三维（3D）细胞系统是研究器官发生的相关模型。本文提出一种基于水凝胶的胆管囊泡生成及其表征方法。该方案克服了三维结构表征的障碍，提供了一种简单且可靠的方法，用于评估囊泡形成效率、尺寸大小及其功能特性。
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摘要
摘要
胆管上皮细胞（cholangiocytes）是排列在肝脏胆管内壁的上皮细胞，负责胆汁的生成与修饰。在过去二十年中，针对肝脏疾病的研究背景下，基于胆管上皮细胞的三维（3D）模型逐渐发展起来，例如囊肿、球状体或管状结构，用于模拟组织拓扑结构，以开展器官发生、疾病建模和药物筛选研究。这些结构主要通过将胆管上皮细胞包埋于水凝胶中获得。其主要目的是通过研究上皮极性、功能特性及形态学特征，探讨细胞的自组织能力。然而，极少有研究关注囊肿形成效率。即使涉及该指标，效率通常也仅通过单层图像进行量化。功能检测与结构分析往往未反映因水凝胶聚合不均及副作用所导致的囊肿分布潜在异质性。因此，现有的定量分析方法难以在不同研究之间进行比较。此外，该方法也无法比较不同基质或细胞类型在三维生长潜能上的差异。同时，目前尚无文献提及囊肿免疫染色实验中的问题排查方法。本文提供了一种可靠且通用的方法，证明初始细胞分布与囊肿在水凝胶垂直方向上的异质性分布密切相关。我们对包埋于水凝胶中的胆管上皮细胞进行为期10天的时间序列观察，并利用Z轴层扫分析贯穿水凝胶深度的细胞动态变化。通过该方法，可获得稳健的囊肿形成效率及生长动力学数据。我们还介绍了评估囊肿极性与分泌功能的方法。最后，提供了优化免疫染色方案的额外建议，以减少成像过程中囊肿塌陷的问题。该策略可推广应用于其他三维细胞培养研究，从而为不同系统间的比较提供了可能。
引言
在过去三十年中，体外研究领域已逐步发展为三维（3D）培养体系。目前已涌现出多种三维细胞培养方案，可用于形成类球体或细胞聚集体，培养方式包括使用或不使用支架/基质、液滴培养、振荡培养、微流控装置培养或悬浮培养1。与二维（2D）培养相比，三维培养方法已显示出其显著优势，尤其对于上皮细胞而言，这些细胞可在三维环境中自组织形成被称为囊泡或腺泡的结构。在此情况下，细胞形成单层结构，围绕一个管腔排列，并获得完整的上皮表型，其生理特异性功能也得到增强2。
大量研究推动了在天然基质中形成这些上皮类器官方法的发展。这使得体内细胞间以及细胞与微环境之间的相互作用得以重现，从而建立并维持上皮表型的稳定性3,4,5,6,7。近年来，特别是为了开发可用于移植的类器官，并解析微环境在调控上皮程序中的必要性，研究人员已开发出合成水凝胶以促进上皮腺泡的形成8,9,<....
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方案
1. 包囊的制备
注意：如果凝胶化过程允许细胞包埋，则本方案可适用于任何类型的水凝胶。
- 水凝胶涂层
注意：正确地将水凝胶涂覆于腔室载玻片是避免在孔底部形成二维细胞层的关键步骤，否则可能干扰后续的囊肿成像，并影响囊肿形成效率的计算。- 为确保凝胶溶液的均匀性，将水凝胶解冻 4 °C 过夜（O/N）
- 将移液器吸头预冷于冰上或在 -20 °C -8 孔板20 °C 过夜
- 将水凝胶和8孔腔室载玻片置于装有冰块的冰桶中。
- 在15 mL锥形管中，用冷的NRC完全培养基配制含40%水凝胶（V/V）的溶液（参见 材料列表并将试管置于冰上。
- 使用预冷的移液器吸头，向腔室载玻片中加入 50 μL 在每个孔的中心加入水凝胶溶液，并用移液器吸头在将腔室载玻片置于冰上的同时将溶液铺展至整个表面（图1A).
注意：将水凝胶溶液尽可能均匀地铺展，避免产生气泡。 - 为使水凝胶聚合，将腔室载玻片置于至少15分钟的孵育环境中 37 °C，5% CO₂2.
- 细胞制备
- 预热 NRC 完全培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-....
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结果
囊泡的形成与表征
三维细胞培养系统是研究器官发生和疾病建模的重要工具25。然而，大多数现有方法均为定性分析，或仅通过单平面内囊泡与非囊泡数量的内部量化进行比较，且常在体积不一致且未明确说明的条件下进行，导致不同研究之间无法对囊泡形成效率进行有效比较7,8,9,10,15,18,23。本实验方案所提出的方法通过记录实验期间全部囊泡的数量及其各自大小，可实现对囊泡形成与生长动态演变的分析（图4）。
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讨论
为了研究器官发生以及三维细胞结构的维持，研究人员已利用不同的细胞来源以及包括合成水凝胶在内的多种类型细胞外基质对各种组织进行了建模8,9,10,21。然而，由于缺乏可用于在类器官形成或功能方面对不同方法进行比较的三维定量分析技术7,8,9,10,15,18，水凝胶或药物筛选的进一步标准化仍难以实现。
为解决这些不足，我们提出一种基于水凝胶.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所的 Nicholas LaRusso 博士，他慷慨提供了 NRC 细胞系。
本工作获得了iLite RHU项目（资助号ANR-16-RHUS-0005）和DHU Hepatinov的经费支持。
感谢 Isabelle Garcin 和巴黎萨克雷细胞成像网络在成像方面提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 µl- 移液器 Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µl - 移液器 Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 µl - 移液器 Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 µl - 移液器 Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐 | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC完全培养基终浓度 = 3.4 µg/mL |
| 乙酸 | VWR | 20104-298 | 终浓度0.02N |
| 气溶胶屏障移液器吸头 10 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| 气溶胶屏障移液器吸头 1000 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| 气溶胶屏障移液器吸头 200 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| 抗生素-抗真菌素溶液 (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释 |
| 牛垂体提取物 | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC完全培养基终浓度 = 30 µg/mL |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 稀释 |
| 化学成分明确的脂质浓缩液 (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释 |
| 高浓度胶原蛋白，大鼠尾部来源 | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 终浓度 50 µg/mL |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC完全培养基终浓度 = 0.393 µg/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC完全培养基终浓度 = 1X |
| E-钙黏蛋白 兔抗人、大鼠 多克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 稀释 |
| Eclipse TE300 倒置显微镜 | Nikon | 成像 | |
| 乙醇胺 | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC完全培养基终浓度 = 0.32 mM |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC完全培养基终浓度 = 5:100 稀释 |
| 含DAPI的Fluoroshield（封片剂） | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| 甲醛 16% (W/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (W/V) |
| 山羊血清 | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 稀释 |
| Hamamatsu相机（数字相机 C11440 ORCA - flash 4.OLT） | Hamamatsu | 成像 | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 终浓度 5 µg/mL |
| IgG (H+L) 高度交叉吸附 山羊抗兔 Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 稀释 |
| ImageJ 版本 2.0.0-rc-69/1.52n | 开源图像处理软件 | ||
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释 |
| L-谷氨酰胺 (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释 |
| Matrigel GFR（储存浓度 9.7 mg/mL） | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 稀释 |
| NIS Elements 软件版本 4.50.00 | Nikon | 图像采集与显示 | |
| 非必需氨基酸溶液 (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释 |
| 物镜 Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂 | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| 碘化丙啶 (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 终浓度 20 µg/mL |
| 罗丹明鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | R415 | 终浓度 16.2 nM |
| Sir-Actin / Verapamil 试剂盒 | Spirochrome | SC001 | 终浓度 10 µM |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC完全培养基终浓度 = 50 µg/mL |
| 无菌细胞筛 40 µm (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| 无菌移液管 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| 无菌移液管 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 无菌离心管 1.5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| 无菌离心管 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| 无菌离心管 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 稀释 |
| 组织培养处理过的培养瓶 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| 吐温-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 稀释 |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%) 含酚红 | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| 曲拉通 X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 稀释 |
| 维生素 (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释 |
| μ-Slide 8 孔 ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
参考文献
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Martín-Belmonte, F., et al.
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