方法文章

小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞及神经元的分化与鉴定

DOI：

10.3791/61446

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2020年5月15日

 ,  ,  , 
1Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Penn State College of Medicine, Penn State Hershey Cancer Institute

本文内容

摘要

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我们描述了利用悬滴法将小鼠胚胎干细胞在体外分化为神经元细胞的实验步骤。此外，我们通过RT-qPCR、免疫荧光、RNA测序和流式细胞术进行了全面的表型分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了将小鼠胚胎干细胞培养并分化为神经细胞系的逐步操作流程，随后通过一系列检测方法对已分化的细胞进行表征。采用E14小鼠胚胎干细胞，通过悬滴法形成拟胚体，随后使用视黄酸诱导其分化为神经前体细胞，最终进一步分化为神经元。定量 逆转录 聚合酶链式反应（RT-qPCR）和免疫荧光实验结果显示，在分化后第8天和第12天，神经前体细胞和神经元分别表达相应的标志物（神经前体细胞标志物为nestin，神经元标志物为neurofilament）。对携带Sox1启动子驱动GFP报告基因的E14细胞系进行流式细胞术分析表明，分化第8天约有60%的细胞呈GFP阳性，提示此阶段神经前体细胞已成功分化。最后，通过RNA-seq分析对全转录组的动态变化进行了系统性表征。这些方法可用于研究特定基因和信号通路在神经分化过程中调控细胞命运转变的作用。

引言

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自从小鼠囊胚发育阶段的内细胞团首次分离出小鼠胚胎干细胞（mESC）以来1,2，mESC 已被广泛用作研究干细胞自我更新与分化能力的有力工具3。此外，研究 mESC 的分化过程有助于深入理解分子机制，从而提高基于干细胞治疗神经退行性疾病等疾病的疗效与安全性4。与动物模型相比，这种体外系统具有诸多优势，包括操作和评估简便、维持细胞系的成本远低于动物饲养，以及遗传操作相对容易。然而，分化细胞类型的效率和质量常常受到不同 mESC 细胞系以及分化方法的影响5,6。此外，传统评估分化效率的方法依赖于对特定标志基因的定性检测，缺乏足够的稳健性，因而难以全面捕捉基因表达的整体变化。

本研究旨在利用一系列检测方法对神经元分化进行系统性评估。通过针对特定标志物的传统体外分析结合RNA测序（RNA-seq），我们建立了一个平台，用于测量分化效率以及该过程中转录组的动态变化。基于先前建立的方案7，我们采用悬滴法生成拟胚体（embryoid bodies, EBs），随后使用超生理浓度的视黄酸（retinoic acid, R....

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方案

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1. 小鼠胚胎干细胞培养

  1. 用 0.1% 明胶包被一个 10 cm 的组织培养处理板，并让明胶静置至少 15–30 分钟，然后吸除。
  2. 在将小鼠胚胎干细胞（mESCs）接种至预热的 mESC 培养基前一日，接种经 γ 射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。（mESC 培养基为含 15% 胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、丙酮酸钠、LIF、PD0325901（PD）和 Chir99021（CH）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM））。
  3. 在培养 E14 细胞前，让经 γ 射线照射的 MEFs 沉降并贴附于培养板表面。
  4. 在 37 °C 水浴中快速解冻 E14 ESCs，并迅速将细胞转移至含有温热 mESC 培养基的 15 cm 圆锥形离心管中。在 200 × g 条件下离心 3 分钟以收集细胞，弃去上清液。
  5. 用 10 mL mESC 培养基重悬细胞，并将细胞接种至先前已接种 γ 射线照射 MEFs 的培养板中。将细胞培养物置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育。
  6. 传代培养时，吸除培养基，并用无菌 1× PBS 洗涤培养板。加入足量 0.05% 胰蛋白酶以覆盖培养板表面，在 37 °C 下孵育 3 分钟。
  7. 用 mESC 培养基中和胰蛋白酶，并吹打形成单细胞悬液。在 200 × g 条件下....

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结果

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作为本方法的示例，我们对E14细胞进行了拟胚体（EB）、神经前体细胞（NPC）和神经元分化的实验。E14细胞在γ射线照射的MEF细胞上培养（图1A），直至γ射线照射的MEF细胞群体被稀释殆尽。我们通过碱性磷酸酶（AP）染色（图1B）以及后续的RT-qPCR检测Nanog和Oct4标志物（见下文）来确认E14细胞的多能性。随后，将去除γ射线照射MEF后的E14细胞按照图2A所示方案诱导分化。简言之，将含有500个细胞的20 µL分化培养基液滴接种于培养皿盖内表面（详见方案第2节）。形成的拟胚体被收集后转移至新鲜分化培养基中悬浮培养。在分化第4天至第8天期间，向培养皿中加入5 μM的视黄酸（RA）以诱导生成神经前体细胞。分化的拟胚体呈圆形，且在分化过程中体积持续增大（图2B）。在第8天，收集NPC并用胰酶消化，将所得单细胞悬液接种于含N2添加剂的DMEM/F12培养基中.......

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讨论

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小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的实验方法已建立数十年，研究人员持续对以往的实验方案进行改进，或为不同目的开发新的方案7,10,11。我们采用一系列检测手段，全面分析小鼠胚胎干细胞向神经元分化各阶段的效率与进程，该方法也可用于分析小鼠或人胚胎干细胞向其他谱系的分化。此外，我们的方法已被证明是体外评估特定基因或信号通路对神经元分化影响的有效工具8。

通过我们的方法，经视黄酸（RA）处理的多能性未分化ESC可高效地定向分化为神经谱系，并进一步诱导生成神经元7。为了提高胚胎干细胞向神经细胞分化的成功率并降低异质性，保持胚胎干细胞处于未分化状态至关重要12。经γ射线照射或丝裂霉素C处理的非增殖性MEF可维持ESC的多能性，并为其生长提供支架支持

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披露

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作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金（1R35GM133496-01）对 Z. Gao 的资助。我们感谢 Ryan Hobbs 博士在切片方面的协助。感谢 宾夕法尼亚州立大学医学院的核心设施，包括基因组科学与生物信息学、高级光学显微镜 显微成像和流式细胞术。我们还要感谢 Dr. Yuka Imamura 感谢在RNA-seq分析方面提供的帮助。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶 + 0.53 mM EDTA 1X康宁25-052-CV
0.1% 明胶SigmaG1890-100G在去离子水中制备
16% 多聚甲醛Thermo Scientific28908在 1X PBS 中稀释
40-&μ;m 细胞过滤器Falcon352340
AlbumaxThermo Fisher Scientific11020021
AlexaFluor 488 山羊抗小鼠 IgG （H+L）InvitrogenA11001抗体以 1：500 稀释用于 IF
碱性磷酸酶染色试剂盒 IIStemgent00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR 混合物 LoRoxAzura GenomicsAZ-2105
B27 补充剂Thermo Fisher Scientific17504044
BD FACSCantoBD657338
bFGFSigma11123149001
BioAnalyzer 高灵敏度 DNA 试剂盒Agilent5067-4626
Chir99021Cayman Chemicals13122
氯仿C298-500Fisher化学试剂
DAPI、InvitrogenR37606
DMEM康宁10-017-CM
DMEM/F12 培养基Thermo Fisher Scientific11320033
EB 缓冲液、Qiagen19086
乙醇111000200Pharmco用去离子水稀释
胎牛血清亚特兰大生物制剂S10250
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15
HiSeq 2500 测序系统IlluminaSY-401-2501
异丙醇BDH1133-4LGBDH VWR 分析在去离子水中
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030024
LIFN/AN/A 收集自 MEF 上清液
m18srRNA 引物IDTDNAN/A5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM
非必需氨基酸康宁25-025-Cl
mNanog 引物IDTDNAN/A5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGT-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes 引物IDTDNAN/A5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'mNeuroD1
引物IDTDNAN/A5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4
引物IDTDNAN/A5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6
引物IDTDNAN/A5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2
补充剂Thermo Fisher Scientific17502048
Nestin 一抗MilliporeMAB5326抗体以 1：200 稀释用于 IF
神经基础Thermo Fisher Scientific
神经丝一抗DSHB2H3
NEXTflex Illumina 快速定向 RNA-Seq 文库制备试剂盒BioO ScientificPD0325901
Cayman Chemicals13034
青霉素/链霉素康宁30-002-Cl
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）N/AN/A在去离子水中制备
- 氯化钾P217-500GVWR
- 无水磷酸二钾0781-500GVWR
- 氯化钠BP358-10Fisher 生物试剂
- 磷酸氢钠，二氢钠，七水合SX0715-1Milipore
随机六聚体引物Thermo ScientificSO142
视黄酸SigmaR2625在 DMSO
丙酮酸钠康宁25-000-Cl
蔗糖Sigma84097在 1X PBS
SuperScript III 逆转录酶Invitrogen18064022
Tissue-Tek O.C.T. 化合物Sakura4583
中制备TriPure 分离试剂Sigma-Aldrich11667165001
TruSeq RapidIllumina20020616
β-巯基乙醇Fisher 生物试剂BP176-100
、、、、稀释21103049物 中制备

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent....

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PCR RNA Sox1 GFP

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