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改良的UPLC-UV法用于测定莴苣品种（Lactuca sativa L.）及作物野生近缘种（Lactuca spp.）中维生素C的含量

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DOI：

10.3791/61440

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2020年6月30日

 ,  ,  , 
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Unidad de Producción y Sanidad Animal, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 3Dpto Química Analítica, Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), 4Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出了一种利用UPLC-UV快速、可靠地定量Lactuca spp.中维生素C的方法，该方法可能适用于其他植物。关键步骤包括在稳定条件下进行样品制备和维生素C提取、将脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸，以及色谱分析程序的优化。

摘要

维生素，尤其是维生素C，是水果和蔬菜中重要的微量营养素。维生素C也是这些食物抗氧化能力的主要贡献者。生菜是全球消费者中最受欢迎的蔬菜之一。准确测定生菜及其他相关物种中维生素C含量的实验方案至关重要。本文介绍了一种采用超高效液相色谱-紫外检测（UPLC-UV）技术的方法，其中对样品制备、维生素提取及色谱条件进行了优化。

采集样品以代表整株植物，于 -80 °C 冻存并进行冷冻干燥，以防止发生不良氧化并便于后续操作。维生素C的提取在酸性介质中进行，这也有助于维持其稳定性。由于维生素C可存在于两种可相互转化的形式——抗坏血酸（AA）和脱氢抗坏血酸（DHAA），因此为实现准确定量，需同时测定这两种化合物。DHAA通过还原为AA后间接测定，因为在紫外光谱范围内，AA的吸光度高于DHAA。从同一提取物中进行两次测定，一次在还原反应前，一次在还原反应后。第一次测定的是AA含量，第二次测定的是以AA形式存在的AA与DHAA的总和（TAA：总抗坏血酸）。随后，通过从TAA中减去第一次测定得到的AA量，间接获得DHAA的含量。采用UPLC-UV法进行测定，使用市售AA标准品绘制校准曲线，并优化色谱条件，以在较短时间内获得完全分离的AA峰。该方法可轻松外推至其他任何植物材料，通常仅需微小调整或无需更改。其准确性揭示了原本无法察觉的统计学显著差异。文中还更深入地讨论了该方法的其他优势与局限性。

引言

栽培生菜（Lactuca sativa L.）是全球产量和消费量最高的叶类蔬菜之一，2018年总产量约为2730万吨1。消费者普遍认为生菜是一种健康食品。其营养价值主要归因于作物中富含的抗氧化化合物，如维生素C，以及其他多酚类物质和维生素E2。维生素C对人类而言是一种必需的微量营养素，而不同于许多其他脊椎动物，人类由于编码生物合成途径最后一步酶的基因发生突变，无法自身合成维生素C3。维生素C是正常细胞代谢所必需的，也因其抗氧化活性而在免疫应答中发挥重要作用3,4。

总维生素C由抗坏血酸（AA）和脱氢抗坏血酸（DHAA）组成。AA是该维生素生物活性最强的形式，但DHAA（其氧化产物）也具有生物活性，并且可在人体内迅速转化为AA5。因此，定量测定这两种形式对于确定任何园艺作物（包括生菜）的总维生素C含量至关重要。

已采用基于不同分析技术的多种方法来测定蔬菜中的维生素C含量，例如酶法、分光光度法和滴定法6,7,8。尽管这些方法操作简便，但对抗坏血酸（AA）缺乏化学特异性9。因此，色谱法更受青睐，尤其是高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV），因其具有更高的准确性10。HPLC-UV已被用于测定多种作物中的维生素C含量，如西兰花、菠菜和生菜11,12,13。然而，由于脱氢抗坏血酸（DHAA）在紫外光谱范围内的吸光度较低，同时定量AA和DHAA较为困难。另一种方法是通过还原剂将DHAA间接测定：先将DHAA还原为AA，测定总抗坏血酸（TAA）含量，再通过TAA与AA的差值计算DHAA含量。由于需要还原反应，在一些研究中仅测定了AA含量14，这可能导致对维生素C活性的低估。即使采用液相色谱技术的最新进展——超高效液相色谱（UPLC），仍需通过上述还原反应间接测定DHAA。该步骤还可充分利用UPLC相较于HPLC的优势：更高的效率和分辨率、更高的灵敏度、更短的分析时间以及更低的溶剂消耗15。因此，UPLC-UV技术已被用于测定不同作物中的维生素C含量16。

此外，抗坏血酸（AA）是一种极不稳定的分子，因此开发一种能够防止其在生菜贮藏和维生素C分析过程中降解的实验方案至关重要9。在此背景下，本实验方案提供了通过超高效液相色谱-紫外检测法（UPLC-UV）快速且改进地定量生菜中维生素C含量的方法，以及一种高效的提取流程。本研究不仅包含了优良栽培品种，还纳入了传统地方品种及部分野生近缘种，因其在作物育种中具有潜在应用价值，特别是在提升生菜营养品质方面。

方案

1. 植物材料准备

  1. 每株植物取至少两片叶片样本，分别取自外层（较老）和内层（较嫩）的叶片，以更准确地代表整株植物。每个样本至少采集三个生物学重复。
  2. 立即使用液氮冷冻样本，并在 -80 °C 下保存直至使用。确保液氮未进入管内，否则由于气化过程中气体膨胀，管子在取出时可能发生爆炸。
    注意：使用液氮存在潜在危险，必须佩戴手套和面罩。
  3. 打开管盖，将样品置于冷冻干燥机（材料表）冷冻干燥室内的托盘上，按以下程序运行：-25 °C 冷冻 72 小时，-10 °C 10 小时，0 °C 10 小时，20 °C 至少 4 小时。冷冻干燥过程中，冷凝器温度和真空度应分别保持恒定在 -80.2 °C 和 112 mTorr。
  4. 当材料完全干燥后（根据植物种类和管内样品压实程度，通常需 4 至 7 天），分别在 4 °C、-20 °C 或 -80 °C 下保存，适用于短期（数天至数周）、中期（数月）或长期（数年）储存。建议在装有样品的管中加入含硅胶珠的袋子。
  5. 将冻干样品连同直径为 10 mm 的不锈钢研磨珠一起放入 20 mL 聚丙烯管中，使用多管涡旋仪，根据所需强度和时间研磨至细粉状。
    注意：整个操作过程中应避免样品暴露于直射光线下。

2. 试剂与溶液的配制

  1. 配制溶剂提取液：8% 乙酸（v/v）、1% 偏磷酸（MPA，meta-phosphoric acid）（w/v）、1 mM EDTA（乙二胺四乙酸）。
    1. 根据每个样品需加入 5 mL 提取液，计算处理全部样品所需的溶剂总体积。配制 1 L 溶液时，向烧瓶中加入：30 g MPA、0.372 g EDTA 二水合物、80 mL 乙酸和 500 mL 超纯水（按比例调整体积和用量）。用塑料薄膜密封烧瓶口。
    2. 借助磁力搅拌器溶解后，使用容量瓶准确定容至 1 L，补加所需量的超纯水。
  2. 配制还原反应缓冲液（0.5 M Tris（2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇），pH 9.0）和还原溶液（40 mM DTT（1,4-二硫苏糖醇）溶于 0.5 M Tris，pH 9.0）。
    1. 根据每个样品需加入 200 µL 还原溶液，计算处理全部样品所需的还原溶液总体积。配制 100 mL 缓冲液时，向烧杯中加入：6.055 g Tris 和 90 mL 超纯水（按比例调整体积和用量）。用塑料薄膜密封烧杯口。
    2. 借助磁力搅拌器溶解后，用 2 M HCl 调节溶液 pH 至 9.0，并使用容量瓶准确将体积定容至 100 mL，补加所需量的超纯水。
    3. 配制 100 mL 还原溶液时，向烧杯中加入：0.629 g DTT（纯度：98%）和 90 mL 前一步骤（2.2.1 至 2.2.2）已配制的缓冲液（0.5 M Tris，pH 9.0）（按比例调整体积和用量）。用塑料薄膜密封烧杯口。
    4. 借助磁力搅拌器溶解后，使用容量瓶准确将体积定容至 100 mL，补加所需体积的 0.5 M Tris 缓冲液（pH 9.0）。
      注意：还原溶液极不稳定，强烈建议使用新鲜配制的溶液。
  3. 硫酸（0.4 M H2SO4）
    1. 根据每个样品需加入 200 µL，计算处理全部样品所需的 0.4 M 硫酸总体积。配制 100 mL 溶液时，向烧杯中加入：80 mL 超纯水，然后缓慢加入 2.22 mL H2SO4（纯度：96%，密度：1.84 g mL-1）。使用容量瓶准确将体积定容至 100 mL，补加所需量的超纯水。
      注意：硫酸具有强腐蚀性，操作时必须佩戴防护装备并在通风橱内进行。此外，应将酸缓慢加入超纯水中，切勿将水加入酸中，以减少酸雾产生并避免事故发生。
  4. 盐酸（2 M HCl）
    1. 配制 100 mL 2 M 盐酸时，向烧杯中加入：80 mL 超纯水，然后缓慢加入 6.13 mL HCl（纯度：37%，密度：1.19 g mL-1）。用塑料薄膜密封烧杯口。使用容量瓶准确将体积定容至 100 mL，补加所需量的超纯水。按比例调整体积。
      注意：盐酸具有强腐蚀性，操作时必须佩戴防护装备并在通风橱内进行。此外，应将酸缓慢加入超纯水中，切勿将水加入酸中，以减少酸雾产生并避免事故发生。
  5. 抗坏血酸（AA）标准品溶液（储备液及稀释液）
    1. 使用精密天平准确称取 10 mg 抗坏血酸标准品（纯度：99%），加入 90 mL 流动相（含甲酸的 pH 2.0 超纯水）。
    2. 借助磁力搅拌器溶解后，使用容量瓶准确将体积定容至 100 mL，补加所需量的含甲酸的 pH 2.0 超纯水。
      注意：该储备液需避光保存。
    3. 根据 表 1 中的说明，从抗坏血酸标准品储备液配制五个稀释浓度，用于建立标准曲线，并继续进行第 5.2 步。
标准品[AA] (µg mL-1)AA (100 µg mL-1) 溶液 (µL)流动相 (µL)a
10.55995
22.525975
3550950
410100900
525250750
a用甲酸酸化的超纯水，pH 2.0。

表1：制备五种抗坏血酸（AA）标准溶液的方案。 表中列出了配制各浓度标准溶液所需的溶质和溶剂体积。

3. AA与DHAA的提取

注意：建议在提取步骤期间于低光照强度条件下操作。

  1. 取一个15 mL聚丙烯离心管，加入50 mg冻干并研磨的样品以及5 mL提取溶剂（步骤2.1）。
  2. 先用涡旋振荡器震荡混合物5秒，然后在2000 rpm条件下使用轨道摇床震荡10分钟。
  3. 将离心管置于超声波清洗器中，在室温下开启超声处理10分钟。
  4. 在4 °C条件下以4,000 × g 离心10分钟。
  5. 收集上清液，经0.22 µm再生纤维素滤膜过滤后，储存于5 mL棕色样品瓶中。此即为提取物1（Extract 1），其中含有AA和DHAA。
    注意：本方案可在该步骤暂停，将提取物于-80 °C冷冻保存，并避免光照；由于AA和DHAA在光照、高温或氧化性环境中极不稳定且易降解，因此需采取避光保护措施（补充文件1）。

4. 将DHAA还原为AA以提取总抗坏血酸

  1. 将 200 µL 的提取液 1 转移至一个 2 mL 棕色小瓶中用于液相色谱分析，加入 200 µL 还原溶液（步骤 2.2）。用带预开口的聚四氟乙烯-硅胶塞密封小瓶，并用涡旋振荡器震荡 5 秒。
  2. 将溶液在室温下避光静置 30 分钟。
  3. 加入 200 µL 的 0.4 M H2SO4 以终止反应，并在酸性 pH 条件下稳定抗坏血酸（AA）。所得溶液为提取液 2，其中仅含抗坏血酸，实际为总抗坏血酸（TAA）。

5. 测定

  1. UPLC-UV 样品制备
    1. 制备 表 2 中所述的工作溶液，经 0.22 µm 滤膜过滤后，超声至少 10 分钟，并将其放入 UPLC 系统中。
    2. 开启三台 UPLC 模块，等待内部校准过程完成。
    3. 打开软件（例如 Empower 3），加载 表 2 中描述的仪器程序：Empower 3 | 运行样品 | 维生素 C 方法 | UPLC_PDA | 使用 QuickStart。
    4. 软件加载正确程序后，进入 UPLC 管理控制台：四元溶剂管理器 | 右键单击 | 启动控制台。
    5. 进行 UPLC 仪器的准备与稳定化：系统 | 控制 | 启动。
      1. 对所有 UPLC 管路进行至少 5 分钟的排空冲洗：溶剂预冲洗 | QSM | 选中 A、B、C、D 及密封清洗 | 冲洗时长 > 5 分钟。
      2. 冲洗并清洗进样器：溶剂预冲洗 | SM | 检查清洗溶剂（> 45 秒）和检查排空溶剂（> 35 次循环）。
      3. 将 UPLC 平衡至方法条件：平衡至方法 | QSM | 流速（0.3 mL min-1）| 溶剂 A（2%）| 溶剂 B（0%）| 溶剂 C（98%）| 溶剂 D（0%）；平衡至方法 | SM | 样品（5 °C）| 色谱柱（30 °C） 以及 平衡至方法 | 其他 | 确认灯开启 | 点击开始。
      4. 等待至少 1 小时（建议更长时间）以使设备稳定。可通过 启动控制台 中的压力监测验证稳定性：系统 | 四元溶剂管理器 | QSM 系统压力。确保柱压无明显上升或下降趋势，且压力变化的差值小于 10 psi。
    6. 在 QuickStart 界面中，填写待分析的标准品和样品名称矩阵。
  2. 标准品中抗坏血酸（AA）的测定
    1. 取 1 mL 前期已制备的五种抗坏血酸标准溶液（步骤 2.5.3）分别转移至 2 mL 棕色液相色谱小瓶中。用带预穿孔的聚四氟乙烯-硅胶塞密封小瓶，向 UPLC 仪器中进样 5 µL。
    2. 按照 表 2 中所述程序进行色谱分析，顺序从最稀释到最浓的标准品依次进行。
  3. 样品中抗坏血酸（AA）的测定
    1. 用移液器吸取 200 µL 提取液 1，加入 2 mL 棕色液相色谱小瓶中，并加入 800 µL 超纯水。用带预穿孔的聚四氟乙烯-硅胶塞密封小瓶，向 UPLC 仪器中进样 5 µL。
    2. 按照 表 2 中所述程序进行色谱分析。
  4. 样品中总抗坏血酸（TAA）的测定
    1. 向提取液 2 中加入 400 µL 超纯水。用带预穿孔的聚四氟乙烯-硅胶塞密封小瓶，向 UPLC 仪器中进样 5 µL。
    2. 按照 表 2 中所述程序进行色谱分析。
组分与参数描述
仪器Acquity UPLC H-Class
检测器PDA eλ 检测器，AA 的吸收波长 λabs = 245 nm
软件Empower 3
色谱柱Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm)
通道 ACH3OH
通道 B/清洗液H2O:CH3OH (50:50 v:v)
通道 C超纯水，用甲酸调节 pH 至 2.0a
通道 D/密封清洗液超纯水:乙腈 (90:10 v:v)
流动相2%A + 98%C，流速 0.3 mL min-1（等度洗脱模式）
色谱柱温度30 °C
自动进样器温度5 °C
进样体积5 µL
AA 保留时间1.874 min
运行时间3 min
a甲酸用量未定，调节至所需 pH 值为止

表2：用于测定莴苣及其野生近缘种提取物中抗坏血酸（AA）的优化色谱程序。 所用组分、条件和溶液的说明。

6. AA 与 DHAA 的定量分析

  1. 统计分析
    1. 按照Bertolín等人的描述确定色谱方法的分析参数。18 (表3).
      注意：所列参数值在 表3 需要在特定的实验条件下进行定义。
方法的分析参数数值
线性范围 (μg mL-1)0.5-25
线性方程y=53,143.03x
R20.99998
检出限 (mg AA g-1 干物质)0.013
定量限 (mg AA g-1 干物质)0.045
重复性 (CV, %)a1.75
中间精密度 (CV, %)a4.22
回收率 (Rec, %)b95.6±2.4
aCV：变异系数
b回收率实验使用10份等分试样，每份含50 mg相同样品，其中5份添加2 mg AA g-1 干物质，另5份未添加。%Rec = ([添加样品中AA浓度] - [未添加样品中AA浓度]) / (添加量) × 100。

表3：AA（抗坏血酸）和TAA（总抗坏血酸）检测与定量的优化分析参数。 线性范围、校准曲线（R2）的方程与决定系数，以及AA（TAA相同）的检出限与定量限、重复性、中间精密度和回收率均采用5 μL的样品进样体积获得。

  1. 计算AA和TAA浓度。
    1. 打开标准品和样品的色谱图： 快速启动 | 浏览项目 | 频道 | “标准品或样品名称” | PDA Ch1 245 nm@1.2 nm.
    2. 通过点击标准品和样品中相应峰（AA 或 TAA）的起始点（约 1.790 min）并用鼠标拖动至其终点（约 1.910 min），对峰面积进行积分。
    3. 建立一条校准曲线，以通过色谱法测定的吸光度值（步骤5.2）对应上述配制的五种氨基酸标准品的浓度（表1).
    4. 根据第5.3和5.4步测定的样品吸光度值进行插值，分别使用以下公式计算AA和TAA浓度：
      线性方程 y=mx+n；数学公式；教学示意图；代数；斜率截距概念
      其中 y 是峰面积的积分值， x 是AA或TAA的浓度，单位为ppm m 和 n 斜率和 y所得回归直线的截距。
    5. 计算 DHAA 浓度时，应用以下公式：
      测定DHAA浓度的公式，[DHAA](µg/mL) = [TAA] − [AA]，化学分析。
      注意：为获得 DHAA、AA 和 TAA 的总浓度（单位：mg g⁻¹）-1 根据干重计算时，需将校准曲线直接插值得到的数值乘以提取液总体积和稀释倍数，再除以用于提取的样品重量。

结果

维生素C的定量分析 Lactuca 色谱方法的开发需要确保获得可靠的结果。 图1A 显示一个由非优化方案得到的色谱图（补充文件 2），其中出现了一个AA峰以及一个未识别的微小“肩峰”。然而，在优化提取和色谱条件后，获得了无未知化合物干扰的、分离良好的AA峰（图1B此外，使用UPLC-UV设备替代HPLC-UV，使我们能够在优化的色谱图中将抗坏血酸（AA）的保留时间（RT）缩短至1.874 min 与 2.980 分钟，而在未优化的条件下图1），以及优化和非优化方案的运行时间，分别为3分钟和7分钟。

抗坏血酸的高效液相色谱图和紫外吸收图，显示保留时间处的峰
图1：同一莴苣样品（商业品种‘Begoña’）中抗坏血酸（AA）的色谱图。（A）采用非优化方案得到的HPLC-UV色谱图（条件见补充文件2）。（B）采用优化方案获得的UPLC-UV色谱图（条件见表2）。请点击此处查看该图的放大版本。

在色谱过程中，由于峰重叠区域在两者之间的最低点通过垂直下切进行积分，导致分离不充分，从而引起抗坏血酸（AA、DHAA 和 TAA）含量的低估，这与 图 1A 中观察到的 AA 峰干扰现象一致（图 2）。这种偏差在作物野生近缘种中尤为明显，特别是在 DHAA 和 TAA 含量的测定中（图 2）。

分析菠菜品种中维生素C含量的小提琴图；不同方案对DHAA、AA、TAA水平的影响。
图2：维生素C含量的分布情况。采用非优化和优化方案测定的商业生菜品种、传统生菜品种及其部分野生近缘种中DHAA、AA和TAA含量（mg g-1 干重）的分列小提琴图。黑色线条表示平均值。请点击此处查看该图的放大版本。

此外，由于采用未经优化的实验方案，我们无法从结果中得出任何有意义的结论，因为结果显示所有样本（包括两种生菜及其野生近缘种）的维生素C含量均相似。相比之下，优化后的实验方案使我们能够检测到DHAA和TAA含量在它们之间存在的统计学显著差异。表4），其中最丰富的为野生种（图2).

未优化优化的
F 检验比p-值F值p-值
DHAA0.4600.637无内容可翻译。5.6130.009**
AA0.0700.932ns1.0200.374ns
TAA0.0150.985无内容可翻译。4.4380.022*
无内容可翻译。，* 和 ** 表示无显著性差异和具有显著性差异 p<0.05 和 0.01。

表4：维生素C含量的变化 F比值（组间方差与组内方差的比值）及单因素方差分析中考虑类型时的显著性值 莴苣属 （商业生菜品种、传统生菜品种和作物野生近缘种）在非优化和优化方案中 DHAA、AA 和 TAA 含量的测定

补充文件1：5 °C下24小时内的AA和TAA稳定性。 （A）24小时内AA和TAA的峰面积变化。（B）24小时内AA和TAA含量（mg g-1 干重）。柱状图表示在5 °C自动进样器中避光保存的两个技术重复样本的标准偏差（n=2）。请点击此处下载该文件。

补充文件2：TAA、AA和DHAA提取与定量分析中优化与非优化方案的主要差异。 两种情况下所用的样品相同。请点击此处下载该文件。

讨论

维生素C是一种非常重要的营养素，但也是一种极不稳定的化合物，因此其超高效液相色谱-紫外检测（UPLC-UV）定量结果依赖于多个因素，如样品的储存与制备、提取方法以及色谱条件。因此，需要建立一种快速且简单的操作流程，以防止具有抗氧化能力的抗坏血酸（AA）氧化为无抗氧化活性的脱氢抗坏血酸（DHAA）。在样品处理过程中，还必须避免高pH值、高温、强光以及氧化性气氛，以提高该化合物的稳定性。

为最大限度减少抗坏血酸（AA）的氧化，采取了以下措施。首先，两种方案均采用冷冻干燥的样品作为起始材料，以确保维生素C含量的准确定量，并便于样品处理。该方法优于文献中常见的精细研磨法19，因为研磨产生的粉尘解冻迅速，导致水分重新释放。在提取过程中，优化方案中使用了更大体积且酸性更强的提取液（8%乙酸和1%偏磷酸，MPA）（补充文件2），该提取液还可作为稳定剂，防止AA降解。此外，该提取液还含有EDTA作为螯合剂以增强稳定性16，而非优化方案的提取液则不含EDTA（补充文件2）。此外，我们还测试了是否可通过两次连续提取（每次使用2.5 mL提取液）替代单次5 mL提取，并在氮气（N2）氛围下操作替代标准大气条件，以提高提取效率。结果表明，在未改变的大气条件下仅进行一次提取即可获得最佳效果，从而简化了方案，避免了额外操作步骤（数据未显示）。此外，方案中还引入了其他若干微小改进，以增强提取效率（如超声处理）、获得更澄清的提取液（更精细的过滤）并缩短整体操作时间（补充文件2）。在色谱条件方面，方法学验证按照先前报道的方法进行18，确保了良好的分析参数（表3）。此外，采用超纯水含甲酸（pH 2.0）与甲醇（98:2 v:v）作为流动相，流速为0.3 mL min-1，替代原方案中30 mM磷酸二氢钾（pH 3.0）流动相并以1 mL min-1流速运行（补充文件2），显著改进了方法性能。其中最重要的改进可能是采用超高效液相色谱（UPLC）系统替代高效液相色谱（HPLC）系统，这使我们能够更精确地控制关键实验条件（如温度），在更短时间内实现AA峰的完全分离，避免了未知化合物的干扰，同时减少了提取液的消耗量（补充文件2）。

然而，该方法存在两个主要局限性。其一是由于脱氢抗坏血酸（DHAA）在紫外光谱区的吸收度较低，无法直接使用紫外检测器对其进行测定。准确量化DHAA含量非常重要，因为DHAA具有一定的生物活性，并且在人体内可轻易转化为抗坏血酸（AA）5。为此，需要额外进行一步还原反应，将DHAA还原为AA，再通过第二次色谱分析测定总抗坏血酸（TAA）含量，然后通过从TAA中减去AA含量，间接计算出DHAA含量（图3）。在此基础上，本研究通过提高还原剂（DTT）的浓度、将反应时间从5分钟延长至30分钟，并使用硫酸终止反应，对还原步骤进行了优化（补充文件2）。抗坏血酸（AA）的稳定性较差是该方法的第二个局限性。AA在提取后4小时即开始降解（补充文件1），因此必须在此时间窗口内完成其定量分析。这就使得样品提取的数量受到色谱分析流程的限制。因此，本方案建议在此步骤将样品冷冻保存。但在此情况下，并非所有样品都能同时放入UPLC自动进样器中进行自动检测。幸运的是，AA的保留时间（RT）缩短后，色谱图仅需3分钟即可完成，远短于高效液相色谱（HPLC）所需的7分钟（补充文件2）。因此，在4小时的时间窗口内，可对大量样品完成维生素C含量的测定。

TAA 测定流程图；AA、DHAA 提取、UPLC-UV 结果、数据分析、维生素分析。
图 3：生菜及其部分野生近缘种中维生素 C 定量分析的工作流程。
优化后实验方案的示意图，显示了用于测定 AA 或 AA + DHAA（TAA）的两个分支。请点击此处查看此图的放大版本。

由于维生素C是人体必需的营养素，且具有重要的健康益处，已成为众多研究的对象。因此，已在多种作物中对其进行了定量分析，包括生菜——全球消费量最大的蔬菜之一。简单的经典方法已逐渐被液相色谱技术所取代，因为后者更具特异性和准确性10。然而，由于高效液相色谱法（HPLC）在定量抗坏血酸（AA）和脱氢抗坏血酸（DHAA）时需要额外的反应步骤，部分关于生菜的研究仅测定了AA14，或仅测定了总抗坏血酸（TAA）（未在将DHAA还原为AA之前单独定量AA）11。此外，尽管AA和DHAA均对维生素C的抗氧化活性有贡献，但仅有少数研究者对两者进行了分别定量2。然而，近年来超高效液相色谱（UPLC）技术的重要性日益凸显，因其在多种作物中测定维生素C时具有更高的性能16。本研究比较了UPLC与HPLC两种方法，证实了UPLC的优势：可获得因更高灵敏度而形成的清晰AA峰，并且分析时间极短，同时也意味着更少的资源消耗。尽管UPLC效率更高，但迄今为止仅有Chen等20将其应用于生菜中维生素C含量的测定，且仍存在低估问题，因其仅定量了AA形式。

综上所述，本研究首次成功实现了对不同生菜品种及其部分野生近缘种中总维生素C含量的测定。维生素C的定量对于在育种项目中筛选具有更高抗氧化活性的生菜品种至关重要。本研究发现生菜的野生近缘种中总维生素C含量较高，结合先前研究中报道的抗坏血酸（AA）含量升高以及其他抗氧化化合物的增加1421，进一步拓宽了可用于提升生菜营养价值的候选材料范围。

总之，尽管维生素C本身存在一些固有局限性，例如提取后数小时内会逐渐降解，或由于脱氢抗坏血酸（DHAA）的紫外吸收较弱而需进行还原反应，但该方法在测定维生素C含量时仍具有操作简便、耗时较少的优势。此外，该方法还具有高度的稳健性，以及良好的灵敏度和分辨能力。更重要的是，该方法不仅可轻松转移应用于其他植物材料（仅需微调或无需调整），还可用于提供人体维生素C膳食摄入的加工产品，因而为新兴的食品质量可靠性检测领域带来了广泛的应用前景。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们衷心感谢西班牙萨拉戈萨蔬菜种质库（BGHZ-CITA，西班牙）和荷兰瓦赫宁根遗传资源中心（CNG）为本研究提供所需种子。感谢CITA的J. A. Aranjuelo、A. Castellanos以及“营养评价实验室”提供的技术支持，感谢D. L. Goodchild对英文语言的审校。本研究由西班牙国家农业与食品研究技术研究所（INIA）资助项目RTA2017-00093-00-00和阿拉贡政府资助项目LMP164_18支持；同时得到欧洲区域发展基金（FEDER）阿拉贡2014-2020年运营计划及欧洲联盟欧洲社会基金的支持[巩固研究组A12-17R：“果树学研究组：特征鉴定、适应性与遗传改良”和A14-17R：“可持续农业食物系统”（SAGAS）]。I. M.L. 受西班牙科学、创新与大学部（MCIU）和西班牙国家科研署（AEI）提供的博士前培训合同资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,4-二硫苏糖醇（DTT）≥98%（Ellman′s试剂）Roche10197777001
10 mm Φ 不锈钢球Euro Aznar Supplies S.L.20112100
15 mL 聚丙烯离心管Deltalab429946
2 mL HPLC 棕色小瓶Agilent5190-9063
2 mL 带针头注射器DeltalabJS2
20 mL 聚丙烯管Deltalab202840
2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇（TRIS）≥99.9%（滴定法）Roche10708976001
50 mL 聚丙烯管Deltalab429951
乙酸（CH3COOH）≥99% 纯度，冰醋酸，ReagentPlusSigma-AldrichA6283
乙腈，HPLC 超梯度级（99.9+% CH3CN-0.2 µm 过滤）Chem-labCL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（150 mm × 2.1 mm × 1.8 µm）Waters186003540
烧杯 1 L、200 mLDeltalab191725, 191722
磷酸氢二钾（KH2PO4）Panreac766384仅用于非优化方案（补充文件2）
乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA × 2H2O），含量99-101%，ACS级试剂Panreac131669
Fisherbrand 模拟多管涡旋振荡器Thermo Fisher Scientific15549004
甲酸 98-100%，HPLC级 LiChropurSupelco5438040100
VirTis genesis 25EL 冷冻干燥机VirTisna
Heidolph Multi Reax 混合器Heidolphna
Heidolph Reax top 混合器Heidolphna
配备 eλ 检测器的 Hewlett Packard HPLC 1050Hewlett Packardna仅用于非优化方案（补充文件2）
盐酸（HCl）37% 纯度，ACS级试剂Sigma-Aldrich320331
L-抗坏血酸 ≥99%，ACS级试剂Sigma-Aldrich255564
偏磷酸（MPA），ACS级试剂，片状，33.5-36.5%Sigma-Aldrich239275
甲醇 ≥99.9%（HPLC超梯度级）ChemLabCL00.0189.2500
微量移液器 10-1000 μLSocorexna
Nucleosil 120 C18 Tracer 色谱柱（250 mm × 4 mm × 5 µm）Merck (Sigma-Aldrich)54919仅用于非优化方案（补充文件2）
带预穿孔的聚四氟乙烯-硅胶盖Agilent5190-9067
Gyrozen 1248R 制冷离心机Gyrozenna
再生纤维素滤膜 0.22 µm（13 mm）Agilent1015190-5108
再生纤维素滤膜 0.45-µm（13 mm）LabboxSFCA-145-100仅用于非优化方案（补充文件2）
Heλios β 分光光度计Thermo Scientific Corporationna
硫酸（H2SO4）95.0-98.0% 纯度，ACS级试剂Sigma-Aldrich258105
超纯水WasserLabna
Ultrasons H-D 超声仪Selectana
容量瓶 1 L、100 mLDeltaLab191489, 191486
配备PDA eλ 检测器的Waters Acquity UPLC H-ClassWatersna

参考文献

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