通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

摘要

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。

摘要

哺乳动物细胞 constantly 暴露于化学物质、辐射以及自然产生的代谢副产物中，这些因素会造成特定类型的 DNA 损伤。基因毒性因子可损害 DNA 骨架、使其断裂，或修饰单个碱基的化学性质。在 DNA 受损后，DNA 损伤应答（DDR）通路被激活，参与修复的蛋白质被募集至损伤位点。多种因子参与识别损伤类型并激活相应的修复应答。若未能正确激活或募集 DDR 因子，则可能导致基因组不稳定，而基因组不稳定是包括癌症在内的多种人类疾病的病理基础。对 DDR 蛋白的研究有助于理解基因毒性药物的应答机制以及细胞产生药物耐药性的分子机制。

可视化主要有两种方法 蛋白质 体内：通过将目标蛋白与荧光蛋白融合并利用活细胞成像进行直接观察，或在固定样本上进行间接免疫荧光检测。虽然荧光标记蛋白的可视化可实现对蛋白动态的精确时序监测，但在N端或C端直接标记可能干扰蛋白的定位或功能。因此，优先选择对未经修饰的内源性蛋白进行观察。当DNA修复蛋白被招募至DNA损伤位点时，其局部浓度升高并形成可被特异性抗体通过间接免疫荧光检测到的聚集体，即“焦点”（foci）。

尽管蛋白焦点的检测并不能提供直接相互作用的确凿证据，但细胞内蛋白的共定位表明它们会聚集到损伤位点，从而揭示复合物形成所必需的事件顺序。对表达野生型或突变型蛋白的细胞中焦点空间重叠进行细致分析，可为参与DNA修复功能的关键功能结构域提供宝贵的线索。最后，蛋白的共定位提示可能存在直接相互作用，这些相互作用可通过细胞内的共免疫沉淀实验，或利用纯化蛋白进行的直接pull-down实验加以验证。

引言

人体细胞会持续暴露于各种来源的DNA损伤剂中。外源性因素主要包括辐射、化学物质（包括化疗药物和某些抗生素）以及病毒的暴露，而内源性因素则主要涉及DNA复制错误和氧化应激。基因毒性暴露的直接效应可能从碱基修饰到潜在的致死性DNA双链断裂（DSB）不等，具体取决于应激类型和暴露剂量。最终，未修复或错误修复的DNA损伤可导致突变积累、基因组重排、基因组不稳定，并最终引发癌变¹。哺乳动物细胞已进化出复杂的通路，能够识别特定类型的DNA损伤^2,3，并及时进行修复，且与细胞周期进程相协调。

电离辐射（IR）会损伤DNA双螺旋结构，导致双链断裂（DSBs），这是最具危害性的DNA损伤形式之一。MRN（MRE11、RAD50、NBS1）复合物作为DNA末端的感应器，可激活蛋白激酶共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ATM）^4,5。在DNA末端初步激活ATM后，ATM会在断裂位点触发一系列DNA损伤应答（DDR）事件，其中关键的起始事件是组蛋白变体H2AX的磷酸化⁶。H2AX在S139位点的磷酸化使其活化为γH2AX，其扩散范围可延伸至DNA损伤区域周围数兆碱基的区域

方案

1. HeLa 细胞培养

1. 将圆形玻璃盖玻片用 1 M HCl 在 50 °C 下预处理 16–18 小时，用 ddH₂O 冲洗后保存于 100% EtOH 中。
2. 配制细胞培养基：向 DMEM 培养基中加入 10% (v/v) 胎牛血清（FBS）。
3. 在无菌 12 孔板中，每孔加入一张 18 mm 圆形玻璃盖玻片，接种 4.0 × 10⁴ 个细胞/孔，在 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中培养，至细胞融合度达到 80%（约 24 小时）。

2. 细胞的辐射处理（IR）

1. 为诱导双链断裂的形成，将细胞暴露于4 Gy γ-射线照射下（对照组：不照射，t=0）。在Gamma Cell-40中，这相当于以每分钟0.815 Gy的剂量率照射4.54分钟。
2. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育适当时间（本实验选择的时间点为t=1、2、4、16 h）。

3. 细胞核提取与细胞固定

1. 配制储备液：0.2 M PIPES（pH 6.8）、5 M NaCl、2 M 蔗糖、1 M MgCl₂、0.1 M EGTA（pH 8.0）。
2. 配制核提取缓....

结果

在第2天，即细胞接种到盖玻片上24小时后，细胞已完成一次分裂，融合度达到80%。DNA修复蛋白的特异性敲低或突变可能延长细胞倍增时间，或增加细胞对基因毒性处理的敏感性，因此应相应调整接种密度和处理剂量。为确定最佳实验条件，可通过随时间检测γH2AX的Western印迹分析来确定DNA损伤反应的动力学，同时可通过克隆形成实验评估细胞对辐射的敏感性。

未经辐照处理的细胞几乎不出现γH2AX焦点，即使有也非常少（图3A）。然而，多种与培养条件相关的应激因素均可在培养细胞中诱导γH2AX焦点的形成：例如细胞在酸化培养基中长时间达到汇合状态、胎牛血清（FBS）中存在基因毒性内毒素、培养时所用的氧气浓度等。

讨论

通过显微镜分析DNA损伤修复的时间和效率，对于理解DNA修复机制在正常细胞以及癌症等人类病理状态下的功能至关重要。

特异性抗体的开发在深入理解DNA修复事件的时间进程及其与细胞周期的协调方面发挥了核心作用，这些抗体可用于检测蛋白质磷酸化形式的激活状态（例如γH2AX、pRPA、pRAD50等^10,23,39,43）。这一成功的典型例子是对53BP1蛋白磷酸化位点的分析，通过质谱和免疫定位技术实现（详见文献³²综述），这有助于阐明这一高度修饰蛋白的功能。随着STORM等高分辨率显微技术的发展以及小型抗体（纳米抗体）的广泛应用，对细胞内蛋白质直接相互作用的研究正变得越来越可行且精确。然而，如本文所述的间接免疫荧光实验，在研究一种新的潜在DNA修复蛋白并探索其作用时间及相互作用蛋白伙伴时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% (v/v) 甲醛（PFA）水溶液	Electron Microscopy Sciences	15710	PFA 的显微镜级质量可确保最佳成像效果。若使用"自制 PFA"，使用前需过滤。
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A3059	建议使用热激处理的组分，以避免沉淀或背景干扰。
盖玻片 #1，18 mm 圆形（盖玻片）	Neuvitro	NC0308920	盖玻片使用前需用 HCl 或乙醇清洗并灭菌。
DMEM 高糖培养基 [(+) 4.5 g/L D-葡萄糖，(+) L-谷氨酰胺，(-) 丙酮酸钠]	Gibco	11965118	根据所用细胞系的需求调整培养基。
不含钙、不含镁的 DPBS	Gibco	14190144	用于组织培养的 PBS。
乙二醇双（β-氨基乙基醚）-N,N,N′,N′-四乙酸（EGTA）	Research Products International	E57060	核提取缓冲液组分。
胎牛血清（FBS）	Life Technologies	104370028	FBS 质量可通过检测 γH2AX 焦点形成来评估。若批次中含有基因毒性内毒素残留，则在无应激条件下 γH2AX 也会呈阳性。
氯化镁（MgCl2）	Research Products International	M24000	核提取缓冲液组分。
哌嗪-N,N′-双（2-乙磺酸）（PIPES）	Research Products International	P40150	核提取缓冲液组分。
含 DAPI 的 SlowFade Diamond 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	S36973	可使用含 300 nM DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂替代。
氯化钠（NaCl）	Research Products International	S23020	核提取缓冲液组分。
蔗糖	Research Products International	S24060	核提取缓冲液组分。
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	1255015	可用 Polysine 载玻片替代。
TC 处理的多孔板，12 孔规格	Costar	3513	盖玻片接种在 12 孔板中进行。
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	核提取缓冲液组分。
TrypLE Express 酶（1X），无酚红	Gibco	12604021	可用胰蛋白酶-EDTA 替代。
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红	Gibco	15400054	可用 TrypLE 替代。