使用软光刻技术改良仿生复制牙根表面微结构

摘要

仿生学此前已被用作研究叶片与微生物相互作用的工具。然而，目前尚无类似的根系研究工具。本文中，我们开发了一种制备模拟根系表面微结构的合成表面的实验方案，用于研究根系与环境之间的相互作用。

摘要

仿生学是指利用化学和材料科学来模拟生物系统，特别是生物结构，以造福人类。近年来，研究人员开发了模拟叶片表面微结构的仿生表面，用于研究叶片微结构对叶片与环境相互作用的影响。然而，目前尚无类似的工具用于根部研究。我们开发了一种工具，可将根部表面微结构复制到人工表面上，实现合成模拟。我们采用软光刻技术，借鉴已用于叶片表面微结构复制的两步法流程。其中第一步更具挑战性，因为它涉及生物组织。在此步骤中，我们采用了不同的聚合物及固化策略，使用经紫外线固化的坚硬刚性聚氨酯材料进行根部模具制备。该方法使我们能够可靠地获得包含根毛等精细且难以处理特征的根部表面微结构的负像。随后，我们利用该负像作为模板，通过广泛使用的聚二甲基硅氧烷（PDMS）以及一种纤维素衍生物——乙基纤维素，实现了根部表面微结构的复制。乙基纤维素更接近根部的真实特性，并且可被微生物分泌的纤维素酶降解。这一新构建的平台可用于研究表面微结构在根-微生物相互作用中的影响，类似于此前在叶片中所开展的研究。此外，该系统还能够追踪微生物相对于表面结构特征的位置，并在未来进一步监测其纤维素酶分泌等形式的生物活性。

引言

叶片表面微结构的复制是仿生学研究领域中一种已知的方法^1,2,3,4。最早对叶片表面微结构的复制是通过在叶片表面涂抹指甲油和橡胶材料实现的，以便更清晰地观察微结构，特别是气孔^5,6,7,8,9,10。随后该方法得到改进，采用先进聚合物通过软光刻技术来模拟叶片表面微结构，尤其在超疏水表面仿生研究中得到广泛应用^2,3,4,11,12。近年来，该方法已被证实是研究叶片表面与其表面定殖微生物之间相互作用的有力工具，无论这些微生物是致病性的^13,14，还是作为天然叶际微生物群落一部分的有益微生物¹⁵。即使使用完全合成的表面材料，对自然系统的简化也被证明在研究表面与微生物相互作用方面极为有效^15,16,17,18。

尽管叶片表面微结构的复制已被证明是研究叶面与不同微生物相互作用的有用工具，但目前尚无类似方法可用于植物根系。由于植物根系位于地下，其所有相互作用均发生在土壤内部，因此更难进行研究。与叶片类似，根系表面微结构可能在根系-微生物相互作用中发挥重要作用。然而，目前尚无方法能够分离出根系表面微结构在复杂的根系-微生物相互作用中的特定作用。最受关注的根系表面微结构特征是根毛^19,20,21。根毛在增加表面积方面具有重要作用，从而促进养分和水分更高效地吸收²²，但其作为结构特征参与根系-微生物相互作用的功能至今尚未得到验证。

在叶片中用于软光刻的最广泛使用的聚合物是聚二甲基硅氧烷（PDMS）。PDMS的性质与叶片角质层相似^15,23。然而，在植物根部，最丰富的材料是纤维素^24,25，其性质与PDMS存在差异^26,27,28。因此，使用PDMS构建用于研究根-环境相互作用中表面微结构效应的合成平台并不理想。

本文介绍的方案能够利用多种材料制备合成的根系表面微结构复制品。与叶片表面微结构复制方法类似，该过程分为两个步骤。第一步以生物组织（根）为模板，将其 molding 成聚氨酯模具（即负向复制品）。该聚氨酯模具呈现根系表面微结构的负像，可作为基础，用于从多种材料（包括PDMS和纤维素衍生物）生成根系表面微结构的正向复制品。这种根系表面复制品后续可作为研究根系表面结构在根-微生物相互作用中作用的平台。

方案

1. 植物培养与根系制备

1. 方法一：从茎部诱导产生不定根。
   1. 取一个用于植物培养的生根托盘。
   2. 在托盘中装入土壤。
   3. 在托盘的每个小格中放入一粒M82番茄品种种子。
   4. 用少量土壤覆盖种子。
   5. 使用滴管从托盘底部加水，使水充满托盘底部，土壤通过毛细作用吸水。
   6. 每周一次，在每1 L水中加入2 mL肥料，从托盘底部供给。
   7. 将托盘置于25 °C的培养室中生长。
   8. 采用光照与黑暗交替的光照条件：每日9小时光照（7:00–16:00），随后15小时黑暗。
   9. 3周后，将植株从土壤中取出。
   10. 在茎与根系交界处将根系切除。
   11. 将去根的植株放入盛有水的烧杯中。
   12. 数天后，切下从茎部产生的不定根，用于后续实验。
2. 方法二：准备种子萌发产生的根。
   1. 用水润湿与培养皿大小匹配的滤纸。
   2. 在培养皿内的滤纸上放置数粒M82种子（不超过10粒）。
   3. 将培养皿置于25 °C条件下培养。
   4. 每天补充水分以保持滤纸湿润。
   5. 待萌发的根长至足够长度（约5天后），取出种子并取根用于后续实验。

2. 聚氨酯根系负模的制备

1. 制备负模复制液：将 9.49 g 二脲烷二甲基丙烯酸酯加入一个 20 mL 小瓶中。
   1. 向小瓶中加入 1.45 mL 甲基丙烯酸乙酯。
   2. 在室温（RT）下搅拌，直至溶液变得澄清且均匀。
      注意：大约需要 2 小时即可形成均匀溶液。
   3. 加入 3 mL 增塑剂邻苯二甲酸二乙酯，在室温下搅拌 1 小时。
      注意：邻苯二甲酸二乙酯可与丙烯酸单体混溶。
   4. 加入 300 µL 光引发剂 2-羟基-2-甲基苯丙酮，在室温下搅拌过夜。持续搅拌至所有气泡完全消除。
      注意：此步骤可暂停，溶液可在室温下保存。
2. 制备根部的负模复制物：取一块洁净的载玻片，倒入 1 mL 负模复制液。
   1. 将 2‒3 根根段置于溶液上，注意不要让根段完全被溶液覆盖。
   2. 将载玻片置于 8 W 紫外线（UV）灯下照射 8‒10 分钟。避免溶液暴露于 UV 光下时间过长。
      注意：切勿使溶液在紫外光下照射过久，否则会导致聚氨酯过度硬化，无法取出根段。
   3. 关闭 UV 灯，将复制物从载玻片上取下，并放入盛有乙醇的培养皿中，以去除未反应的单体。
   4. 使用镊子缓慢地将根段从复制物中取出，以获得根部的负模复制物。

3. 从聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备根部正向复制品。

1. 为制备正向复制品的混合物，将 10 g 二甲基硅氧烷放入纸杯中。
   1. 加入 1 g 固化剂并充分混合。
   2. 将混合物置于真空干燥器中 2 小时，以去除气泡。
2. 为制备正向复制品，将聚氨酯负向复制品放入培养皿中。
   1. 将 PDMS 混合物倒在负向复制品表面。
   2. 施加真空处理 2 小时，以确保微结构完全覆盖。
   3. 将培养皿在室温下静置过夜。
   4. 用手将固化的正向复制品从负向复制品上分离。

4. 用乙基纤维素制备根部正型复制品。

1. 为了制备乙基纤维素溶液， 在100 ml的杯子中加入1.32 ml邻苯二甲酸二乙酯作为增塑剂。
   1. 加入20 mL乙醇，室温下搅拌2小时。
   2. 加入 3.3 g 乙基纤维素并搅拌过夜。
2. 为了制备正向复制品，将聚氨酯负向复制品置于培养皿中。
   1. 将乙基纤维素溶液倒在负复制膜上。
   2. 在生物安全柜中，将培养皿于室温下放置过夜。
   3. 用镊子非常缓慢地将阳性复制品从阴性复制品上取下。

结果

为了形成根系表面微结构的复制，必须选择用于制模的根。我们通常在土壤中种植番茄植株，这使得直接从根系中获取天然根进行复制极为困难。从根系上清除土壤非常困难，此外，根系本身较为脆弱，在制模过程中容易断裂。因此，我们建议在实验初期优先使用更为坚韧的根，以在实验室中建立和完善该实验方案。此类根的形成过程如图1A所示。在植株生长3周后，将其根系去除，并将无根植株置于水中约一周，直至从茎部产生不定根。这些不定根可用于实验方案的初步建立。一旦实验方案成熟，便需要获取更接近真实情况的根系表面结构。在此情况下，我们建议避免使用在土壤中生长的根，因为彻底清除土壤极为困难。相反，我们建议使用萌发过程中产生的根，这类根能够提供关于特定基因型植物根系表面微结构的有价值信息。此类根的培养方法如图1B所示。将种子放置于湿润的滤纸上，并在25 °C条件下培养。在保持滤纸湿润约5天后，萌发的根即可生长至适合复制的长度。这些根比前述的不定根更为脆弱，操作时需要更加小心谨慎。

根部表面微结构复制品的制备是一个两步过程。第一步是将天然根部模制成聚氨酯基的模具（即负向复制品）。该步骤的优点在于，所有用于制备聚氨酯模具的材料均可预先配制，根部仅在最后阶段放置于已准备好的溶液上，并暴露于紫外光下10分钟。因此，生物组织不会长时间暴露在严苛条件下，且在过程结束时可轻柔操作。如果严格按照所有实验步骤进行，便可获得良好的负向复制品。该复制品将显示出根部表面的细胞结构，以及代表根毛位置的小孔（图2A）。如果未遵循某些关键步骤，该操作将失败。其中一个关键步骤是根部在聚氨酯溶液固化前的放置方式。必须非常轻柔地放置根部，以避免其部分或全部浸入聚氨酯溶液中。根部任何部分的浸入都会导致其被包裹在硬化后的聚合物中而无法取出。一旦发生这种情况，根部将残留在固化后的负向复制品内部（图2B）。另一个关键步骤是紫外光照射的固化时间。推荐的固化时间为8‒10分钟。超过10分钟会导致聚氨酯模具变得极为坚硬，使得无法在不折断根部的情况下将其取出。根部断裂有时肉眼可见，例如出现较大碎片时（图2C，上方，紫色箭头标记）。然而，有时仅有微小的根部碎片残留在材料中，肉眼难以察觉，必须借助显微镜观察（图2C，下方，紫色箭头标记）。我们建议在继续后续实验步骤前，务必使用显微镜仔细检查聚氨酯负向复制品，确保其中无任何残留根部组织。

一旦制备出聚氨酯阴模，便可使用多种材料来制备阳模。利用聚氨酯阴模作为模具制备阳模的过程十分直接，其质量完全取决于聚氨酯阴模的品质。在制备阳模时，我们采用了聚二甲基硅氧烷（PDMS）——该材料在软光刻领域已被广泛使用（图3A）——以及乙基纤维素——该材料能更好地模拟主要由纤维素构成的根表面特性（图3B）。PDMS阳模的扫描电镜图像清晰地显示了根毛结构，这些根毛位于伸长区，正处于开始萌出的阶段。因此，根毛的长度沿根表面逐渐增加，与天然根的形态相似（图3A）。乙基纤维素形成的薄膜比PDMS更硬且柔韧性较差，因此从阴模上剥离时需要更加小心。然而，在光学显微镜下仍可观察到部分根毛及表面微结构（图3B）。我们使用了上述两种材料制备阳模，但原则上，任何能够成膜的材料均可作为阳模材料，配合聚氨酯阴模使用。

图 1：用于复制实验的番茄植株根系。（A）将番茄（M82）植株在25 °C、光照9小时和黑暗15小时的条件下培养。3周后，将植株从土壤中取出，并切除根系。将无根植株放入水中，约一周后茎部会萌发出不定根。这些不定根的结构与原根系不完全相同，但可作为良好的实验模型。与原根系的根相比，这些根更不易断裂，因此在实验室建立该技术时优先选用。（B）将番茄（M82）种子置于培养皿中的湿润滤纸上，并在25 °C下培养。每天补充水分以保持滤纸湿润，种子开始萌发。根系逐渐生长，大约5天后长度足够用于复制实验。这些根较为柔嫩，建议在实验方法已熟练掌握后使用。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：聚氨酯负模的显微图像。（A）按照完整步骤操作制备的聚氨酯负模的扫描电镜图像。细胞结构清晰可见。黄色箭头指示根部毛状结构在根上形成的孔洞。（B）聚氨酯负模的光学显微图像，其中根部完全被溶液包裹，无法取出。聚氨酯在根部内部固化。根部肉眼可见，也可通过光学显微镜观察到。无法将此根部从固化的负模中取出。（C）因长时间暴露于紫外光下而受损的聚氨酯负模的光学显微图像。结果导致根部无法完全从聚合物中移除，部分大颗粒肉眼可见（上图，紫色箭头标记），而小碎片仅能在显微镜下观察到（下图，紫色箭头标记）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：正向复制品的显微镜图像。（A）由PDMS制成的正向复制品的扫描电子显微镜图像。放大图显示根毛。（B）由乙基纤维素制成的正向复制品的光学显微镜图像。右侧图像显示毛状结构，左侧图像可见表面纹理。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

我们提出了一种复制根系表面微结构的新方法。该方法基于现有的叶片表面微结构复制技术⁴。为了发展这一方法，我们需要对现有的叶片复制方法进行调整。我们发现，将叶片复制方法应用于根系时，关键难点在于根系模具制备的第一步。这是该方法中最敏感的环节，因为它涉及生物组织。因此，我们希望选择一种在相对温和条件下即可固化的聚合物，以尽量减少对生物组织的损伤。我们选择了聚氨酯，因为它可在紫外光照射下快速聚合（10分钟内）²⁹。此外，聚氨酯聚合后非常坚硬³⁰，我们期望这一特性有助于将根系从聚氨酯模具中较容易地分离出来。

本方法是一种两步法，第一步生成负像（负复制），第二步基于该负复制生成正复制。该方法扩展了可使用的材料范围。目前，植物叶片表面微结构的复制主要采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）或环氧树脂材料^11,31。也有部分研究使用其他材料，特别是支持微生物生长的材料^13,32，这是因为近年来该方法已被用于研究微生物与表面相互作用，特别是在叶片表面结构的背景下。然而，在叶片相关研究中，尚未使用过类似纤维素的材料。我们建议采用聚氨酯负复制作为模具，并使用多种材料制备正复制。换句话说，一旦获得高质量的负复制，使用多种不同材料制备正复制将相对容易。目前我们使用纤维素衍生物，但也在探索将果胶和木质素^33,34与纤维素衍生物结合，以使用更贴近根表面的材料。

该方法还拓展了现有的叶片表面微结构复制技术，因为叶片是二维表面，而根系表面是弯曲的，属于三维表面。由于将整个根系浸入聚氨酯溶液中会导致无法脱模，因此本方法无法实现根系整个表面的复制，必须在复制根系表面微结构时选择其中一侧进行。所获得的合成表面呈曲面状，大致代表了根系约一半的表面积，但并非全部。我们假设根系表面的结构特征在沿根长方向的轴线上基本呈对称分布。然而，在那些不能假设具有此类对称性的研究中，应谨慎选择需要复制的根系侧面。

我们提供了两种可用作模具的根系选择。第一种是利用茎部产生的不定根，第二种是在滤纸上萌发的根系。第一种选择主要用于帮助研究人员练习该方法，因为这类根系更为强健，易于操作。第二种选择则能够反映不同品种根系之间存在的遗传差异，且不受环境条件的影响。这些根系表面可作为重要的研究工具，但需注意环境因素对根系表面结构具有显著影响，特别是根系生长所处的土壤环境^35,36。由于土壤施加的机械应力，根系在穿透土壤过程中不可避免地会发生某些形态学变化，并在表面产生损伤³⁷。将根系从土壤中取出并进行清洗，同时不破坏其原有结构，是一项极为困难的操作。因此，我们对该方法能否可靠地模拟在土壤中生长的根系表面微结构持保留态度。然而，对于聚焦于遗传差异或环境差异且微结构变化明显的研究，该方法仍可作为研究根系表面微结构影响的有效工具。

我们的方法能够制备出一种仅模拟根系表面微结构特性的惰性表面。尽管该方法旨在将根系与环境相互作用中的结构效应与其他所有效应分离开来，但我们不能忽视这些相互作用中的化学物质。某些微生物在缺乏特定营养物质等化合物的情况下，可能无法在该表面存活或正常发挥功能。该技术平台的下一步发展方向将是可控地添加化学化合物，以研究其与结构共同作用时对不同相互作用的影响。

该方法的开发是构建用于研究根系-微生物相互作用的合成平台的第一步。本文中我们模拟了根系表面的微结构，这一初始平台可用于研究表面微结构对微生物行为的影响。然而，该平台存在局限性，因其缺少自然系统中的许多其他组分。未来应通过选用合适的材料构建表面，并向系统中添加其他关键化学物质，进一步完善该平台。在更先进的平台中，还可实现化学物质的空间分布。由于目前尚无其他方法可用于分离根系-微生物相互作用中的结构效应，我们希望研究人员能够利用这一初始平台，针对此类相互作用提出与结构相关的问题。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-羟基-2-甲基苯丙酮	Sigma	405655
邻苯二甲酸二乙酯	Across	114520010
二异氰酸酯二甲基丙烯酸酯	Sigma	436909
乙基纤维素	Across	232705000
甲基丙烯酸乙酯	Sigma	234893
Shaphir 溶液	GAT 肥料	6-2-4
Sylgard 184 试剂盒	Polymer-G	510018400500