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方法文章

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

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DOI：

10.3791/61447

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2020年6月26日

 , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

本文内容

摘要

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。

摘要

哺乳动物细胞 constantly 暴露于化学物质、辐射以及自然产生的代谢副产物中，这些因素会造成特定类型的 DNA 损伤。基因毒性因子可损害 DNA 骨架、使其断裂，或修饰单个碱基的化学性质。在 DNA 受损后，DNA 损伤应答（DDR）通路被激活，参与修复的蛋白质被募集至损伤位点。多种因子参与识别损伤类型并激活相应的修复应答。若未能正确激活或募集 DDR 因子，则可能导致基因组不稳定，而基因组不稳定是包括癌症在内的多种人类疾病的病理基础。对 DDR 蛋白的研究有助于理解基因毒性药物的应答机制以及细胞产生药物耐药性的分子机制。

可视化主要有两种方法 蛋白质 体内：通过将目标蛋白与荧光蛋白融合并利用活细胞成像进行直接观察，或在固定样本上进行间接免疫荧光检测。虽然荧光标记蛋白的可视化可实现对蛋白动态的精确时序监测，但在N端或C端直接标记可能干扰蛋白的定位或功能。因此，优先选择对未经修饰的内源性蛋白进行观察。当DNA修复蛋白被招募至DNA损伤位点时，其局部浓度升高并形成可被特异性抗体通过间接免疫荧光检测到的聚集体，即“焦点”（foci）。

尽管蛋白焦点的检测并不能提供直接相互作用的确凿证据，但细胞内蛋白的共定位表明它们会聚集到损伤位点，从而揭示复合物形成所必需的事件顺序。对表达野生型或突变型蛋白的细胞中焦点空间重叠进行细致分析，可为参与DNA修复功能的关键功能结构域提供宝贵的线索。最后，蛋白的共定位提示可能存在直接相互作用，这些相互作用可通过细胞内的共免疫沉淀实验，或利用纯化蛋白进行的直接pull-down实验加以验证。

引言

人体细胞会持续暴露于各种来源的DNA损伤剂中。外源性因素主要包括辐射、化学物质（包括化疗药物和某些抗生素）以及病毒的暴露，而内源性因素则主要涉及DNA复制错误和氧化应激。基因毒性暴露的直接效应可能从碱基修饰到潜在的致死性DNA双链断裂（DSB）不等，具体取决于应激类型和暴露剂量。最终，未修复或错误修复的DNA损伤可导致突变积累、基因组重排、基因组不稳定，并最终引发癌变1。哺乳动物细胞已进化出复杂的通路，能够识别特定类型的DNA损伤2,3，并及时进行修复，且与细胞周期进程相协调。

电离辐射（IR）会损伤DNA双螺旋结构，导致双链断裂（DSBs），这是最具危害性的DNA损伤形式之一。MRN（MRE11、RAD50、NBS1）复合物作为DNA末端的感应器，可激活蛋白激酶共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ATM）4,5。在DNA末端初步激活ATM后，ATM会在断裂位点触发一系列DNA损伤应答（DDR）事件，其中关键的起始事件是组蛋白变体H2AX的磷酸化6。H2AX在S139位点的磷酸化使其活化为γH2AX，其扩散范围可延伸至DNA损伤区域周围数兆碱基的区域6,7,8,9。该事件增强了DNA的可及性，从而促进其他DNA修复蛋白的招募与聚集7。由于γH2AX在DSB周围被大量且特异性地诱导产生，因此可通过特异性抗体轻松可视化，被广泛用作DNA修复领域中DSB的替代标志物。当断裂信号被传递后，细胞会启动其DNA修复通路并处理DNA损伤。蛋白MDC1（DNA损伤检查点蛋白1的中介因子）可直接结合γH2AX10，并与ATM11以及NBS112,13相互作用。它有助于提高MRN复合物在DSB位点的浓度，并启动ATM的正反馈循环。一旦断裂被修复，γH2AX会迅速被清除，因此可用于监测DSB的消除情况。通过显微镜观察，随时间推移γH2AX信号的减少可间接反映残留断裂的数量及DNA修复效率。

真核细胞可通过多种途径修复DNA双链断裂（DSB），其中最主要的两种途径是非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）（图1）。NHEJ主要通过直接连接DNA双链末端进行修复，无需依赖长片段的同源序列，且在细胞周期的各个阶段均可发挥作用14,15。HR则主要在S期和G2期占主导地位，其他时期受到抑制，因其修复过程需要姐妹染色单体作为同源模板14,16。NHEJ与HR之间的通路选择不仅取决于姐妹染色单体在空间上的接近程度，还取决于DNA末端切除的程度17，而后者会抑制NHEJ的发生。

同源依赖性双链断裂修复通过从断裂末端对5’链进行核酸酶降解，产生3’单链DNA（ssDNA）尾部，该过程称为5’-3’末端切除。MRN复合物启动DNA末端切除，随后在BLM/EXO1（Bloom综合征蛋白/外切酶1）或BLM/DNA2（DNA复制ATP依赖性解旋酶/核酸酶）的协同作用下完成进一步的切除。18,19,20,21,22DNA末端切除通过CtIP（CtBP相互作用蛋白）与MRN复合物的直接相互作用而增强23 以及BRCA1（乳腺癌易感蛋白1）的招募24,25复制蛋白A（RPA）迅速结合暴露的单链DNA，随后被重组酶蛋白RAD51取代，形成催化同源搜索和链侵入的核蛋白丝。26,27,28.

DNA末端切除的启动是修复通路选择的关键步骤。一旦切除过程启动，DNA末端将难以被Ku70/Ku80异源二聚体（非同源末端连接通路的组分）结合，细胞便趋向于同源重组修复17,29,30。Ku70/Ku80异源二聚体可结合于DNA双链断裂（DSB）末端，并招募DNA-PKcs和p53结合蛋白1（53BP1）29,30。53BP1在G1期发挥阻碍切除的作用，从而抑制同源重组修复并促进非同源末端连接31,32；但在S期，53BP1以BRCA1依赖的方式被移除，从而允许切除过程发生33,34。因此，53BP1与BRCA1在DNA双链断裂修复中发挥相反的作用：53BP1促进非同源末端连接，而BRCA1则促进DNA断裂通过同源重组方式进行修复。

在实验室中，DNA双链断裂（DSB）的形成可通过电离辐射（IR）诱导。尽管本示例使用了4 Gy的高剂量，但1 Gy和2 Gy同样可产生大量DSB，适用于对丰度较高的蛋白的焦点形成进行分析。需要注意的是，所使用的辐射类型和剂量可能导致DNA和细胞内产生不同类型的损伤：虽然电离辐射可诱导DSB，但也可能引起单链断裂或碱基修饰（参见35,36有关辐射线性能量传递（LET）与DNA损伤类型的参考文献）。为了确定电离辐射诱导焦点（IRIF）形成的动力学及其清除过程——这反映了损伤修复及DNA损伤应答（DDR）激活状态的逆转8,9,37,38，可在电离辐射后的不同时间点监测焦点的形成。目前已知所有主要DNA损伤相关蛋白的激活与清除时间进程39，其中许多被用作关键事件的替代标志物。例如，磷酸化的RPA（pRPA）对单链DNA（ssDNA）具有高亲和力，可作为断裂末端切除的替代指标；MRN复合物蛋白（MRE11、RAD50、NBS1）以及外切核酸酶也可用于评估切除效率。而RAD51、BRCA1、BRCA2（乳腺癌易感蛋白2）和PALB2（BRCA2的结合因子与定位蛋白）的表达情况可用于评估同源重组（HR）修复效率；Ku蛋白或53BP1的存在则被用作非同源末端连接（NHEJ）的标志物（图1）。

随着DNA修复机器中的蛋白质相互招募至断裂位点并组装成超复合物，可通过追踪各蛋白质随时间变化的定位情况并分析其共定位（通过细胞中信号重叠可视化呈现）来推断DNA-蛋白质及蛋白质-蛋白质之间的相互作用40,41,42。在细胞系中，通过基因组编辑或质粒表达突变体的方式引入特定DNA修复基因的点突变或缺失，可研究特定残基及其在识别DNA损伤（例如与γH2AX共定位）或复合物组装（与其他一个或多个蛋白质共定位）中的潜在作用，以及其对DNA修复的影响。本文采用间接免疫荧光法，通过随时间追踪γH2AX焦点的形成与消退，来研究DNA双链断裂（DSB）的产生与修复过程。我们还展示了DSB修复关键蛋白p53结合蛋白1（53BP1）32在焦点形成和共定位分析中的一个实例。如前所述，53BP1被认为是决定DNA修复通路选择的核心因子。追踪53BP1的富集及其与γH2AX的共定位，可提供有关细胞周期阶段、DNA损伤累积情况以及所使用DSB修复通路的重要信息。间接免疫定位的目的在于评估细胞系中DNA损伤修复的效率，例如本研究中经电离辐射（IR）处理后，或在细胞暴露于多种应激因素（从DNA交联到复制叉阻断）之后的修复能力（DNA损伤剂列表见Table 1）。

显示同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）过程的DNA修复示意图；包括末端切除、连接、重组等步骤。
图1：DNA双链断裂（DSB）修复通路。
DSB修复主要包括两条通路：同源重组（HR，左侧）和非同源末端连接（NHEJ，右侧）。在发生断裂后，多种蛋白被激活，用于标记断裂位点（γH2AX）、参与末端切除（MRN）、包被被切除后的单链DNA（pRPA）、促进重组（BRCA1、PALB2、BRCA2、RAD51），或限制切除并促进NHEJ（53BP1）。其他蛋白也参与损伤修复，但上述蛋白通常可通过间接免疫荧光法进行检测。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA损伤剂作用机制推荐剂量
γ射线/X射线辐射
导致双链断裂，并伴随一些不可控的细胞效应		1-4 Gy
36Ar离子辐射
导致双链断裂		270 keV/μm
α粒子辐射
导致双链断裂		116 keV/μm
博来霉素DNA合成抑制剂0.4-2 μg/mL
喜树碱拓扑异构酶I抑制剂10-200 nM
顺铂烷化剂
（诱导链内交联）		0.25-2 μM
多柔比星嵌入剂
拓扑异构酶II抑制剂		10-200 nM
依托泊苷拓扑异构酶II抑制剂10 μM
羟基脲DNA合成抑制剂
（通过核糖核苷酸还原酶）		10-200 μM
甲基磺酸甲酯烷化剂0.25-2 mM
丝裂霉素C烷化剂0.25-2 μM
紫外线（UV）胸腺嘧啶二聚体形成
（引起DNA链结构扭曲）		50-100 mJ/cm2

表1：遗传毒性试剂。DNA损伤试剂的示例、其作用机制以及根据推荐工作浓度所诱导的损伤类型。

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方案

1. HeLa 细胞培养

  1. 将圆形玻璃盖玻片用 1 M HCl 在 50 °C 下预处理 16–18 小时，用 ddH2O 冲洗后保存于 100% EtOH 中。
  2. 配制细胞培养基：向 DMEM 培养基中加入 10% (v/v) 胎牛血清（FBS）。
  3. 在无菌 12 孔板中，每孔加入一张 18 mm 圆形玻璃盖玻片，接种 4.0 × 104 个细胞/孔，在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养，至细胞融合度达到 80%（约 24 小时）。

2. 细胞的辐射处理（IR）

  1. 为诱导双链断裂的形成，将细胞暴露于4 Gy γ-射线照射下（对照组：不照射，t=0）。在Gamma Cell-40中，这相当于以每分钟0.815 Gy的剂量率照射4.54分钟。
  2. 将细胞置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育适当时间（本实验选择的时间点为t=1、2、4、16 h）。

3. 细胞核提取与细胞固定

  1. 配制储备液：0.2 M PIPES（pH 6.8）、5 M NaCl、2 M 蔗糖、1 M MgCl2、0.1 M EGTA（pH 8.0）。
  2. 配制核提取缓冲液（NEB）：将10 mM PIPES（pH 6.8）、100 mM NaCl、300 mM 蔗糖、3 mM MgCl2、1 mM EGTA（pH 8.0）和0.5%（v/v）Triton X-100 溶于ddH2O中，搅拌至完全溶解。
  3. 配制4%（v/v）多聚甲醛（PFA）：将10 mL 16% PFA水溶液加入30 mL PBS中，混匀至完全溶解。
  4. 在适当时间点（t=0、1、2、4、16 h），用1 mL PBS洗涤细胞两次，彻底去除PBS。
  5. 每孔加入200 μL NEB，用于细胞核提取（细胞质被降解，仅保留细胞核）（图2）。室温孵育2分钟，然后彻底去除缓冲液。
    注意：孵育时间不得超过2分钟。

细胞形态学比较：细胞核提取的影响，显微镜图像，细胞结构分析。
图2：细胞核提取。
细胞在核提取前（左）和提取后（右）的代表性图像。细胞质应被消化，但细胞核结构在提取后应保持完整（右）。(A) 20倍放大；比例尺 = 20 μm；(B) 40倍放大；比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看该图的高清版本。

  1. 用 1 mL PBS 洗涤细胞，彻底去除 PBS。添加 PBS 时需小心，此步骤中细胞非常脆弱。
  2. 每孔加入 200 μL 4% (v/v) PFA 进行细胞固定，在 4 °C 下孵育 10 分钟，然后彻底去除 PFA。
  3. 每孔加入 1 mL PBS。
    注意：细胞可在 4 °C 下保存于 PBS 中。

4. 免疫荧光染色

  1. 配制封闭液：将5% BSA（w/v）溶于PBS中，并加入0.3%（v/v）Triton X-100，混匀至完全溶解。
  2. 配制稀释缓冲液：将1% BSA（w/v）溶于PBS中，并加入0.3%（v/v）Triton X-100，混匀至完全溶解。
  3. 进行封闭时，每孔加入200 μL封闭液，在室温下孵育2小时，或在4 °C下孵育16–18小时。
    注意：若使用山羊来源的抗体，需在封闭液中添加5%山羊血清。
  4. 用稀释缓冲液稀释一抗（1:500；抗体列表见表2），涡旋振荡至充分混匀。
    注意：若使用山羊来源的抗体，需在稀释缓冲液中添加1%山羊血清。
  5. 在湿盒/孵育盒内放置一片Parafilm膜，滴加10 μL一抗溶液（单滴）。将盖玻片的一边对准液滴，缓慢放下使其贴附于Parafilm上，使液体均匀铺展（尽量避免产生气泡）。在室温下孵育2小时。
  6. 用PBS洗涤盖玻片，每次1分钟，共洗涤3次。
  7. 用稀释缓冲液稀释二抗（终浓度：2 μg/mL），涡旋振荡至充分混匀。
  8. 按照一抗的操作方法加入10 μL二抗溶液，在室温下孵育2小时。
    注意：避光操作。
抗体公司货号来源
53BP1Cell Signaling4937兔
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150103驴
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139), clone JBW301Millipore05-636小鼠
Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150081山羊

表2：所用抗体。本研究中所用抗体的列表。

  1. 用 PBS 清洗盖玻片三次，每次 1 分钟。
  2. 用 H2O 清洗盖玻片 1 分钟。
  3. 用 DAPI 对 DNA 进行复染：加入 10 μL 浓度为 300 nM 的 DAPI（方法同抗体操作），室温孵育 30 分钟，然后用含甘油的封片剂将盖玻片封固在载玻片上。或者，在载玻片上加入一滴（10 μL）含有 DAPI 的商用抗荧光淬灭封片剂，再盖上盖玻片。轻轻按压盖玻片，并用纸巾吸去周围多余的液体。
  4. 用透明指甲油密封盖玻片，室温静置 20 分钟使其干燥。
  5. 将载玻片置于 4 °C 保存。

5. 图像采集

  1. 在60倍物镜上滴加一滴浸油。使用DAPI通过目镜定位细胞核。
    1. 进行XYZ图像采集时，打开采集软件并选择参数：扫描类型：Galvano；扫描模式：往返扫描；图像大小：512×512；PMT模式：VBF；PMT平均：帧（4次）；PMT顺序扫描：逐线扫描。
    2. 选择染料和检测器：
      通道（CH1），染料（DAPI），检测器（SD1）
      通道（CH2），染料（Alexa Fluor 488），检测器（HSD3）
      通道（CH3），染料（Alexa Fluor 647），检测器（HSD4）
    3. 在“Z”选项中选择ON。
  2. 调节实时图像。点击Live窗口中的Live按钮。
    1. 调节焦距，并在“PMT”工具窗口中设置激光强度（%）、灵敏度（HV）、增益和偏移量。
      1. 调节激光强度（%）：用于控制亮度和光漂白。激光强度越高，信号越强，但样品会发生光漂白。
      2. 调节灵敏度（HV）：控制噪声水平。HV值越高，信号越强，但若过高则图像将出现噪声。
        注意：始终维持电压恒定。
      3. 调节偏移量：控制背景水平。
    2. 选择Start/End（15层切片），用于Z轴层扫成像。
  3. 开始图像采集。
    1. 选择保存图像的文件夹。点击LSM Start按钮开始采集图像。点击Series Done按钮完成图像采集。

6. 数据分析

  1. 进行图像分析时，打开分析软件。
    1. 点击Batch工具窗口，选择待分析的图像并指定输出文件夹。
    2. 点击Analysis工具窗口，选择投影模式（将显示15个切片中的最大强度投影）。
    3. 在Input/Output setting中，选择已创建的批处理任务。
    4. 点击Process开始处理图像。
    5. 将图像导出为.tiff文件。
  2. 进行核焦点定量分析时，打开CellProfiler软件。
    1. 打开γH2AX和53BP1焦点定量分析流程（参见补充信息）。
    2. 使用表格软件对数据进行作图分析。
  3. 进行共定位分析时，打开CellProfiler软件。
    1. 打开共定位分析流程（参见Supplemental information）。系统将生成一个电子表格文件并保存至指定位置。但分析结果图不会自动保存，建议对结果窗口进行截图以保留结果记录。
    2. 使用表格软件对数据进行作图分析。

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结果

在第2天，即细胞接种到盖玻片上24小时后，细胞已完成一次分裂，融合度达到80%。DNA修复蛋白的特异性敲低或突变可能延长细胞倍增时间，或增加细胞对基因毒性处理的敏感性，因此应相应调整接种密度和处理剂量。为确定最佳实验条件，可通过随时间检测γH2AX的Western印迹分析来确定DNA损伤反应的动力学，同时可通过克隆形成实验评估细胞对辐射的敏感性。

未经辐照处理的细胞几乎不出现γH2AX焦点，即使有也非常少（图3A）。然而，多种与培养条件相关的应激因素均可在培养细胞中诱导γH2AX焦点的形成：例如细胞在酸化培养基中长时间达到汇合状态、胎牛血清（FBS）中存在基因毒性内毒素、培养时所用的氧气浓度等。

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讨论

通过显微镜分析DNA损伤修复的时间和效率，对于理解DNA修复机制在正常细胞以及癌症等人类病理状态下的功能至关重要。

特异性抗体的开发在深入理解DNA修复事件的时间进程及其与细胞周期的协调方面发挥了核心作用，这些抗体可用于检测蛋白质磷酸化形式的激活状态（例如γH2AX、pRPA、pRAD50等10,23,39,43）。这一成功的典型例子是对53BP1蛋白磷酸化位点的分析，通过质谱和免疫定位技术实现（详见文献32综述），这有助于阐明这一高度修饰蛋白的功能。随着STORM等高分辨率显微技术的发展以及小型抗体（纳米抗体）的广泛应用，对细胞内蛋白质直接相互作用的研究正变得越来越可行且精确。然而，如本文所述的间接免疫荧光实验，在研究一种新的潜在DNA修复蛋白并探索其作用时间及相互作用蛋白伙伴时...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由圣安东尼奥地区基金会的资助项目支持。梅斯癌症中心由美国国家癌症研究所（NCI）癌症中心支持核心资助项目 P30 CA054174 支持。我们感谢 Stephen Holloway 在试剂采购方面的帮助，以及感谢 Sung 实验室提供实验空间和显微镜使用条件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% (v/v) 甲醛（PFA）水溶液Electron Microscopy Sciences15710PFA 的显微镜级质量可确保最佳成像效果。若使用"自制 PFA"，使用前需过滤。
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA3059建议使用热激处理的组分，以避免沉淀或背景干扰。
盖玻片 #1，18 mm 圆形（盖玻片）NeuvitroNC0308920盖玻片使用前需用 HCl 或乙醇清洗并灭菌。
DMEM 高糖培养基 [(+) 4.5 g/L D-葡萄糖，(+) L-谷氨酰胺，(-) 丙酮酸钠]Gibco11965118根据所用细胞系的需求调整培养基。
不含钙、不含镁的 DPBSGibco14190144用于组织培养的 PBS。
乙二醇双（β-氨基乙基醚）-N,N,N′,N′-四乙酸（EGTA）Research Products InternationalE57060核提取缓冲液组分。
胎牛血清（FBS）Life Technologies104370028FBS 质量可通过检测 γH2AX 焦点形成来评估。若批次中含有基因毒性内毒素残留，则在无应激条件下 γH2AX 也会呈阳性。
氯化镁（MgCl2）Research Products InternationalM24000核提取缓冲液组分。
哌嗪-N,N′-双（2-乙磺酸）（PIPES）Research Products InternationalP40150核提取缓冲液组分。
含 DAPI 的 SlowFade Diamond 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenS36973可使用含 300 nM DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂替代。
氯化钠（NaCl）Research Products InternationalS23020核提取缓冲液组分。
蔗糖Research Products InternationalS24060核提取缓冲液组分。
Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisherbrand1255015可用 Polysine 载玻片替代。
TC 处理的多孔板，12 孔规格Costar3513盖玻片接种在 12 孔板中进行。
Triton X-100AmericanBioAB02025核提取缓冲液组分。
TrypLE Express 酶（1X），无酚红Gibco12604021可用胰蛋白酶-EDTA 替代。
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红Gibco15400054可用 TrypLE 替代。

参考文献

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