从成人人类脑组织获取人类微胶质

中枢神经系统（CNS）由神经元和胶质细胞1的复杂网络^组成。在胶质细胞中，微胶质作为^{CNS2，3的先天免疫细胞。}微胶质负责维持健康CNS^{4中的平衡。}微胶质在神经发育中也扮演着重要的角色，通过修剪突触^2。微胶质是几种神经系统疾病病理生理学的核心，包括但不限于;阿尔茨海^默病5，帕金森病^{6，中风7，多}发性硬化^症8，创伤性脑损伤^9，神经病变^疼痛10，脊髓损伤¹¹和脑肿瘤如胶质^瘤12。

与中枢系统平衡和疾病相关的研究利用啮齿动物微胶质，由于缺乏成本效益和时间效率的人类原发性微胶质分离协议^13。在伊巴-1、PU.1、DAP12和M-CSF受体等基因的表达中，罗登特微胶质与原人类微胶质相似，在理解正常和患病的大脑^{13方面是有效的}。有趣的是，几个免疫相关基因，如TLR4，MHC II，西格尔克-11和西格尔克-3的表达在人类和啮齿动物微胶^{质13之间不同}。几个基因的表达在时间表达和神经退行性疾病中也各不相同，在这两个物种^{14，15。14,}这些显著差异使人类微胶质成为研究平衡和疾病中微胶质功能的重要模型。原发性人类微胶质也可以是一个有效的工具，用于临床前筛选潜在的药物候选^者16。上述原因突出表明，越来越需要对分离原人类微胶质的具有成本效益的协议。

我们开发了一种从成人人类脑组织中分离原发性人类微胶质的方案，该机制是为肿瘤切除或其他手术切除而创建的手术窗口。此处的方法与现有方法大不相同。我们能够在从组织采集场开始分离协议后，在从组织采集场大约75分钟的传输时间分离和培养微胶质。我们利用L929成纤维细胞的上一体来促进分离微胶质的生长。该方法特别侧重于仅初级微胶质的培养和发展。由此产生的培养是大约80%的微胶质。虽然其他协议通过密度梯度离心、流式细胞学和磁珠提供丰富的微胶质文化，但该协议是培养^,初级人类微胶质^,17、18、19、20的快速、^17,18简单、健壮且具有^{成本效益的方法}。¹⁹能够利用手术切除活的成人脑组织，而不是固定脑组织从尸体证明这种方法的附加优势，相比之下，现有的程序18，21。^18,21

所有组织都是在印度理工学院乔德普尔和全印度医学研究所（AIIMS）乔德普尔的伦理委员会进行伦理批准后获得的。

1.组织采集和加工（第 0 天）

1. 收集含有 10 mL 冰冷人工脑脊液 （aCSF） 的 50 mL 管中的组织 （2 mM CaCl₂+2H₂O， 10 mM 葡萄糖， 3 mM KCl， 26 mM NaHCO_3，2.5 mM NaH₂PO_4，1 mM MgCl₂+ 6H₂O， 202 mM 蔗糖）²⁰.如果需要将组织转移到其他位置，请确保将管子放在冰上。
   注:在自动处理蒸馏水中准备一个CSF。用层罩中 0.22 μm 注射器过滤器进行过滤。这可以在4°C下储存1个月。
2. 用 70% 的酒精小心擦拭收集管，然后转移到无菌层气流室。
3. 小心丢弃 aCSF，在无菌条件下称重组织。组织重量对于计算后续步骤所需的尝试素-EDTA 体积至关重要。
4. 将组织在37°C下保持新鲜温暖的ACSF5分钟。此步骤对于避免细胞死亡至关重要。
5. 在 37 °C 下丢弃 aCSF，用 1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤组织一次。 确保所有血液都经过反复的 PBS 洗涤（根据需要）洗去。
6. 在37°C的暖PBS中孵育组织5分钟。
7. 小心丢弃 PBS，将组织转移到消毒的培养皿中。PBS 可使用移液器去除。这将防止任何组织损失。
8. 使用无菌手术刀将组织切成小块（至少1毫米^3）。细切组织通过 trypsin-EDTA 确保更高的产量，为组织分离提供更高的组织表面积。
9. 将切碎的组织转移到含有 0.25% trypsin-EDTA 10 mL/g 组织的 50 mL 管中，并通过 10 mL 血清移液器移液混合。将 2 mL 的 trypsin/EDTA 添加到培养皿中，并在移液器的帮助下彻底清洗盘子。将此 trypsin 重新添加到猎鹰管中。这最大限度地减少了组织和细胞在切块时的损失。
10. 在 250 rpm 的 37 °C 下，在摇床上孵育管 30 分钟。此步骤增加了细胞与组织的分离。
11. 在孵育结束时，加入10 mL的中和介质（50%DMEM/50%F12与谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素，10%FBS）中和尝试蛋白。与 10 mL 血清移液器混合。添加的中和介质量应等于使用的 trypsin 量。
12. 在 4 °C 下以 2，000 x g 离心管 10 分钟。
13. 丢弃上一甲酸酯，在培养基的1 mL中重新悬浮颗粒（50%DMEM/50%F12与谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素，20%L929上上液，10%FBS）。
    注:L929细胞在DMEM中培养（谷氨酰胺DMEM，1%青霉素链霉素，10%FBS）。对于细胞培养，应采用 ATCC 推荐的培养方法。必须从至少 75% 的汇合的培养瓶中收集上流水剂。它可以批量收集，并储存在-80°C，以防止生长因子的退化。建议在烧瓶中单独添加 L929 上大液，而不是添加到库存培养介质中。
14. 将细胞板在T-25烧瓶中，适合粘附细胞，并添加4 mL的额外培养培养。在37°C下用5%CO₂孵育烧瓶。小心地摇动烧瓶，以均匀地分散组织。避免在摇动时将介质带到烧瓶的颈部，因为这样可能会增加污染的机会。

2.细胞培养（第2天）

1. 通过收集每个管中等量的介质，从第 0 天准备的 T-25 培养瓶中收集介质，在三个 1.5 mL 离心管中收集介质。用 1 x PBS 清洗烧瓶一次。轻轻摇动烧瓶，清除任何残存的组织碎片。避免烧瓶剧烈摇晃，因为任何残块不会对文化产生负面影响。将 5 mL 新鲜文化介质添加到烧瓶中。
2. 在 4 °C 下以 1，466 x g （4000 rpm） 将收集的介质离心 4 分钟。
3. 丢弃每个管中的上流水液，并将 1 mL 培养介质添加到其中一根管中。与移液器彻底混合。串行将带细胞的混合介质添加到其他管中。与移液器彻底混合，将细胞混合在一个管中。
4. 将细胞板在单独的T-25烧瓶中，适合粘附细胞。加入4 mL的培养基，在37°C下用5%CO_{2孵育烧瓶}。

3.细胞培养（第4天）

1. 丢弃两个烧瓶的介质，并在烧瓶中加入新鲜的 5 mL 文化介质。
2. 在37°C下用5%CO2孵育_烧 瓶2天。

4. 细胞培养（第6天）

1. 细胞将准备好进行进一步的实验。

通过使用上述协议（图1），我们能够将原人类微胶质从活的手术切除的脑组织中分离。培养细胞被染色的利西努斯共融质蛋白-1（RCA-1）乳胶微胶质（绿色）和胶质纤维酸蛋白（GFAP）为星形细胞（红色）（图2），如前面描述的22，23，24，25，26。,23,24,25,264°，6-二米迪诺-2-苯酚多勒（DAPI）用于染色核（蓝色）。在实验开始的第六天，细胞已经做好了进一步实验的准备。染色细胞被计算为盲微胶质和星细胞存在于培养中。大约80%的主要培养是微胶质（图2）。

图1:从成人大脑分离原发微胶质图。 手术切除的组织被收集在50 mL管中的冰冷10mL的ACSF中，并转移到实验室。组织分别用ACSF和PBS清洗，并切碎，与三辛-EDTA的帮助分离，并镀在T-25烧瓶中。第二天，媒体被收集并离心。丸子混合在新鲜介质中，镀在T-25烧瓶中。新的介质被添加到第一个烧瓶。在交替的天数中，两个烧瓶中的介质都发生了变化。细胞已准备好在6日进行进一步实验。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:分离原人类 微胶质的免疫细胞化学.（A）分离细胞镀在两井室幻灯片中，并染色为星形细胞的GFAP（绿色第一面板）或RCA微胶质（绿色二面板）。核被染成蓝色与 DAPI 。RCA 和 GFAP 的二级抗体对照显示在内嵌中。（B） 分离的细胞被镀在两井室的幻灯片中，并染色为 RCA 的微胶质（绿色）和用于星形细胞的 GFAP（红色）。第二行显示 RCA 的对照和 GFAP 的二级抗体控制。核被染成蓝色与 DAPI 。（C） 细胞由盲控计数。定量代表一个盲目的控制计数。大约80%的细胞是微胶质。请单击此处查看此图的较大版本。

作者没有什么可透露的。