从成人脑组织中获取人源小胶质细胞

摘要

本方案是一种高效、经济且可靠的从活体成人人类脑组织中分离原代小胶质细胞的方法。分离得到的原代人类小胶质细胞可作为研究稳态及疾病状态下细胞过程的工具。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中常驻的固有免疫细胞。小胶质细胞在发育过程中、维持稳态以及感染或损伤期间发挥着关键作用。多个独立研究团队已强调了小胶质细胞在自身免疫性疾病、自身炎症综合征和癌症中的核心作用。在某些神经系统疾病中，小胶质细胞的活化可能直接参与致病过程。原代小胶质细胞是研究脑内免疫反应、细胞间相互作用以及疾病中小胶质细胞表型失调的有力工具。与永生化的小胶质细胞系相比，原代小胶质细胞更能模拟体内小胶质细胞的特性。成人人类小胶质细胞与胎儿人类及啮齿类小胶质细胞具有明显不同的特性。本实验方案提供了一种从成人人类脑组织中高效分离原代小胶质细胞的方法。研究这些小胶质细胞有助于深入理解小胶质细胞与中枢神经系统中其他常驻细胞群体（包括少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞）之间的细胞间相互作用。此外，可对来自不同人脑的小胶质细胞进行培养，以表征其独特的免疫反应，推动个体化医学及多种治疗应用的发展。

引言

中枢神经系统（CNS）由一个复杂的神经元和胶质细胞网络构成¹。在胶质细胞中，小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞发挥作用^2,3。小胶质细胞在健康的中枢神经系统中负责维持稳态⁴。此外，小胶质细胞通过突触修剪在神经发育过程中发挥重要作用²。小胶质细胞在多种神经系统疾病的病理生理过程中处于核心地位，包括但不限于阿尔茨海默病⁵、帕金森病⁶、脑卒中⁷、多发性硬化⁸、创伤性脑损伤⁹、神经病理性疼痛¹⁰、脊髓损伤¹¹以及胶质瘤等脑肿瘤¹²。

与中枢神经系统稳态及疾病相关的研究常利用啮齿类动物的小胶质细胞，原因是目前缺乏经济高效且省时的人原代小胶质细胞分离方案¹³。啮齿类动物的小胶质细胞在Iba-1、PU.1、DAP12和M-CSF受体等基因的表达方面与人原代小胶质细胞相似，已被广泛用于理解正常及病变脑组织的功能¹³。有趣的是，多种免疫相关基因（如TLR4、MHC II、Siglec-11和Siglec-3）在人与啮齿类动物小胶质细胞中的表达存在差异¹³。此外，在两种物种中，多个基因的表达在时间动态变化以及神经退行性疾病状态下也有所不同^14,15。这些显著差异表明，人小胶质细胞是研究小胶质细胞在稳态与疾病中功能不可或缺的模型。原代人小胶质细胞还可作为潜在药物候选物临床前筛选的有效工具¹⁶。上述原因凸显了建立经济高效的人原代小胶质细胞分离方案日益增长的需求。

我们建立了一种从成人脑组织中分离原代人源小胶质细胞的方案，这些脑组织是因肿瘤切除或其他外科手术过程中产生的手术窗口而获得的。本方法与现有方法有显著不同。我们能够在组织取材地点至实验室开始分离操作的约75分钟转运时间后，成功分离并培养小胶质细胞。我们使用L929成纤维细胞的上清液促进分离后小胶质细胞的生长。该方法专门针对仅培养和扩增原代小胶质细胞。所获得的细胞培养物中小胶质细胞比例约为80%。尽管其他方案可通过密度梯度离心、流式细胞术和磁珠分选等方法获得富集的小胶质细胞培养物，但本方案是一种快速、简便、稳定且成本效益高的原代人源小胶质细胞培养方法^17,18,19,20。相较于现有方法，本方案能够利用手术切除的活体成人脑组织，而非尸体来源的固定脑组织，具有明显优势^18,21。

方案

所有组织均在获得印度理工学院焦特布尔分校和全印度医学科学研究所（AIIMS）焦特布尔分校的机构伦理委员会伦理批准后获取。

1. 组织获取与处理（第0天）

1. 将组织收集到含有10 mL冰冻人工脑脊液（aCSF）（2 mM CaCl₂∙2H₂O、10 mM葡萄糖、3 mM KCl、26 mM NaHCO₃、2.5 mM NaH₂PO₄、1 mM MgCl₂∙6H₂O、202 mM蔗糖）的50 mL离心管中²⁰。若需将组织转移至其他地点，确保离心管始终置于冰上。
   注意：使用经高压灭菌的蒸馏水配制aCSF，并在超净台中用0.22 µm注射器滤器过滤。该溶液可在4 °C保存1个月。
2. 用70%酒精仔细擦拭收集管，然后转移至无菌超净工作台。
3. 小心弃去aCSF，并在无菌条件下称量组织重量。组织重量对于计算后续步骤所需胰蛋白酶-EDTA的体积至关重要。
4. 将组织置于新鲜预热至37 °C的aCSF中孵育5分钟。此步骤对避免细胞死亡至关重要。
5. 弃去aCSF，用37 °C的1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤组织一次。根据需要重复PBS洗涤，确保彻底去除所有血液。
6. 将组织在37 °C的温PBS中孵育5分钟。
7. 小心弃去PBS，并将组织转移至已灭菌的培养皿中。可用移液器吸除PBS，以防止组织损失。
8. 使用无菌手术刀将组织切成小块（至少1 mm³）。组织切得越细，胰蛋白酶-EDTA解离时的表面积越大，从而提高细胞得率。
9. 将切碎的组织转移至50 mL离心管中，加入每克组织10 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并用10 mL血清移液管反复吹打混匀。向培养皿中加入2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液，用移液器充分冲洗培养皿表面，然后将冲洗液全部转移回离心管中。此操作可最大限度减少切碎过程中组织和细胞的损失。
10. 将离心管置于摇床上，在37 °C、250 rpm条件下孵育30分钟。此步骤有助于增强组织中细胞的解离效果。
11. 孵育结束后，加入10 mL中和液（50% DMEM/50% F12含谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清）以中和胰蛋白酶活性，并用10 mL血清移液管混匀。所加中和液体积应与所用胰蛋白酶体积相等。
12. 在4 °C条件下以2,000 × g离心10分钟。
13. 弃去上清液，将沉淀物重悬于1 mL培养基（50% DMEM/50% F12含谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、20% L929上清液、10%胎牛血清）中。
    注意：L929细胞培养于DMEM培养基（含谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清）中。细胞培养应遵循ATCC推荐的方法。上清液应从融合度至少达到75%的培养瓶中收集。可批量收集并储存在-80 °C，以防止生长因子降解。建议将L929上清液单独加入各培养瓶中，而非直接添加至基础培养基储备液中。
14. 将细胞接种于适合贴壁细胞生长的T-25培养瓶中，并加入4 mL额外培养基。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。轻轻振荡培养瓶，使组织均匀分散。振荡时避免液体接触瓶口，以防污染风险增加。

2. 细胞培养（第2天）

1. 在第0天从T-25培养瓶中收集培养基，平均分装至三个1.5 mL离心管中。用1 × PBS洗涤培养瓶一次，轻轻晃动培养瓶以去除残留的组织碎片。避免剧烈震荡，因少量残留碎片不会对培养产生不利影响。向培养瓶中加入5 mL新鲜培养基。
2. 将收集的培养基于4 °C、1,466 × g（4000 rpm）离心4分钟。
3. 弃去每管中的上清液，向其中一管加入1 mL培养基，用移液器充分混匀。将含有细胞的混合培养基依次转移至其余各管中，每加一次均用移液器充分混匀，最后将所有细胞汇集至同一管中。
4. 将细胞接种至另一个适合贴壁细胞生长的T-25培养瓶中，加入4 mL培养基，于37 °C、5% CO₂条件下培养。

3. 细胞培养（第4天）

1. 弃去两个烧瓶中的培养基，向烧瓶中加入新鲜的 5 mL 培养基。
2. 将烧瓶置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 2 天。

4. 细胞培养（第6天）

1. 细胞将可用于后续实验。

结果

通过采用上述方案（图1），我们成功从活体手术切除的脑组织中分离出原代人源小胶质细胞。培养的细胞使用蓖麻凝集素-1（Ricinus communis agglutinin-1，RCA-1）对小胶质细胞进行染色（绿色），并使用胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）对星形胶质细胞进行染色（红色）（图2），方法如前所述^{22,23,24,25,26}。使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）对细胞核进行染色（...

讨论

小胶质细胞在正常脑组织中维持稳态，并在多种神经系统疾病的病理生理过程中发挥核心作用⁴小胶质细胞在神经发育和突触形成中起核心作用²小胶质细胞研究已被证明对于理解多种神经系统疾病的发生与发展至关重要⁴啮齿类动物的小胶质细胞是原代小胶质细胞研究中最常用的选择模型，尽管在多个关键方面，啮齿类动物的小胶质细胞与原代人类小胶质细胞存在差异。¹³开发经济高效且高产量的原代人小胶质细胞分离方案可能有助于弥补这一空白。我们建立了一种从活体手术切除的成年人大脑组织中分离原代人小胶质细胞的方案。经检测，所获小胶质细胞纯度约为80%，检测时间为第7天^th 天

该实验方案中最关键的步骤之一是将获取的组织运输至实验室进行处理。由于运输时间约为75分钟，我们可能无法成功分离出任何细胞。为此，我们使用一个50 mL离心管，仅加入10 mL aCSF。aCSF提供了组织所需的营养物质，而管内剩余的空间有助...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素-抗真菌素溶液	Himedia	A002
氯化钙	Sigma	223506
离心机（4 °C）	Sigma	146532
离心管	Abdos	P10203
CO2 培养箱	New Brunswik	Galaxy 170 S
D-葡萄糖	Himedia	GRM077
含谷氨酰胺的DMEM培养基	Himedia	AL007S
胎牛血清	Himedia	RM9955
锥形离心管（50 ml）	Thermo Fsiher Scientific	50CD1058
荧光素标记蓖麻凝集素-1	Vector	FL-1081
荧光显微镜	Leica	DM2000LED
含DAPI的Fluoroshield封片剂	Sigma	F6057
GFAP抗体	GA5	3670S
摇床培养箱	New Brunswik Scientific	Innova 42
L929细胞系	ATCC	NCTC克隆929 [L细胞，L-929，Strain L的衍生株] (ATCC CCL-1)
层流洁净台	Thermo Fsiher Scientific	1386
氯化镁	Himedia	MB040
磷酸二氢钠	Merck	567545
Ham's F-12营养混合物培养基	Himedia	Al106S
培养皿	Duran Group	237554805
磷酸盐缓冲液	Himedia	ML023
氯化钾	Himedia	MB043
血清移液管	Labware	LW-SP1010
碳酸氢钠	Himedia	MB045
蔗糖	Himedia	MB025
注射器滤器（0.2μm，25 mm直径）	Axiva	SFPV25R
适用于贴壁细胞培养的T-25细胞培养瓶	Himedia	TCG4-20X10NO
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Gibco	25200-056