T-25厘米2瓶）在37°C下孵育NRCs20分钟，5%CO₂。
      注:此步骤缩短了与三普辛-EDTA的孵育时间，有助于保持细胞的自组织特性。
   4. 丢弃PBS，加入1 mL的三辛-EDTA，并在37°C下孵育5-10分钟，5%的_CO2。
   5. 使用 4 mL 预热完整 NRC 介质中和。收集并转移电池悬浮液到15 mL锥形管中，以150 x g旋转 4分钟。
   6. 丢弃介质，将细胞颗粒重新在 5 mL 预热介质中。
   7. 使用 40 μm 细胞过滤器，将细胞溶液过滤到 50 mL 锥形管中并计算细胞数。
      注:通过过滤器传递细胞是定量结果可重复的关键步骤，即要嵌入几乎相似大小的细胞聚合。
3. 在水凝胶溶液中嵌入细胞悬浮液
   1. 在冷完整 NRC 介质（管 1）中制备 1，600 μL 80% 水凝胶 （V/V） 的溶液;留在冰上。在1，600μL的冷完整NRC介质（管2）中稀释5 x 10⁵ 细胞/mL，并留在冰中。
      注:必须快速执行此步骤，以避免水凝胶聚合，同时与细胞悬浮液混合，并保持细胞活力。
   2. 在40%水凝胶（V/V）中，在2.5 x^{10 5 5} 细胞/mL中准备细胞播种溶液，混合管1和管2。将 400 μL 的电池溶液加入水凝胶涂层腔滑轨的每个井中，避免气泡（图 1B）。
   3. 将腔室幻灯片保持在 37 °C 的培养箱中，用 5% CO_2， 直到介质发生变化。
   4. 培养2天后，从每一个井的一角取出250μL的介质，小心不要移液出水凝胶。然后，慢慢添加250μL的培养介质。每 2 天更换一次介质。
      注:尽量减少腔室滑轨的移动，尤其是在囊肿启动期间。

2. 囊肿定量

1. 囊肿成像
   注:如果显微镜没有配备加热室来控制CO 2和温度，应快速执行此部分，不_损害细胞 的生存能力。为了确保一致的定量，代表囊肿分布在全水凝胶体积，囊肿通过相位对比显微镜和串行成像（Z堆栈），与预定义的参数在不同的时间点成像。
   1. 沿每个时间点水凝胶的深度进行 Z 堆栈（图1C，D）。在此示例中，Z 堆栈在第 1 天、第 2 天、第 4 天、第 7 天和 10 天进行。
      注:检查初始细胞分布在水凝胶中是否均匀，以确保此方法的适用性。
      1. 使用配备图像采集软件的相位对比显微镜，在手动鼻片垫窗口中选择 10 倍的客观放大倍率（图 2B（1）。
      2. 打开白灯并选择亮场成像选项。
      3. 通过选择条形子菜单中的"播放"按钮打开相机。聚焦囊肿领域并设置暴露时间（图2B（2）。打开自动 捕获文件夹 窗口以自动保存图像（图 2B（3）。
      4. 打开捕获 Z 系列窗口，用 Z 螺钉定义 Z 堆栈的顶部和底部平面（相同的 XY 坐标，但不同的 Z 屏蔽）。根据目标、分辨率级别调整 Z 步数，然后按下按钮"现在运行"以启动采集（图 2B（4）。
         注:在此示例中，囊肿分布在 520 μm 的水凝胶厚度上。根据目标，应调整Z步，不错过任何囊肿，并确保检测单细胞和聚合。
      5. 每井至少进行 3 个非重叠 Z 堆栈。
         注:当（如本示例中）由于水凝胶聚合中的异质性，凝胶深度中的囊肿比边缘的囊肿数量更多时，此采样是必要的。
      6. 为了有代表性数据集，重复步骤 2.1.1.5。总共3口井。
         注:囊肿的异质分布取决于水凝胶的类型、其聚合和细胞系。考虑到每孔三个 Z 堆栈和每个实验三个孔，至少 200 个囊肿被成像在 9 个 Z 堆栈上，以描述每个时间点囊肿的形成和囊肿生长。
2. 图像处理
   注:在水凝胶中，NRC可作为单细胞、囊肿或聚合体找到。囊肿通过包围流明的圆形和薄对比细胞壳的存在来识别，而细胞聚合体呈现不规则的形状，并且没有流明。聚合和单个细胞具有密集和对比的外观（图3B（4）。
   1. 打开斐济软件，打开 Z 堆栈，转到斐济菜单，然后单击"文件 +打开"（补充图 1）。选择要分析的 Z 堆栈。如果需要，选择"虚拟堆栈"选项，然后单击"是"以打开（图 3A（1）。
   2. 通过映像复制堆栈 |重复。单击"重复堆栈"框，然后单击"确定"（附加图 2）。
      注意:在此示例中，Z 堆栈采用 .nd2 文件格式，编码为 16 位。
   3. 从重复堆栈创建最小强度投影。转到图像菜单 |堆栈 |Z 项目.选择投影类型"最小强度"，然后单击"确定"（图3A（2）（补充图3）。
   4. 从投影中减去背景。转到"流程 "菜单 |减去背景。键入 500.0 像素的滚动球半径，然后单击"浅色背景"，以渲染比背景更对比的囊肿（图 3A（3）（补充图 4）。
      注:滚动球半径定义运行背景减法区域的大小。此参数必须设置为要标识的最大对象的大小。
   5. 如果需要对比度增强，请转到 图像菜单 |调整 |亮度/对比度 |自动 |应用。斐济将自动优化亮度和对比度。在 （图 3A（3） 中，下灰色和上灰色值分别设置为 49702 和 65452（补充图 5）。
      注:如果投影未校准，请转到"分析 "菜单 |设置比例 并键入相应的校准 μm/像素比（附加图 6）。
3. 囊肿计数和囊肿尺寸测量
   1. 要测量近似囊肿直径，请在斐济菜单中选择直线工具，并在最终投影上绘制一条线，穿过每个囊肿的直径（图 3B（4）。将为每个囊肿创建的新的感兴趣区域 （ROI） 添加到 ROI 管理器:按键盘上的"t"快捷方式以更快地计数和打开 ROI 管理器。单击"全部显示"以查看计数囊肿 （补充图 7）
   2. 通过从 Z 堆栈上的投影中叠加设置的 ROIS 来检查未留下任何囊肿，而不进行计数。为此，请单击 Z 堆栈窗口以 选择它。在 ROI 管理器中，单击"全部显示"并沿 Z 堆栈移动光标以检查每个图像的图像，所有囊肿都已计数（补充图 8）。
   3. 计算新的囊肿并在步骤 2.3.1 上添加 ROI 后，选择 ROI 集，然后通过 ROI 管理器窗口通过"更多 " 保存它 |保存 （补充图 9）
   4. 在 ROI 管理器中选择所有 ROI，然后单击 ROI管理器中的"测量"，获取每个囊肿的大小。这将打开一个新的测量窗口，名为"结果"编号每个囊肿及其估计大小。然后通过单击.csv"窗口和菜单:文件，以"结果"格式 保存保存为 （补充图 10）。
      注:可以创建一个宏来半自动处理堆栈，从投影中估计囊肿数/大小，并存储数据以加快计数过程。为此，通过单击插件，在栏菜单中选择工具" 记录"|宏 |记录。
4. 囊肿形成效率的量化
   1. 计算投影上 Y 天囊肿的数量 （Y=1、2、4、7 或 10）。
   2. 要计算 Y 天 1000 个细胞的囊肿形成效率，请将该时间点计算的囊肿数除以从水凝胶体积推断的第 0 天播种的细胞数，并乘以 1000（图 3C，图 4）。
      

3. 细胞生存能力

1. 在1 mL丙酮中溶解5毫克FDA，储存在-20°C，以5mg/mL的氟辛二丁酸酯（FDA）准备库存溶液。
2. 在去压水（dH₂O）中，以2mg/mL的浓度准备碘化丙胺（PI）的库存溶液，并在4°C下储存。
3. 准备没有胎儿小牛血清（FCS）的NRC介质。
4. 要制备 FDA/PI 染色溶液，请将 4 μL 的 FDA 库存溶液（8 μg/mL 最终浓度）和 25 μL 的 PI 库存溶液（20 μg/mL 最终浓度）加入 2.5 mL 的 NRC 介质中，不带 FCS。
5. 从腔室滑轨中去除介质，将250μL的染色溶液加入到每个井中，并在37°C、5%CO 2的黑暗中孵育_4-5分钟。小心地移出染色溶液，用 250 μL 的 1x PBS 洗涤一次。
6. 仔细添加 250 μL 的完整 NRC 介质到每个井，并使用倒置荧光显微镜与德州红色和荧光素同位素 （FITC） 过滤器拍照。活细胞为绿色，死细胞为红色（图5A）。
   注:为了量化活细胞/死细胞，按照步骤2对水凝胶体积进行Z-stack，并调整荧光图像处理方法。

4. 分泌活动

注:通过胆血管细胞的分泌活性通过流明中荧光素的分泌进行评估。其特异性可以通过与韦拉帕米尔（一种耐多药（MDR）运输抑制剂^{24进行相同的测试来评估}。

1. 要制备 Hoechst 33258 的染色溶液，在 5 微克/mL 下，在没有 FCS 的 NRC 介质中加入 0.83 μL 的 Hoechst 库存溶液（15 mg/mL 库存浓度为 dH₂O）。
2. 在每个孔中加入250μL的霍赫斯特溶液，在37°C下孵育，5%CO2孵育15分钟。
3. 去除霍赫斯特溶液，在每个井中加入 250 μL 的 FDA 溶液（8 μg/mL 最终浓度）。在37°C下孵育4-5分钟，5%CO₂.
   注:一旦细胞暴露在FDA染色溶液中，荧光素分泌动力学的后续可能有助于校准囊肿分泌所需的时间。为此，请通过延时成像，每时1小时拍摄一张照片。在此示例中，观察水凝胶中 NRC 分泌囊肿所需时间约为 15-20 分钟。
4. 使用无 FCS 的介质冲洗 5 分钟后，使用倒置荧光显微镜拍摄图像。使用 4+，6-二米迪诺-2-苯酚多勒 （DAPI） 和 FITC 过滤器来揭示流明中的核标记和荧光素积累（图 6A）。要量化分泌囊肿的数量，请像步骤 2 一样使用 Z 堆栈，并调整图像处理步骤以适应荧光图像。
   注:对于维拉帕米尔测试，在上一个过程之前（步骤 4.3. 到 4.4.）与 Verapamil 进行孵育，根据以下条件:
5. 准备一个10mM维拉帕米尔在二甲基硫化物（DMSO）的库存溶液。要制备 10 μM 工作溶液，请将 2.5 μL 的 Verapamil 库存溶液与 2.5 mL 培养介质混合，不带 FCS。
6. 要评估流明中的荧光是否来自MDR分泌物，请再采取一张幻灯片，并在每井中加入250μL的维拉帕米尔工作溶液，并在37°C下孵育20分钟，在5%的_{CO2下孵育20}分钟
7. 去除溶液，将 250 μL 的 FDA 溶液（8 μg/mL 最终浓度）添加到每个井中。在黑暗中孵育4-5分钟，在37°C，5%CO2 .然后，在成像前用 250 μL 1x PBS 清洗（图 6B，C）。

5. 免疫荧光的皮毛极性评估

1. 要准备固定溶液，将4%甲醛与5%蔗糖混合，在1x PBS、pH 7.4中，在37°C的热水浴中孵育。
2. 要修复细胞，请轻轻移液从井中移出培养基，而不会损坏基质。缓慢地将400μL的固定溶液添加到井边。在室温 （RT） 下孵育 20 分钟。
   注:始终将液体的 25 μL 留在基体上方，以防止其损坏。
3. 轻轻拆下固定溶液，用 400 μL 的 1x PBS 在 （RT） 上洗涤 3x。
4. 移出PBS，加入400μL的渗透溶液（0.5%Triton X-100在1xPBS），并在RT孵育10分钟。
5. 轻轻去除渗透溶液，然后用 400 μL 的 1x PBS 快速清洗 3 次，在 RT 下快速清洗 30 分钟。
   注:在此步骤中，幻灯片可储存在 4 °C 2 天。在这种情况下，用石蜡膜密封幻灯片，以防止蒸发和基质干燥。
6. 去除PBS，加入400μL的阻消溶液，含有0.1%的牛血清白蛋白（BSA）和10%山羊血清在1xPBS中，并在RT孵育60分钟。
   注意:BSA浓度高于0.1%将导致流明缩回和进一步囊肿崩溃（参见代表结果部分）（图7A）。
7. 移出阻塞溶液，用 400 μL 的 PBS/0.05% Tween 20 洗涤一次，然后丢弃。
8. 在1x PBS中加入150μL的抗体溶液，例如，E-cadherin抗体稀释1:400和法洛丁568（16.2 nM最终浓度），在RT孵育90分钟。
   注:E-卡德林的稀释与标准2D免疫荧光协议中的使用相同。
9. 用 400 μL 的 PBS/0.05% Tween 20、3x 清洗样品;每次在 RT 孵育样品 10 分钟。
10. 加入150μL的二级抗体（山羊抗兔IgG亚历克萨氟加647），在1xPBS中稀释1:500，在RT孵育60分钟。
11. 用 400 μL 的 PBS/0.05% Tween 20 洗涤 3x，每次在 RT 中孵育样品 10 分钟。
12. 用 400 μL 的 1x PBS 清洗 3x，每次在 RT 中孵育样品 10 分钟。
13. 丢弃上次洗涤的 PBS，按照以下两个选项之一，通过共和显微镜准备腔室幻灯片以可视化。
    1. 每井添加 400 μL 1x PBS 和 50 μL DAPI。样品可以通过井底检查，而无需安装盖玻片（图7B）。
    2. 每井添加 100 μL 含有 DAPI 的抗fade试剂，让滑轨在RT下干燥 O/N。

Results

囊肿的形成和表征
3D细胞培养系统是研究器官生成和疾病建模^{的重要工具}。不幸的是，这些方法大多数是定性的或使用在单个平面上执行的内部定量，通过比较囊肿和非囊肿的数量，在可变和经常未指定的体积，防止任何比较之间的各种研究^{7，8，9，10，15，18，23。}该协议中提出的方法，通过记录实验过程中囊肿的总数及其各自的大小，可以分析囊肿形成和生长的演变（图4）。

基于相位对比图像，在第0...

Discussion

为了研究3D细胞结构的器官生成和维护，各种组织已经建模，使用不同的细胞起源，但也不同类型的细胞外基质，包括合成水凝胶^{8，9，10，21。}然而，由于缺乏3D定量分析，使得在器官形成或功能^{7、8、9、10、15、18}方面的方法之间进行比较^，水凝胶或药物筛选的进一步标准化仍然遥不可及。

为了解决这些缺陷，我们提出了一个基于水凝胶，可重复和标准化...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 µl- 移液器 Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000020
100 µl - Eppendorf Research Plus 移液器	Fisher Scientific	3120000046
1000 µl - 移液器 Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000062
1X PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-094
200 µl - 移液管 Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000054
3,3′，5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐	Sigma-Aldrich	T5516	NRC 完全培养基，终浓度 = 3.4 &微量;g/mL
乙酸	VWR	20104-298	0.02N 最终
气溶胶屏障移液器吸头 10 &微量;l （Fisherbrand）	Thermo Fisher Scientific	2707439
溶胶屏障移液器吸头 1000 µl （Fisherbrand）	Thermo Fisher Scientific	2707404
气溶胶屏障移液器吸头 200 和微量;l （Fisherbrand）	Thermo Fisher Scientific	2707430
抗生素抗微生物溶液 （100X）	Sigma-Aldrich	A5955	NRC 完全培养基终浓度 = 1：100 稀释牛
垂体提取物	Thermo Fisher Scientific	13028-014	NRC 完全培养基终浓度 = 30 &微量;g/mL
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A2153	1：1000 稀释
化学成分明确的脂质浓缩物 （100X）	Thermo Fisher Scientific	11905-031	NRC 完全培养基 终浓度 = 1：100 稀释度
胶原蛋白 高浓度，大鼠尾	Thermo Fisher Scientific	354249	50 µg/mL 终浓度
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4902	NRC 完全培养基 终浓度 = 0.393 &微量;g/mL
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	NRC 完全培养基，终浓度 = 1X
E-钙粘蛋白兔抗人、大鼠、多克隆	Thermo Fisher Scientific	PA5-32178	1：400 稀释
Eclipse TE300 倒置显微镜	Nikon		成像
乙醇胺	Sigma-Aldrich	E9508	NRC 终级完全培养基浓度 = 0.32 mM
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10270-106	NRC 完全培养基 终浓度 = 5：100 稀释度
含 DAPI 的氟盾（封固剂）	Sigma-Aldrich	F6057
甲醛 16% （W/V）Thermo	Fisher Scientific	28906	4% （W/V）
山羊血清	Thermo Fisher Scientific	16210-064	1：10稀释
滨松相机 （数码相机 C11440 ORCA - 闪光灯 4.OLT）	滨松		成像
Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	B1155	5 µg/mL 终浓度
IgG （H+L） 高度交叉吸附的山羊抗兔抗体，Alexa Fluor Plus 647	Thermo Fisher Scientific	A32733	1：500 稀释度
ImageJ 版本 2.0.0-rc-69/1.52n			开源图像处理软件
胰岛素-转铁蛋白-硒 （100X）	Thermo Fisher Scientific	51300-044	NRC 完全培养基 终浓度 = 1：100 稀释度
L-谷氨酰胺 （100X）	Thermo Fisher Scientific	25030-024	NRC 完全培养基，终浓度 = 1：100 稀释基质
胶 GFR（储备浓度 9.7 mg/mL）	Thermo Fisher Scientific	356231	4：10 稀释
NIS Elements 软件版本 4.50.00	Nikon		图像采集和显示
非必需氨基酸溶液 （100X）	Thermo Fisher Scientific	11140-035	NRC 完全培养基 终浓度 = 1：100 稀释
度 目标 计划 Fluor 10X/0.30 Ph1 DL （∞/1.2 WD 15.2）	Nikon
Prolong Gold 抗淬灭试剂	Thermo Fisher Scientific	P36931
碘化丙啶 （PI）	Sigma-Aldrich	P4170	20 µg/mL 终浓度
罗丹明鬼笔环肽	Thermo Fisher Scientific	R415	16.2 nM 终浓度
Sir-Actin / Verapamil 试剂盒	Spirochrome	SC001	10 µM 终浓度
大豆胰蛋白酶抑制剂	Thermo Fisher Scientific	17075-029	NRC 完全培养基 终浓度 = 50 µg/mL
无菌细胞过滤器 40 µm （Fisherbrand）	Thermo Fisher Scientific	22363547
无菌移液器 10 mL （Fisherbrand）	Thermo Fisher Scientific	1367811E
无菌移液器 5 mL （Fisherbrand）	Thermo Fisher Scientific	1367811D
无菌管 1.5 mL （Fisherbrand）	Thermo Fisher Scientific	11926955
管 15 mL （Fisherbrand）	Thermo Fisher Scientific	7200886
无菌管 50 mL（Fisherbrand）	Thermo Fisher Scientific	553913
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389	5：100 稀释
组织培养处理过的培养瓶 25 cm2 （Falcon）	Thermo Fisher Scientific	353108
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	5：1000稀释
胰蛋白酶-EDTA （0.05%） 酚红	Thermo Fisher Scientific	25300-054	1X
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	5：10000 稀释
维生素 （100X）	Thermo Fisher Scientific	11120-037	NRC 完全培养基 终浓度 = 1：100 稀释
μ-Slide 8 孔 ibiTreat， Ibidi	Clinisciences	80826