本方案描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于在健康和疾病状态下对神经-胶质-血管结构、相互作用及功能进行纵向成像。该技术可作为经颅成像方法的补充替代方案，后者虽然常被优先选用，但存在一些关键性局限。
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本文内容
摘要
摘要
中枢神经系统（CNS）的功能受到神经元、胶质细胞、基质细胞和血管细胞之间复杂相互作用的调控，这些细胞共同维持其正常功能。尽管在体外分离培养或在离体条件下共同研究这些细胞可提供有价值的生理信息，但在这些环境中仍会遗漏神经细胞生理学的一些关键特征。因此，有必要在神经细胞所处的天然体内环境中对其进行研究。本文详细描述了一种用于在啮齿类动物大脑皮层中对神经细胞进行重复性活体双光子成像的实验方案，该技术可用于在数小时至数月的时间范围内对特定细胞进行可视化和动态观察。我们详细阐述了如何利用整体上稳定的脑血管系统作为粗略定位图谱，或利用荧光标记的树突作为精细图谱，来标记特定脑区。通过这些图谱作为视觉参照，我们展示了如何精确定位同一神经细胞，以实现后续多次重复的活体成像。通过荧光标记的小胶质细胞、神经元以及NG2+细胞的活体成像实例，本方案证明了该技术能够在长时间跨度内对同一脑区的细胞动态进行重复观察，从而有助于深入理解这些细胞在正常生理状态或病理损伤后的结构与功能反应。在必要时，该方法还可与神经细胞的功能性成像相结合，例如钙成像技术。当存在带有不同荧光标签的转基因小鼠模型或特异性染料可用于标记目标细胞时，该方法尤其适用于在活体条件下可视化观察中枢神经系统中不同类型细胞之间的物理相互作用。
引言
中枢神经系统（CNS）受到多种常驻细胞类型之间复杂相互作用的调控，这些细胞包括神经元、胶质细胞以及血管相关细胞。传统上，神经细胞的研究主要在分离培养、共培养1,2,3,4,5（体外）或离体脑组织（离体）6,7,8,9,10 的条件下进行。然而，仍需进一步理解神经细胞在完整活体大脑原生环境中的行为及其相互作用。在本实验方案中，我们描述了一种方法，用于在活体条件下定位感兴趣区域，并在后续成像过程中精确定位并重新成像这些区域，从而在较长时间内追踪各种中枢神经系统细胞类型之间的复杂相互作用。
活体成像技术的发展极大地促进了人们对神经功能的深入理解11,
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方案
所有步骤均符合弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会制定并批准的指南。
1. 颅窗植入术的小鼠准备
注意：多种带有荧光标签的转基因小鼠品系均适用于成像。
- 使用 CX3CR1GFP/+ 小鼠26 在活体中观察小胶质细胞。通常使用体重为 17–25 g 的幼年至年轻成年小鼠，年龄为 4 至 10 周。
注意：尽管该方法也适用于断奶前小鼠，但由于需要将小鼠放回笼中由母鼠喂养，若母鼠在术后未能妥善照顾幼崽，则可能使恢复过程复杂化。因此，建议使用已断奶的小鼠。 - 在麻醉室中使用异氟烷（5% 流速的氧气中诱导麻醉 1 分钟）对小鼠进行麻醉。通过捏压脚趾和/或尾巴检查小鼠是否不再出现任何运动或抽搐反应。将小鼠从麻醉室中取出，在开放空气中使用毛发修剪器彻底剃除两耳之间从眼睛水平至颈部顶端区域的头部毛发。
注意：所用异氟烷的浓度取决于诱导室的大小。因此，对于较小的诱导室，可使用 3–4% 的异氟烷有效诱导麻醉，而较大的诱导室则需要高达 5% 的浓度。 - 将小鼠转移至立体定位手术站的鼻罩进行麻醉维持（手术期间维持浓度为 1.5–2%），使用耳杆固定其头部，并将小鼠置于加热垫上以保持体温。
- 用眼膏润滑双眼。在切口部位皮下注射 100 µL 0.25% 布比卡因（为小鼠提....
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结果
为了在活体中观察小胶质细胞的动态变化，采用了双转基因 CX3CR1GFP/+:Thy1YFP 小鼠。使用 Thy1-YFP H 系而非 Thy1-GFP M 系，是为了避免小胶质细胞（GFP）与神经元（YFP）之间的荧光重叠。替代方案可采用以 tdTomato 等荧光蛋白标记小胶质细胞的报告基因小鼠品系，此时则可使用 Thy1-GFP M 系。H 系的一个缺点是 YFP 会标记大量神经元，且随着年龄增长标记信号增强（个人观察）。M 系则仅稀疏地标记部分神经元。在颅窗植入手术后 2 至 4 周内，可通过重复成像追踪小胶质细胞的动态变化。利用大血管定位特定脑区，再结合 YFP 标记的树突进行脑区的精细定位。通过该方法，可将特定树突作为稳定的解剖标志物，用于脑区的精细映射（图 1，图 1b 中的箭头所示）。尽管树突结构稳定，但部分小胶质细胞每日均会发生移动（图 1c）。
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讨论
活体双光子成像技术的出现为探索健康大脑中大量存在的细胞相互作用和动态过程提供了新的机遇。早期的研究主要采用开颅骨窗方法，通过急性或慢性成像来观察神经元树突37,38。该方法也可用于阐明大脑中的神经免疫相互作用。本实验方案描述了一种可靠的方法，可用于在短期或长期内对荧光标记的细胞（尤其是小胶质细胞，即大脑中的常驻免疫细胞）进行长时间成像。文中详细介绍了使用染料标记的血管和/或荧光标记的树突，以实现对目标脑区的粗略或精细定位，从而支持对细胞进行重复且可靠的成像。尽管本文推荐使用Thy1YFP小鼠品系进行精细脑区定位，但也可采用其他技术或小鼠品系来标记特定的神经元群体，例如胚胎内电穿孔39,40、出生后早期腺相关病毒（AAV）注射41，或使用TRAP小鼠42。此外，尽管本文讨论的重点是皮层成像，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Eyo实验室成员对本文所述观点的讨论。感谢弗吉尼亚大学Kipnis实验室的Justin Rustenhoven博士惠赠NG2DsRed小鼠33。本研究由美国国立卫生研究院下属国家神经疾病与卒中研究所资助，项目编号为U.B.E（K22 NS104392）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盖玻片（3 mm） | Warner Instruments | 64-0726 | |
| 氰基丙烯酸酯胶水（Krazy Glue） | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED 固化灯系统 | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| 牙科钻机 | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| 钻头 | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| 眼药膏 | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch（底漆胶） | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| 罗丹明 B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow 胶水（终层胶） | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
参考文献
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenera....
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