小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞及神经元的分化与鉴定

摘要

我们描述了利用悬滴法将小鼠胚胎干细胞在体外分化为神经元细胞的实验步骤。此外，我们通过RT-qPCR、免疫荧光、RNA测序和流式细胞术进行了全面的表型分析。

摘要

我们描述了将小鼠胚胎干细胞培养并分化为神经细胞系的逐步操作流程，随后通过一系列检测方法对已分化的细胞进行表征。采用E14小鼠胚胎干细胞，通过悬滴法形成拟胚体，随后使用视黄酸诱导其分化为神经前体细胞，最终进一步分化为神经元。定量 逆转录 聚合酶链式反应（RT-qPCR）和免疫荧光实验结果显示，在分化后第8天和第12天，神经前体细胞和神经元分别表达相应的标志物（神经前体细胞标志物为nestin，神经元标志物为neurofilament）。对携带Sox1启动子驱动GFP报告基因的E14细胞系进行流式细胞术分析表明，分化第8天约有60%的细胞呈GFP阳性，提示此阶段神经前体细胞已成功分化。最后，通过RNA-seq分析对全转录组的动态变化进行了系统性表征。这些方法可用于研究特定基因和信号通路在神经分化过程中调控细胞命运转变的作用。

引言

自从小鼠囊胚发育阶段的内细胞团首次分离出小鼠胚胎干细胞（mESC）以来^1,2，mESC 已被广泛用作研究干细胞自我更新与分化能力的有力工具³。此外，研究 mESC 的分化过程有助于深入理解分子机制，从而提高基于干细胞治疗神经退行性疾病等疾病的疗效与安全性⁴。与动物模型相比，这种体外系统具有诸多优势，包括操作和评估简便、维持细胞系的成本远低于动物饲养，以及遗传操作相对容易。然而，分化细胞类型的效率和质量常常受到不同 mESC 细胞系以及分化方法的影响^5,6。此外，传统评估分化效率的方法依赖于对特定标志基因的定性检测，缺乏足够的稳健性，因而难以全面捕捉基因表达的整体变化。

本研究旨在利用一系列检测方法对神经元分化进行系统性评估。通过针对特定标志物的传统体外分析结合RNA测序（RNA-seq），我们建立了一个平台，用于测量分化效率以及该过程中转录组的动态变化。基于先前建立的方案⁷，我们采用悬滴法生成拟胚体（embryoid bodies, EBs），随后使用超生理浓度的视黄酸（retinoic acid, RA）诱导生成神经前体细胞（neural progenitor cells, NPCs），再通过神经诱导培养基将NPCs进一步分化为神经元。为评估分化效率，除传统的RT-qPCR和免疫荧光（immunofluorescence, IF）检测外，我们还进行了RNA-seq和流式细胞术分析。这些检测手段为阶段性特异性分化的进程提供了全面的评估。

方案

1. 小鼠胚胎干细胞培养

1. 用 0.1% 明胶包被一个 10 cm 的组织培养处理板，并让明胶静置至少 15–30 分钟，然后吸除。
2. 在将小鼠胚胎干细胞（mESCs）接种至预热的 mESC 培养基前一日，接种经 γ 射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。（mESC 培养基为含 15% 胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、丙酮酸钠、LIF、PD0325901（PD）和 Chir99021（CH）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM））。
3. 在培养 E14 细胞前，让经 γ 射线照射的 MEFs 沉降并贴附于培养板表面。
4. 在 37 °C 水浴中快速解冻 E14 ESCs，并迅速将细胞转移至含有温热 mESC 培养基的 15 cm 圆锥形离心管中。在 200 × g 条件下离心 3 分钟以收集细胞，弃去上清液。
5. 用 10 mL mESC 培养基重悬细胞，并将细胞接种至先前已接种 γ 射线照射 MEFs 的培养板中。将细胞培养物置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。
6. 传代培养时，吸除培养基，并用无菌 1× PBS 洗涤培养板。加入足量 0.05% 胰蛋白酶以覆盖培养板表面，在 37 °C 下孵育 3 分钟。
7. 用 mESC 培养基中和胰蛋白酶，并吹打形成单细胞悬液。在 200 × g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
8. 使用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞，并将约 5.0 × 10⁵ 个细胞接种至一个 10 cm 培养板中。
9. 用 10 mL mESC 培养基重悬细胞，将细胞接种至明胶包被的组织培养板上，并按前述条件进行培养。
   注意：建议每 2 天传代一次 mESCs，以防止细胞在克隆中发生分化。培养基中的酚红仅作为 pH 指示剂，根据细胞密度不同，可能在不到 2 天内变为黄色（更酸性），因此可能需要每天更换培养基。经 γ 射线照射的 MEFs 在经过数次传代后将逐渐死亡。

2. 胚状体、神经前体细胞及神经元分化

1. 执行前述的细胞传代培养方案，并对细胞进行计数（步骤 1.7–1.10）。
2. 悬滴法（第 0 天）
   1. 对于一个 10 cm 的细胞培养皿，准备约 2.5 × 10⁴ 个细胞，将其中 5.0 × 10² 个细胞悬浮于 20 µL 分化培养基中（DMEM 加 15% FBS、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素和丙酮酸钠）。一个 10 cm 培养皿上大约可接种五十个含细胞的 20 µL 液滴。
   2. 取适当数量的细胞，以 200 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。
   3. 用适量的分化培养基重悬细胞，使细胞密度为每 20 µL 含 5.0 × 10² 个细胞（例如，将 2.5 × 10⁴ 个细胞重悬于 1 mL 分化培养基中）。
   4. 使用微量移液器或重复移液器，将 20 µL 细胞悬液液滴加至组织培养皿的盖子上。确保液滴之间保持足够距离，以防止其融合。
      注意：由于液滴是加在盖子上而非培养皿底部，因此可使用经组织培养处理的贴壁培养皿或悬浮培养皿。为更方便且无菌地操作，建议先将液滴接种在贴壁型组织培养皿的盖子上，随后按以下方法转移至悬浮培养皿中。
   5. 在培养皿中加入 5–10 mL 的 1× PBS，然后小心地将盖子盖回培养皿上。将培养物置于 37 °C 培养箱中孵育。
      注意：在培养皿中加入 PBS 是为了防止液滴干燥。
3. 在第 2 天，使用微量移液器从盖子上收集液滴，并将其转移至含有 10 mL 分化培养基的 10 cm 细胞悬浮培养皿中。将培养物置于培养箱内的轨道摇床上，以低速振荡孵育。
4. 在第 4 天，为收获拟胚体（EBs），收集细胞，以 200 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。
   注意：根据后续实验的要求，EBs 也可用 1× PBS 洗涤。
5. 为继续实验并诱导拟胚体分化为神经前体细胞（NPCs），准备含有 5 µM 视黄酸（RA）的分化培养基。
6. 通过以 100 × g 离心 3 分钟使 EBs 沉淀，或让 EBs 自然沉降，吸除旧培养基。向培养皿中加入 10 mL 含 5 µM RA 的分化培养基。
7. 在第 6 天，通过倾斜培养皿并如上所述用移液器吸出部分培养基，更换至少一半的培养基为含 5 µM RA 的新鲜培养基。
   注意：建议在第 5 天和第 7 天也至少更换一半含 RA 的新鲜培养基。注意观察酚红指示剂颜色；若变为黄色，则最好更换全部培养基。
8. 在第 8 天，通过收集细胞、以 200 × g 离心 3 分钟并弃去上清液的方式收获神经前体细胞（NPCs）。
   注意：根据后续实验的需要，NPCs 也可用 1× PBS 洗涤。如需保存，NPCs 可冷冻保存并在后续实验中再次解冻使用。若需继续培养，可使用 accutase 替代胰蛋白酶进行消化。
9. 为继续实验并将 NPCs 分化为神经元，先通过离心将 NPCs 收集至 15 mL 圆锥形离心管中，用胰蛋白酶解离，并在 37 °C 孵育 3 分钟。用移液器吹打 NPCs，确保所有 NPC 聚集体均被充分解离，然后用培养基中和胰蛋白酶活性。
10. 使用 40 μm 尼龙细胞筛过滤细胞，在接种前进行细胞计数，并以 1.5 × 10⁵/cm² 的密度接种于 N2 培养基中（DMEM/F12 培养基 + 3 mg/mL 葡萄糖 + 3 mg/mL 富脂牛血清白蛋白（LBSA）+ 1:100 N2 补充剂 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL 青霉素/链霉素 + 1 mM L-谷氨酰胺），接种于经组织培养处理的培养皿中用于后续 PCR 和 Western blot 实验；或接种于组织培养板中用于免疫荧光实验。
11. 在第 9 天，用新鲜的 N2 培养基更换旧培养基。
12. 在第 10 天，将 N2 培养基更换为 N2/B27 培养基（50% DMEM/F12 和 50% 神经基础培养基，3 mg/mL LBA，1:200 N2 补充剂，1:100 B27 补充剂，50 U/mL 青霉素/链霉素，以及 1 mM L-谷氨酰胺）。
13. 在第 11–12 天，按以下步骤收获神经元：用 1× PBS 洗涤细胞，加入胰蛋白酶，在 37 °C 培养箱中孵育 3 分钟，随后用培养基中和胰蛋白酶，并以 200 × g 离心 3 分钟。

3. 小鼠胚胎干细胞及分化细胞的表征

1. 碱性磷酸酶（AP）检测
   1. 使用试剂盒评估碱性磷酸酶活性（参见材料表）。
   2. 从培养板中移除培养基，并用1×PBS洗涤胚胎干细胞（ESCs）。
   3. 向培养板中加入1 mL试剂盒提供的固定液（含甲醛和甲醇），室温孵育2–5分钟。
      注意：在固定液中孵育时间过长可能影响AP活性。
   4. 移除固定液，用1×PBS洗涤ESCs，并在培养板中保留少量PBS。
      注意：保持ESCs在PBS中湿润，以避免影响AP活性。
   5. 将A、B、C三种底物溶液按1:1:1比例混合配制AP反应液。先混合A和B溶液，室温孵育2分钟后，再加入C溶液。
   6. 移除1×PBS，加入先前配制的AP反应液。
   7. 用铝箔包裹培养板或在暗室中进行操作，避光孵育约15分钟。
   8. 监测反应进程，当溶液显色明显时及时移除反应液，以避免非特异性染色。
   9. 用1×PBS洗涤ESCs两次。
   10. 通过加入1×PBS或封片剂覆盖ESCs，防止样本干燥。
       注意：AP表达将呈现红色或紫色染色。培养板可储存于4 °C冰箱中。
2. RT-qPCR
   1. 分别按照步骤1.6–1.7和2.4收集ESCs、EBs和NPCs在不同阶段的细胞。
   2. 使用RNA、DNA和蛋白质提取液提取RNA（参见材料表）。
   3. 使用逆转录试剂盒（参见材料表）合成cDNA，并遵循制造商说明书操作。
3. 固定与包埋
   1. 按照前述方法（步骤2.6）收集EBs和NPCs，并用含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS溶液在室温下固定30分钟。
   2. 移除PFA溶液，用1×PBS洗涤样本5分钟。
   3. 将样本置于1×PBS及10%、20%、30%蔗糖溶液的梯度中，在25‒28 °C条件下孵育，每步30分钟后转移至下一溶液。
      注意：样本可在4 °C条件下储存于30%蔗糖溶液中，待后续包埋步骤使用。
   4. 用蔗糖溶液润湿移液枪头，将样本（避免堆叠）置于冷冻模具中央，并吸除多余液体。
      注意：也可使用滤纸去除多余溶液。用蔗糖溶液润湿枪头可防止EBs和NPCs粘附在枪头内壁。
   5. 小心加入最佳切割温度（OCT）包埋剂至模具中，避免重悬样本，并用移液枪去除气泡。
   6. 将模具置于低速实验室混合器上，轻柔振荡15分钟，有助于若在OCT中发生重悬的EBs和NPCs沉降至底部。
   7. 将模具置于液氮或干冰上快速冷冻样本。
      注意：样本可在-70 °C冰箱中储存，待后续步骤使用。
4. 冷冻切片
   1. 在将样本转移至仪器前，将冷冻切片机预冷至-20至-18 °C。
   2. 将冻结的OCT包埋块从模具中取出，用少量OCT包埋剂粘附于持样器表面并固定。 
   3. 调整OCT包埋块方向，使EBs和NPCs尽可能靠近刀片，以确保切片过程中不丢失样本。
   4. 小心切下10 μm厚度的切片，并密切注意含有样本的切片部分。
   5. 迅速将含有样本的OCT切片转移至组织包埋载玻片上，室温下空气干燥1小时。
      注意：样本可于-70 °C储存，以备后续使用。
5. 免疫荧光（IF）
   1. 在室温下，用含10%正常驴血清和0.1% Triton X-100的1×PBS溶液封闭OCT切片或含神经元的培养腔室，孵育1小时。
   2. 在含5%正常驴血清和0.05% Triton X-100的1×PBS溶液中，加入一抗稀释液，4 °C孵育过夜。
   3. 用含0.1% Triton X-100的1×PBS溶液洗涤样本三次，每次5分钟。
   4. 在含5%正常驴血清和0.05% Triton X-100的1×PBS溶液中，加入二抗稀释液，室温孵育1小时。
   5. 用含0.1% Triton X-100的1×PBS溶液洗涤样本三次，每次5分钟，随后在1 μg/mL DAPI中孵育。
   6. 用封片剂和盖玻片封片，并使其干燥。
   7. 在荧光显微镜下观察样本。
6. RNA-seq分析
   1. 在不同阶段收集细胞，并进行RNA提取（参见步骤3.2）。
   2. 根据Wang等⁸所述方案，构建cDNA文库，进行深度测序和数据分析。
   3. 使用R软件包clusterProfiler进行基因本体（GO）分析。
7. 流式细胞术
   1. 按照步骤1.6–1.7收集ESCs，并重悬于培养基中；按照步骤2.4收集EBs和NPCs，并重悬于培养基中。
   2. 使用40 μm尼龙细胞筛网将细胞悬液过滤至新的15 mL离心管中。
   3. 使用流式细胞仪检测样本的GFP信号（由机构核心设施完成）。

结果

作为本方法的示例，我们对E14细胞进行了拟胚体（EB）、神经前体细胞（NPC）和神经元分化的实验。E14细胞在γ射线照射的MEF细胞上培养（图1A），直至γ射线照射的MEF细胞群体被稀释殆尽。我们通过碱性磷酸酶（AP）染色（图1B）以及后续的RT-qPCR检测Nanog和Oct4标志物（见下文）来确认E14细胞的多能性。随后，将去除γ射线照射MEF后的E14细胞按照图2A所示方案诱导分化。简言之，将含有500个细胞的20 µL分化培养基液滴接种于培养皿盖内表面（详见方案第2节）。形成的拟胚体被收集后转移至新鲜分化培养基中悬浮培养。在分化第4天至第8天期间，向培养皿中加入5 μM的视黄酸（RA）以诱导生成神经前体细胞。分化的拟胚体呈圆形，且在分化过程中体积持续增大（图2B）。在第8天，收集NPC并用胰酶消化，将所得单细胞悬液接种于含N2添加剂的DMEM/F12培养基中...

讨论

小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的实验方法已建立数十年，研究人员持续对以往的实验方案进行改进，或为不同目的开发新的方案^7,10,11。我们采用一系列检测手段，全面分析小鼠胚胎干细胞向神经元分化各阶段的效率与进程，该方法也可用于分析小鼠或人胚胎干细胞向其他谱系的分化。此外，我们的方法已被证明是体外评估特定基因或信号通路对神经元分化影响的有效工具⁸。

通过我们的方法，经视黄酸（RA）处理的多能性未分化ESC可高效地定向分化为神经谱系，并进一步诱导生成神经元⁷。为了提高胚胎干细胞向神经细胞分化的成功率并降低异质性，保持胚胎干细胞处于未分化状态至关重要¹²。经γ射线照射或丝裂霉素C处理的非增殖性MEF可维持ESC的多能性，并为其生长提供支架支持

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶 + 0.53 mM EDTA 1X	康宁	25-052-CV
0.1% 明胶	Sigma	G1890-100G	在去离子水中制备
16% 多聚甲醛	Thermo Scientific	28908	在 1X PBS 中稀释
40-&μ;m 细胞过滤器	Falcon	352340
Albumax	Thermo Fisher Scientific	11020021
AlexaFluor 488 山羊抗小鼠 IgG （H+L）	Invitrogen	A11001	抗体以 1：500 稀释用于 IF
碱性磷酸酶染色试剂盒 II	Stemgent	00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR 混合物 LoRox	Azura Genomics	AZ-2105
B27 补充剂	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSCanto	BD	657338
bFGF	Sigma	11123149001
BioAnalyzer 高灵敏度 DNA 试剂盒	Agilent	5067-4626
Chir99021	Cayman Chemicals	13122
氯仿	C298-500	Fisher化学试剂
DAPI	、Invitrogen	R37606
DMEM	康宁	10-017-CM
DMEM/F12 培养基	Thermo Fisher Scientific	11320033
EB 缓冲液	、Qiagen	19086
乙醇	111000200	Pharmco	用去离子水稀释
胎牛血清	亚特兰大生物制剂	S10250
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
HiSeq 2500 测序系统	Illumina	SY-401-2501
异丙醇	BDH1133-4LG	BDH VWR 分析	在去离子水中
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030024
LIF	N/A	N/	A 收集自 MEF 上清液
m18srRNA 引物	IDTDNA	N/A	5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM
非必需氨基酸	康宁	25-025-Cl
mNanog 引物	IDTDNA	N/A	5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGT-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes 引物	IDTDNA	N/A	5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'mNeuroD1
引物	IDTDNA	N/A	5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4
引物	IDTDNA	N/A	5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6
引物	IDTDNA	N/A	5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2
补充剂	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin 一抗	Millipore	MAB5326	抗体以 1：200 稀释用于 IF
神经基础	Thermo Fisher Scientific
神经丝一抗	DSHB	2H3
NEXTflex Illumina 快速定向 RNA-Seq 文库制备试剂盒	BioO Scientific	PD0325901
	Cayman Chemicals	13034
青霉素/链霉素	康宁	30-002-Cl
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	N/A	N/A	在去离子水中制备
- 氯化钾	P217-500G	VWR
- 无水磷酸二钾	0781-500G	VWR
- 氯化钠	BP358-10	Fisher 生物试剂
- 磷酸氢钠，二氢钠，七水合	SX0715-1	Milipore
随机六聚体引物	Thermo Scientific	SO142
视黄酸	Sigma	R2625	在 DMSO
丙酮酸钠	康宁	25-000-Cl
蔗糖	Sigma	84097	在 1X PBS
SuperScript III 逆转录酶	Invitrogen	18064022
Tissue-Tek O.C.T. 化合物	Sakura	4583
中制备TriPure 分离试剂	Sigma-Aldrich	11667165001
TruSeq Rapid	Illumina	20020616
β-巯基乙醇	Fisher 生物试剂	BP176-100