本文介绍了一种用于标记哺乳动物细胞膜蛋白并对样品进行石墨烯包覆以进行液相扫描透射电子显微镜观察的实验方案。该方案还可用于研究样品对辐射损伤的稳定性。
本文内容
摘要
摘要
本文描述了一种利用扫描透射电子显微镜（STEM）在完整乳腺癌细胞质膜中研究人表皮生长因子受体2（HER2）的实验方案。将哺乳动物乳腺癌细胞系SKBR3的细胞培养在带有氮化硅（SiN）窗口的硅微芯片上。细胞经化学固定后，采用两步生物素-链霉亲和素结合法，用量子点纳米颗粒（QDs）对HER2蛋白进行标记。随后在细胞表面覆盖多层石墨烯，以维持其水合状态，并在STEM成像过程中保护样本免受电子束损伤。为评估样本在电子束辐照下的稳定性，进行了剂量梯度实验，比较了有无石墨烯包覆的样本。结果显示，随着电子剂量D的增加，部分未包覆石墨烯的样本中出现了明亮的伪影，即电子束诱导损伤，而在包覆石墨烯的样本中则未观察到此类伪影。
引言
膜蛋白功能的分析对于细胞生物学研究和药物开发至关重要。一类重要的实验涉及检测膜蛋白在细胞内的位置。这些信息可用于推断蛋白质在蛋白复合物中的组装方式及其在质膜上的特定定位，而通过动态的组装与解离过程，这些定位可驱动多种多样的细胞功能。除其他技术外，光学显微镜（LM）和电子显微镜（EM）被用于研究细胞中蛋白质的功能。LM 可在液体环境中对完整细胞进行分析；然而，在实际条件下，常规显微镜的分辨率受限于 200–300 nm，而超分辨率荧光显微镜的分辨率最高可达 20 nm1,2。EM 的分辨率可达约 1 Å3，但传统的样品制备需要脱水、金属染色以增强图像对比度，并在透射电子显微镜（TEM）中使用树脂等包埋介质进行包埋4。为了在更接近天然的状态下保存生物样品，可采用冷冻电镜技术（cryo-EM）5,6。样品被迅速冷冻形成非晶态冰，必要时进行切片。另一种选择是冷冻断裂电子显微镜技术（freeze-fracturing EM）7。
过去十年中，出现了用于在天然液态环境中研究完整细胞内膜蛋白的电子显微镜技术8,9,10,11。在生长于氮化硅（SiN）膜上并由一层石墨烯封装的完整细胞中，对量子点（QD）标记的膜蛋白实现了2 nm的空间分辨率9。
本文详细描述了一种用于蛋白质标记和石墨烯包埋的实验方案9,12。该方案的目标是在保持细胞处于水合状态的前提下，分析完整固定细胞膜中HER2的空间分布。石墨烯包埋可防止细胞在真空环境中脱水，并减少辐射损伤13。该方法能够提供关于完整质膜中标记膜蛋白的信息，但不适合用于研究细胞超微结构，后者通常通过电子显微镜（EM）完成。
石墨烯是目前已知最薄的纳米材料，由单层碳原子以蜂窝状晶格结构排列而成14。它具有独特的性能，包括高柔韧性和机械强度。最近的研究表明，无缺陷的石墨烯对气体和液体具有不可渗透性，但缺陷允许氢气渗透15。通过使用此处所采用的多层石墨烯可降低这种泄漏。双层石墨烯最近已被证明可作为冷冻电镜（cryo-EM）样品的支撑材料，与只能形成非均匀层的氧化石墨烯相比，其能改善薄冰层的均一性16。研究还表明，石墨烯可在液相透射电子显微镜观察过程中减少生物样品的电子束损伤13,17。作为一个示例性实验，本研究对标记了量子点（QDs）的哺乳动物乳腺癌细胞系SKBR3中表达的HER2蛋白进行了空间分布的STEM成像18。细胞被接种在带有电子透明氮化硅（SiN）膜的硅微芯片上19。选择该微芯片作为支撑材料，是因为其结构坚固，兼容光学显微镜（LM）和电子显微镜（EM），且整个标记过程可直接在微芯片上完成19。细胞贴壁后，采用两步标记法对HER2进行标记20。首先，将一种生物素化的抗HER2抗体模拟化合物21与HER2结合。随后对细胞进行化学固定，以防止标记物诱导受体聚集，并增强细胞超微结构的稳定性。接着，将包被链霉亲和素的量子点（QDs）连接至HER2-抗体模拟物复合物上。由于量子点具有明亮的荧光信号和高电子密度核心，因此可实现荧光显微镜与电子显微镜的关联成像（CLEM）20。CLEM特别有用，因为可用于STEM分析的细胞感兴趣区域可从荧光显微镜的概览图像中选取，这些图像可突出显示HER2在细胞上的定位。通过荧光显微镜分析细胞，以识别HER2表达水平较高的区域。随后，将一层3至5层厚的石墨烯转移至细胞表面进行包覆9,22。之后，将样品装入电镜样品台。使用环形暗场（ADF）探测器采集STEM数据，从而获得HER2在细胞表面的空间分布信息及其相对于细胞表面位置的分布情况，但无法提供细胞超微结构的信息。为评估样品在电子束辐照下的稳定性，以逐渐增加的辐照剂量 (D)进行一系列图像采集。比较了石墨烯包覆与未包覆样品之间的差异，并评估了多种类型的辐射损伤。
本方案采用过表达HER2的哺乳动物乳腺癌细胞系SKBR3作为靶向HER223的模型系统。该方案包括制备一个石墨烯涂层样品，以及一个未涂石墨烯的对照样品用于比较。实验需设置重复，因为SiN窗口偶尔可能发生破裂，同时为了在大多数情况下获得实验重复样本。该方法的整体产率较高，意味着通常能够获得覆盖细胞的石墨烯微芯片，且误差极小，尽管并非在所有情况下SiN窗口的整个表面都能被石墨烯完全覆盖。重复实验未在方案中单独描述。
标记方案（步骤1-5）与先前发表的在COS7成纤维细胞中对表皮生长因子受体进行标记的方案相似24；有关微芯片的操作以及培养板的使用细节可参考该论文。以下方案已针对HER2的标记、石墨烯涂层9以及样品辐射耐受性的检测进行了优化。
方案
1. 微芯片的清洗及聚-L-赖氨酸（PLL）和纤连蛋白样蛋白（FLP）包被
- 将两个带有氮化硅（SiN）薄膜（2.0 × 2.6 mm）的微芯片放入50 mL丙酮中。操作时需小心，保持芯片平面朝上。使用平头镊子以避免损坏边缘，并在用镊子夹取时避免接触芯片顶部表面，以防SiN窗口破裂。
注意：也可使用聚四氟乙烯涂层或碳素尖头镊子，以防止微芯片受损。 - 轻轻摇动烧杯，对芯片清洗2分钟，注意观察微芯片不要翻转。
- 将微芯片转移至50 mL乙醇中，轻轻摇动烧杯清洗2分钟。确保转移过程迅速，防止残留丙酮干燥。
- 用50 mL水清洗微芯片，持续10分钟。
- 将微芯片浸入新配制的20 mL乙醇烧杯中。
- 将微芯片放置于洁净室纸巾上晾干。
- 在70 mTorr压力下，使用11.5 sccm O2和35 sccm Ar，射频（RF）功率设为50 W，对微芯片进行5分钟的等离子清洗。
- 将微芯片置于层流罩内，用于无菌细胞操作。
- 配制0.01% PLL水溶液。配制15 µg/mL FLP的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。
- 在层流罩内准备一个24孔板，按以下顺序分别向5个孔中加入1 mL溶液：第1孔—PLL；第2孔—水；第3孔—水；第4孔—FLP；第5孔—PBS；第6孔—PBS。
注意：清洗步骤通过镊子夹取微芯片浸入指定的24孔或96孔板中数秒完成。孵育步骤则将微芯片在指定溶液中于规定时间和温度下孵育。转移微芯片应在数秒内完成。 - 将微芯片在PLL溶液中孵育5分钟，随后用清水洗涤两次。
- 将微芯片在FLP溶液中孵育5分钟，随后用PBS洗涤两次。
- 将两个微芯片分别转移至新96孔板的孔中（每孔一个微芯片），孔内已预先加入50 µL无血清培养基用于接种细胞。
- 将微芯片置于37 °C、5% CO2条件下孵育，直至细胞悬液制备完成。
2. 在氮化硅膜微芯片上接种细胞
- 在超净工作台中准备所有耗材和设备，以确保无菌操作。
- 用生长培养基洗涤SKBR3乳腺癌细胞系一次。生长培养基为含10%胎牛血清（FCS）和1%非必需氨基酸（NEAAs）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
- 用1 mL细胞解离液孵育细胞，直至细胞从培养瓶中脱落。
- 向锥形瓶中的离心后细胞加入 5 mL 培养基。将该细胞悬液转移至离心管中。
- 移液器 20 µL 将细胞悬液加入血细胞计数板，以测定细胞浓度。使用以下公式。
. - 制备浓度为 2.5 x 10⁶ 个细胞/mL 的单细胞悬液5 细胞/毫升。通过以下公式计算所需制备的细胞悬液量：
加培养基至所需体积。 - 添加 100 µL 将细胞悬液加入96孔板的两个孔中，每个孔内含有PLL和FLP包被的微芯片，且氮化硅膜面向上。 50 µL 无血清培养基，使每孔细胞数为25,000个。
- 将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 和5% CO2 静置5分钟，使细胞贴附于芯片上。
注意：此时细胞可能从芯片上脱落，因为它们尚未完成黏附。 - 使用倒置显微镜检查微芯片上细胞的密度。确保细胞覆盖窗口区域，并留有足够空间使其充分铺展并贴壁（参见 图1A).
注意：如有需要，此时可添加更多细胞。 - 将微芯片转移至含有新孔的新孔板中 200 µL 生长培养基，并在 37 °C 和5% CO2 过夜。
- 次日下午，若细胞已充分铺展并贴壁，且经肉眼观察确认汇合度（即微孔窗内细胞覆盖面积的比例）达到约2/3时，将两个微芯片转移至无血清培养基（血清饥饿培养基）中（参见 图1B）。根据需要更换为无血清培养基，以使细胞处于定义明确的起始状态，满足不同实验间比较的需求25.
- 孵育于 37 °C 和 5% CO2 过夜。
注意：不同细胞系的细胞数量可能因其生长速率和细胞形态而异。
3. HER2 标记与固定
- 按照补充表1中的说明配制溶液。
- 在层流罩内操作，以确保无菌工作环境。使用一个96孔板，称为标记板I，每个微芯片在板中占据6个孔，每孔加入200 µL标记板I溶液：PBS/BSA、PBS/BSA/GS、抗体模拟物、PBS/BSA、PBS/BSA、PBS/BSA。每个微芯片使用板中的一整行（每行以一个字母标识，例如A1至A6）。将标记板预热至37 °C。
- 在通风橱内准备一个24孔板，称为固定板，每个微芯片在板中占据8个孔，每孔加入500 µL固定板溶液：CB、FA、CB、PBS、PBS、PBS、PBS/甘氨酸、PBS/BSA。
注意：CB吸入或经口摄入具有急性毒性，对水环境有害。操作时应在通风橱内并采取适当防护措施，并根据安全数据表（SDS）进行废弃处理。FA具有腐蚀性，对皮肤和健康有害。操作时应在通风橱内进行，并参考SDS了解其操作与废弃处理信息。 - 准备一个96孔板，称为标记板II，每个微芯片在板中占据4个孔，每孔加入200 µL标记板II溶液：QDs、PBS/BSA、PBS/BSA、PBS/BSA。
注意：此处使用24孔板以便更清晰地观察微芯片在孔中的状态。若需减少抗体模拟物（步骤3.2）和QDs（步骤3.4）的用量，建议在这些步骤中使用96孔板。
- 对细胞中的HER2进行标记。
- 上述各板准备就绪后，开始标记操作：将微芯片放入标记板I第一行的各孔中。
- 在标记为标记板I的96孔板中，用PBS/BSA清洗微芯片。
- 为防止抗体模拟物非特异性结合，使用PBS/BSA/GS在37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟，以封闭非特异性结合位点。
- 在37 °C、5% CO2条件下，使用200 nM抗体模拟物孵育10分钟。
- 用PBS/BSA清洗微芯片三次。
- 固定细胞。
- 在通风橱内将微芯片转移至24孔固定板中。
注意：自此步骤起无需无菌操作。 - 用CB清洗一次，持续数秒。
- 使用3% FA固定细胞10分钟。
- 用CB清洗一次，再用PBS清洗三次。
- 通过在PBS-甘氨酸中孵育2分钟，封闭FA的游离醛基。
- 用PBS-BSA清洗微芯片一次。
- 在通风橱内将微芯片转移至24孔固定板中。
- 连接量子点（QDs）。
- 将微芯片转移至96孔标记板II中。
- 使用20 nM QDs孵育12分钟。
- 用PBS/BSA清洗微芯片两次。
- 将微芯片保存在含有PBS/BSA的孔中。
4. 固定细胞的光学显微镜观察
- 用 2 mL PBS/BSA 溶液准备一个直径为 3.5 cm 的玻璃底培养皿。
- 取第一块微芯片，将其倒置（细胞面朝下）放入玻璃底培养皿中，并将培养皿置于荧光显微镜下。缓慢将微芯片浸入液体中，以防止细胞受损。
- 使用 40 倍物镜及相应的荧光通道，采集每块微芯片的微分干涉差（DIC）和荧光图像。
注意：此处采用 540–580 nm 的激发波长和 607–683 nm 的发射波长来检测 QD655。 - 对第二块微芯片重复上述步骤。
5. 固定后处理
- 所有步骤均需在通风橱中进行。
- 在96孔板中，每个微芯片使用6个孔，每孔加入200 µL后固定液：
CB、GA、CB、PBS、PBS、PBS。
注意：GA对水环境有害，对皮肤、呼吸系统和眼睛具有危害性。请在通风橱中操作，并参考安全数据表（SDS）获取有关操作与处置的信息。 - 将两个微芯片分别放入对应的孔中，细胞面朝上。
- 用CB洗涤一次。
- 用2% GA固定细胞10分钟。
- 用CB洗涤一次。
- 用PBS/BSA洗涤三次。
注意：FA的初次固定步骤已固定了生物结构，但膜蛋白仍可能发生一定程度的扩散，可能因每个量子点（QD）结合多个链霉亲和素而导致标记诱导的聚簇现象。因此，从FA固定到GA固定的实验步骤时间应尽可能缩短，以最大限度减少膜蛋白的扩散。 - 转移至含PBS/BSA的新孔板中，以防止渗透冲击，并添加0.02%叠氮化钠（NaN3）以抑制细菌生长，4 °C保存直至进行石墨烯包被。用石蜡膜密封孔板以防止干燥。微芯片和细胞在4 °C下可稳定保存长达2周。
注意：NaN3对水环境有害，经口摄入具有急性毒性，对皮肤和呼吸系统有害。请在通风橱中操作，并参考安全数据表（SDS）获取有关操作与处置的信息。
6. 石墨烯的清洗与转移至盐晶体上
- 从聚合物上剥离聚甲基丙烯酸甲酯-石墨烯（PMMA-石墨烯）（图2A）。
- 在聚合物表面PMMA-石墨烯周围的区域滴加几滴水。
注意：确保PMMA-石墨烯能够轻松脱离支撑聚合物，并漂浮在水面上。 - 以30–45°的角度将带有PMMA-石墨烯的聚合物浸入水中，以释放PMMA-石墨烯。
注意：聚合物仅需轻微润湿。若在聚合物上滴加过多水，可能导致PMMA-石墨烯上浮并发生折叠。
- 在聚合物表面PMMA-石墨烯周围的区域滴加几滴水。
- 使用过硫酸钠溶液蚀刻去除铜基污染物（图2B）。
注意：商用铜箔上生长的石墨烯常含有亚微米级铜残留物，可通过铜蚀刻溶液去除22。- 配制50 mL浓度为0.42 M的过硫酸钠水溶液。
- 使用标准玻璃载片将PMMA-石墨烯转移至过硫酸钠溶液中，使石墨烯面朝下。PMMA-石墨烯将漂浮在溶液表面。
- 将PMMA-石墨烯在过硫酸钠溶液中静置过夜。
- 将PMMA-石墨烯从过硫酸钠溶液中取出，用玻璃载片转移至洁净的水面上，使其漂浮半小时。
- 重复上述步骤共三次，以彻底清除PMMA-石墨烯上的过硫酸钠残留物。
- 将PMMA-石墨烯转移至氯化钠（NaCl）晶体上。
- 在培养皿中配制饱和氯化钠水溶液。
- 使用玻璃载片将PMMA-石墨烯转移至NaCl溶液表面，使石墨烯面朝下。
- 用镊子夹持NaCl晶体，拾取漂浮的PMMA-石墨烯。
注意：NaCl晶体的尺寸应略大于PMMA-石墨烯，以避免石墨烯边缘突出部分发生折叠，或使石墨烯直接接触镊子。本实验中使用尺寸为12 mm × 12 mm × 0.5 mm的NaCl晶体来拾取并支撑10 mm × 10 mm的石墨烯片。 - 将带有PMMA-石墨烯的盐晶体垂直放置2分钟，使多余水分流出。
- 将带有PMMA-石墨烯的盐晶体在室温下干燥30分钟，随后在100 °C烘箱中烘烤20分钟，以彻底去除水分。
- 通过丙酮清洗去除PMMA（图2C）。
- 在通风橱内的加热板上，将玻璃培养皿中的丙酮预热至约50 °C。密切监控温度，防止起火。
- 将带有PMMA-石墨烯的盐晶体浸入盛有丙酮的培养皿中，静置30分钟以溶解PMMA。
- 使用新鲜洁净的丙酮重复上述步骤共三次。
- 在用于样品制备前，让盐晶体上的石墨烯充分空气干燥。
7. 石墨烯涂层
注意：石墨烯涂层制备流程如图3A所示。
- 用纯水清洗一片已固定细胞并标记HER2的微芯片，以去除缓冲液中残留的盐分。将微芯片放置在滤纸上。细胞可见为深色斑点（图3B）。
- 使用剃刀刀片将NaCl晶体上的多层石墨烯切割成适合微芯片SiN窗口大小的片状。
- 准备一杯纯水，将NaCl晶体以约45°角倾斜接触水面，使石墨烯从晶体上脱离。石墨烯将漂浮至水面（图3C）。
- 用金属环从水面捕获石墨烯。石墨烯将漂浮在金属环下方的液滴中（图3D）。
- 用金属环的下表面接触微芯片的上表面，微芯片将附着在金属环上。此时可在微芯片顶部看到石墨烯（图3E）。
- 在体视显微镜下，使用滤纸轻轻吸除微芯片上残留的水分，使石墨烯完全覆盖SiN窗口上的所有细胞。
注意：吸水时石墨烯可能发生移动。请仅用滤纸边缘轻触微芯片，确保石墨烯保持在窗口上方位置。 - 使用镊子将微芯片从金属环上取下，并放置于滤纸上。石墨烯在微芯片上呈现为紫色光泽（图3F）。
- 将微芯片从滤纸转移至分隔式培养皿中。
- 向其中一个未使用的分隔室中加入一滴水，然后盖上盖子，以形成水饱和气氛。
- 如需后续测量，可用石蜡膜密封培养皿，并置于4 °C冰箱中保存。
8. STEM
- 使用对中/测试样品，在200 kV束能量下调节STEM，通过调节聚光镜获得至少0.2 nm的探针尺寸，探针电流 I = 180 pA（不同显微镜设置下的探针电流信息由制造商提供，准确度在5%以内），并通过插入光阑使束流会聚半角为13.2 mrad。通过调节投影透镜设置，将ADF STEM探测器的接收孔径半角范围（内角和外角）设为68–280 mrad。将STEM图像尺寸设为2048 × 2048像素，像素驻留时间 t = 6 µs。
- 将带有石墨烯包覆细胞的微芯片装入标准TEM样品台，使细胞朝上。
- 将样品台装入电子显微镜中。
- 使用步骤8.1中的设置，在放大倍数（M）= 800x下获取概览图像（图4）。
- 在细胞上选择一个感兴趣的区域。
- 使用ADF探测器在M = 80,000x、像素尺寸d = 1.3 nm的条件下对量子点成像（图4），采用步骤8.1中的设置。
- 以较低放大倍数（此处为M = 50,000x）获取辐照后区域的图像，以显示辐照区域（图4）。
- 计算电子剂量
其中 e 为基本电荷。根据上述设置，
误差为5%。 - 使用相同设置但将t设为60 µs，采集20幅图像以构成剂量序列，累积剂量为
。 - 为确认石墨烯的存在，将显微镜切换至TEM模式，在M = 1,200x下选择靠近细胞的区域，切换至衍射模式。在曝光时间为0.5 s、图像尺寸为2048 × 2048 × 3像素、选区光阑为50 µm的条件下记录衍射图样（图4）。
- 实验结束后，从显微镜中取出样品，将微芯片放回培养皿中，用石蜡膜密封，并在需要时于4 °C冰箱中保存，以备后续测量使用。
- 选择第二个与第一个微芯片以相同方式制备但未包覆石墨烯的微芯片。
- 对本样品重复步骤8.2–8.11，使用与上述相同的设置记录衍射图样作为对照（图4）。
9. 分析
注意：对于STEM图像中量子点位置的自动检测，分析使用了为ImageJ（NIH）开发的本地设计插件，具体方法 elsewhere20 中有描述。该插件可根据要求提供。
- 软件会自动执行以下步骤，以在 STEM 图像中检测颗粒：
- 应用高斯滤波器以降低像素噪声。
- 应用快速傅里叶变换（FFT）带通滤波器，仅保留纳米颗粒。
- 设置阈值以对图像进行二值化处理。
- 使用 10 nm 的颗粒直径及 2 的容差因子进行颗粒检测。
- 检测颗粒位置。
- 测量每组中十个量子点（QD）对之间的中心到中心距离。此处，每组测量了十个不同尺寸的距离。
- 通过将每个颗粒间距与第一幅图像中的间距进行比较，计算颗粒间距的相对变化，公式如下：
。
结果
图1A 显示细胞以这种方式接种，使小室被覆盖，但留有足够空间，以便细胞充分铺展并贴附，达到约2/3的汇合度rd (图1B）。如果在微芯片上接种的细胞过多（图1C），微芯片上没有足够的空间供所有细胞黏附。 图1D 显示同一微芯片在 24 小时后的状态。超过一半的细胞未铺展。另一方面，若接种细胞数量过少（图1E），24 小时后氮化硅窗口将出现一个较大的空腔，如图所示 图1F. 图1G 显示细胞的微分干涉相差（DIC）图像 图1A 和 图1B. 图1H 显示相应的荧光图像，以黄色伪彩显示，表明 HER2 标记成功。
代表性 STEM 数据如图所示 图4. 对石墨烯涂层（左列）和无涂层（右列）的SKBR3细胞进行了研究。 图 4A,B 显示 M = 800倍的细胞窗口概览图像。插图所示区域以 M = 80,000x 在剂量序列期间，参见 图4C,D量子点在此处显示为明亮的斑点。 图4E 和 图4F 显示 M = 矩形框所示位置处采集的50,000倍放大图像 图4C,D. 两幅图像均在采集一系列剂量数据后记录 D = (7.8 ± 0.4) × 103 e-/Å2剂量系列在 M = 80,000× 下记录。曝光区域可识别为矩形，其中未包被样品的矩形轮廓清晰可见（图4F).
为了验证石墨烯的存在，采集了SiN窗口上无细胞但有或无石墨烯区域的衍射图样。在涂覆石墨烯的样品衍射图中观察到石墨烯的六角结构（图4G），而在未涂覆的样品中则未观察到该结构（图4H）。单晶石墨烯的衍射图样会因石墨烯高度有序的六角结构而呈现六重对称性。因此，六角结构的存在表明样品上含有石墨烯。
为了研究电子束照射对样品的影响，通过累积电子剂量拍摄了一系列STEM图像。未包被样品和石墨烯包被样品的代表性结果分别如图5A-D和图5E-G所示。所有数据均在细胞边缘区域采集，该区域细胞最平坦，因此所观察到的结构最接近SiN膜。当电子剂量达到D = (1.9 ± 0.1) x 103 e-/Å2时，未包被样品的细胞表面出现明亮的结构（图5B）。随着剂量增加，这些结构逐渐增大，在系列图像的最后一幅（D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/Å2）中已清晰可见（图5C,D）。而在所有石墨烯包被的样品上均未出现此类斑点结构（图5E-G）。
按照上述方案制备并检测了额外的微芯片。共研究了6个涂层样品和7个未涂层样品。7个未涂层样品中有2个出现了这些伪影，而所有涂层样品均未发现额外的亮斑。
作为辐射损伤的另一种衡量指标，研究了量子点（QDs）之间的距离。如果发生结构损伤，预计量子点之间的距离会发生变化。在不同间距的量子点对中，测量了随着累积剂量 D 增加而产生的距离变化。图5H 显示，未包覆样品的粒子间相对距离平均变化低于1.3%，而包覆样品的平均相对距离变化保持在0.8%以下。因此可以得出结论，石墨烯包覆稳定了样品，但未包覆石墨烯的干燥样品也表现出显著的稳定性。
图1：细胞在硅芯片氮化硅窗口上的接种及HER2标记。（A）细胞接种5分钟后，SKBR3细胞在芯片氮化硅窗口区域的典型图像。（B）相同氮化硅窗口上，同一细胞在24小时后的铺展情况。（C）细胞接种5分钟后，SKBR3细胞在硅芯片上的图像。（D）与（C）相同的细胞在24小时后的图像。由于接种时芯片上细胞密度过高，细胞未能充分铺展。（E）细胞接种5分钟后芯片上的细胞图像。（F）窗口上仅可见少量细胞，因芯片上接种的细胞数量过少。（G）HER2经量子点标记后，同一SKBR3细胞的微分干涉差（DIC）图像。（H）DIC图像与HER2-QD655标记的SKBR3细胞荧光图像（伪黄色）的叠加图。 请点击此处查看该图的高清版本。
图2：将石墨烯清洁并转移至NaCl晶体上。（A）将PMMA-石墨烯-聚合物浸入纯水中以释放PMMA-石墨烯。可用玻璃载片捕获PMMA-石墨烯。（B）使用过硫酸钠溶液去除铜基污染物。为清洁石墨烯，将其转移至含有去离子水的烧杯中。这些步骤重复3次。然后将PMMA-石墨烯转移至纯水中饱和的NaCl溶液中。使用NaCl晶体从盐溶液中拾取石墨烯。（C）将NaCl晶体上的PMMA-石墨烯在室温下干燥30分钟。通过将样品块在丙酮中孵育30分钟以去除PMMA。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：接种在硅微芯片上的细胞的石墨烯涂覆。（A）石墨烯涂覆流程。将NaCl晶体上的石墨烯释放至水面，随后用金属环捕获石墨烯片并转移至硅微芯片上。（B）无石墨烯的微芯片（2.0 × 2.6 mm），其氮化硅（SiN）窗口尺寸为400 × 160 μm。SKBR3细胞呈暗斑可见。（C）石墨烯（红色圆圈）漂浮在盛水烧杯表面。（D）用金属环捕获石墨烯。（E）将微芯片附着于水滴上，使石墨烯位于SiN窗口上方。（F）石墨烯涂覆后的微芯片。石墨烯呈现为紫色光泽。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：SiN窗口上涂覆石墨烯与未涂覆石墨烯的SKBR3细胞的扫描透射电子显微镜图像。 (A) 采用 graphene 涂层样品获得的 STEM 图像 M = 800x。B非镀膜样品的STEM图像，于 M = 800x。C) M = 在 A 图中蓝色矩形位置记录的 80,000 倍图像。黄色线条表示在颗粒内部测量的距离示例。D) M = 80,000倍图像，记录于B图蓝色矩形框位置。黄线表示在颗粒内部测量的距离示例。E) M 同一区域经 C 处理后的 50,000 倍图像 D = (7.8±0.4) × 103 e-/Å2. (F) M 同一区域的 50,000 倍图像 D 并暴露于 D = (7.8±0.4) × 103 e-/Å2暴露区域清晰可见。G) 无细胞区域的石墨烯包被样品的衍射图样。石墨烯的六重对称性表现为明亮的斑点。 (H) 无石墨烯样品的衍射图样，未显示六重亮斑。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 5：无石墨烯涂层样品上出现的伪影。（A）在无石墨烯涂层样品区域获取的首张图像，放大倍数 M = 80,000x，电子剂量 D = (0.39 ± 0.02) × 102 e-/Å2。（B）在 D = (1.94 ± 0.1) × 103 e-/Å2 时首次出现伪影的图像（黄色箭头所示）。（C, D）系列中最后一张图像，电子剂量为 D = (7.8 ± 0.4) × 103 e-/Å2，伪影表现为亮斑。（E-G）无伪影出现的石墨烯涂层样品。（E）D = (0.39 ± 0.02) × 102 e-/Å2；（F）D = (1.94 ± 0.1) × 103 e-/Å2；（G）D = (7.8 ± 0.4) × 103 e-/Å2。（H）石墨烯涂层与非涂层样品中颗粒间距的相对变化。分析了两个出现伪影的非涂层样品（其中一个见图 A-C，第二个样品的最后一张图像见图 D）以及三个涂层样品（其中一个见图 E-G）。每个样品共检测了十对量子点，间距范围为 250 nm 至 3 µm。相对变化反映了一组内所有测量值的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。
补充表1：溶液与缓冲液的配制方法。 请点击此处下载该表格。
讨论
为了更好地理解蛋白质功能，获取完整细胞质膜中蛋白质定位信息至关重要。获取此类信息的方法包括超分辨率荧光显微镜技术1,2。尽管近年来超分辨率显微镜技术已取得进一步发展，但在细胞实验的实际条件下，其分辨率仍受限于约20 nm，而典型的受体蛋白尺寸范围为1–10 nm。在单细胞和单分子水平上对蛋白质进行成像，并以足够分辨率直接观察蛋白质，电子显微镜（EM）是可行的技术。然而，由于需要切片，传统的EM方法通常无法保持细胞的完整性26，从而导致有关质膜中蛋白质空间分布及其生物学背景的重要信息丢失。目前已开发出适用于完整细胞的冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）方法6，将蛋白质标记与冷冻电镜结合也是可行的27，此外已有冷冻扫描透射电子显微镜（cryo-STEM）的应用报道28。然而，冷冻电镜的工作流程主要针对细胞超微结构和蛋白质结构的研究优化，而非用于分析膜蛋白的空间分布。临界点干燥是另一种完整细胞制备方法，但样品需经历多个干燥步骤，且该技术耗时极长29。膜蛋白也可通过冷冻断裂法进行研究7。该方法中，细胞经固定、冷冻后进行断裂，断裂表面通过碳和铂层复制，随后去除生物样本，再利用电子显微镜分析复制品30。由于冷冻断裂法会丢失蛋白质在整个细胞背景下于膜内的分布信息，因此无法实现对完整细胞的全面分析。
本文介绍的方法无需对样品进行超薄切片即可研究细胞膜9,31。细胞保持完整，使得膜蛋白的定位可通过荧光图像观察，并与电镜图像进行关联分析。利用石墨烯封装方法，结合量子点标记蛋白的扫描透射电子显微镜（STEM）技术，已证明可在水合状态下对完整细胞中的单个细胞和单个分子水平的蛋白质进行研究，分辨率达到2 nm9。保持细胞处于天然状态至关重要，因为这能够保留膜蛋白的空间分布，从而实现单细胞和单分子水平的分析，这对于理解蛋白质功能以及开发新的治疗药物具有重要意义。
使用电子显微镜对生物样品进行成像的另一个关键问题是电子束引起的样品辐射损伤。常用的解决方案包括尽可能降低电子剂量，或采用各种包埋方法，例如将样品夹在薄层碳之间32。我们的方法表明，石墨烯包覆可减少未包覆样品在细胞表面出现的电子束诱导伪影。经化学固定的石墨烯包覆生物样品在200 keV束能的电子束照射下，可耐受高达 D = (7.8±0.4) × 103 e−/Å2 的电子剂量而未出现辐射损伤（如亮斑）。与其他需要复杂样品制备的电子显微技术（例如染色、包埋、（冷冻）切片、断裂等）相比，本文所述方法耗时更短。蛋白质标记可在数小时内完成，而经过培训的研究人员进行石墨烯包覆仅需约15分钟。该样品制备流程与荧光显微镜所需的步骤相当。
该方案的某些步骤可以进行修改。微芯片上的石墨烯也可以通过空气干燥，以确保在用滤纸吸干时石墨烯不会发生移动。如果石墨烯被盐类污染，可将其漂浮在水面上约一小时，使盐溶解，从而减少污染。石墨烯上出现的铜或PMMA污染，可通过延长方案中相应的刻蚀步骤来降低。已有其他石墨烯涂覆方法的报道，例如将石墨烯-PMMA直接沉积到细胞上，随后用丙酮洗涤去除PMMA33。在我们的方法中，PMMA在涂覆前即被去除，以避免后续丙酮洗涤步骤可能对细胞造成的损伤。本实验选择NaCl作为基底，是因为其表面平整，不会使石墨烯产生褶皱，且可在水中溶解以释放石墨烯9。此外，NaCl可切割成所需尺寸，且不会在石墨烯上留下基底残留物。但若综合考虑这些标准，其他基底如氯化钾也可能被使用。
为了降低潜在的标记诱导聚集风险，可在甲醛（FA）固定后直接进行戊二醛（GA）固定，从而使所有膜蛋白被固定。第一步的FA固定已能固定生物结构，但膜蛋白的扩散程度可能仍有所降低34，由于每个量子点（QD）上存在多个链霉亲和素分子，可能导致标记诱导的聚集。GA固定可能在光镜（LM）观察时产生自发荧光信号，因此在本方案中是在光镜成像之后进行，但该自发荧光也可通过其他方法降低34。二甲胂酸盐缓冲液具有较强毒性，也可使用其他固定剂，但此处选用二甲胂酸盐缓冲液，因其是电镜（EM）方案中常用的缓冲液，可避免沉淀生成，抑制细菌和真菌生长，并与维持脂质膜超微结构完整性所需的钙离子相容35。如有需要，可使用四氧化锇作为额外固定步骤以稳定脂质成分。这有助于增强细胞结构的对比度，但也会向体系中引入另一种金属，从而降低量子点（QD）的对比度。
本文所述方案包含多个需要良好指导的步骤。在操作微芯片之前需要经过一定培训，以避免划伤微芯片的氮化硅（SiN）表面并防止其破损。如前所述，建议制备双份微芯片，因为氮化硅窗口有时会发生破裂。在微芯片上获得所需数量的细胞也需要一定经验。用石墨烯包覆细胞需要经过训练，因为找到使石墨烯在水面上漂浮的合适倾斜角度可能较为困难。从水中捞取石墨烯时，也可能难以观察到极薄的石墨烯层。一旦石墨烯转移至微芯片上，必须立即用滤纸吸除多余的水分。此操作应仅使用滤纸的尖端进行，以避免将石墨烯从微芯片上移除。
石墨烯包被可防止样品上出现伪影。但对于电子剂量 D < 4 × 102 e-/Å2 的情况，未包被样品也未出现伪影，仅在两个未包被样品中观察到伪影。因此，对未包被细胞的检测似乎也是可行的，尽管使用石墨烯包被更为理想，可避免伪影形成的风险。未来可对这些伪影的成分进行分析，以提供防止其形成的线索。关于细胞的结构稳定性，仅观察到石墨烯包被带来轻微改善。固定后的细胞在被检测的较薄区域中明显趋于稳定，这些区域的细胞结构与SiN膜非常接近。然而，我们在此未考察暴露于真空时细胞样品可能出现的干燥伪影4。细胞干燥会导致细胞收缩，从而引起量子点（QD）间距随之改变。在本研究所采用的电子剂量下，石墨烯包被与未包被样品的量子点间距均保持稳定。未来仍需进一步研究石墨烯包被对细胞在电子显微镜检测中的影响。
该方法的一个局限性在于必须对细胞进行化学固定，因此无法开展活细胞实验。但如果不需要标记，且使用结构稳定性较高的细胞（例如细菌），则可将未固定的细胞包埋于石墨烯中用于电镜观察36，尽管此时电子束耐受剂量有所不同。此外，蛋白质本身无法直接被检测，因此需要量子点（QDs）来实现蛋白质的可视化。若能使用更小的标记物，该方法将得到进一步改进。一个值得讨论的问题是，超微结构不清晰可见究竟是优点还是缺点。我们的方法类似于荧光显微镜技术，仅能观察到特定被标记的蛋白质37。增强超微结构的可见性虽然能向图像中引入更多结构信息，但在一定程度上会妨碍对单个标记位置的识别。此外，本文所述方法仅针对一种蛋白质，若需实现多种蛋白质的同时标记，还需对实验方案进行相应优化和补充。最后，该方法的有效性依赖于是否存在小尺寸、高亲和力且具有特异性结合能力的分子，例如抗体模拟物21或纳米抗体38。常用的抗体分子体积较大，可能阻碍对蛋白质亚基在寡聚化过程中功能状态的检测。
我们的方法能够在保持细胞水合状态的同时，利用透射电子显微镜研究完整细胞中的蛋白质功能。该方法可方便地对一系列细胞进行观察，也可用于研究其他类型的细胞和蛋白质。如果无需进行蛋白质标记，本方案的部分步骤可用于多种生物样本的石墨烯包被。研究完整细胞的能力在细胞生物学研究中具有重要意义，有助于在分子水平上理解膜蛋白功能的相关性。
披露
作者无任何披露信息。
致谢
我们感谢 D. B. Peckys 在细胞培养方案方面的帮助，感谢 F. Weinberg 对手稿的审阅，感谢 T. Trampert 在实验和图示方面的协助，感谢 S. Smolka 在图示方面的帮助，以及感谢 E. Arzt 通过 INM 提供的支持。本研究由 Else Kröner-Fresenius-Stiftung 基金会资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HPLC用丙酮（纯度≥99.8%） | 德国伦宁根 Th. Geyer GmbH + Co. KG | 2626-1L | |
| AL54 分析天平 | Mettler-Toledo GmbH，德国吉森 | 30029077 | |
| 白蛋白第V组分，无生物素 ≥ 98%，用于分子生物学 | 卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄 | 0163.2 | |
| 抗HER2亲和体分子，生物素偶联 20 µM | Affibody，索尔纳，瑞典 | 10.0817.02.0001 | |
| 原子分辨率分析电镜 JEM-ARM200F | JEOL（德国）有限公司，弗赖辛，德国 | ||
| 硼酸 | Sigma-Aldrich，默克，德国达姆施塔特 | B6768-500G | |
| 二甲胂酸钠三水合物 ≥ 98 % | 卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄 | 5169.1 | |
| 细胞培养瓶，聚苯乙烯，经处理，无菌，带滤膜螺旋盖，50 ml | Labsolute，Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 7696781 | |
| 细胞培养瓶，聚苯乙烯，经处理，无菌，带滤膜螺旋盖，250 ml | Labsolute，Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 7696782 | |
| 细胞培养多孔板，经处理，24孔 | Labsolute，Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 7696792 | |
| 细胞培养多孔板，经处理，96孔 | Labsolute，Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 7696794 | |
| CELLSTAR 细胞培养瓶，TC 处理，250 ml | Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森 | 658170 | |
| CELLSTAR 细胞培养多孔板 96 孔 | Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森 | 655180 | |
| CELLSTAR 离心管 15 ml 无菌 | Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森 | 188271 | |
| CELLview 细胞培养皿，聚苯乙烯材质，35/10 毫米，玻璃底，1 个孔 | Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森 | 627861 | |
| 离心机 5418 | Eppendorf，德国韦瑟林-贝岑多夫 | 5401000010 | |
| 50 ml 无菌离心管 | Labsolute，Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 7696705 | |
| Corning CellStripper 非酶解细胞解离液 | 美国纽约州康宁 | 25-056-CI | |
| D(+)-蔗糖，纯度≥99.7%，粉末状 | 德国伦宁根，Th. Geyer GmbH + Co. KG | 9286.1 | |
| 一次性血细胞计数板 C-Chip 改良型内波尔 | Carl Roth GmbH + Co KG，德国卡尔斯鲁厄 | PK36.1 | |
| Easypet | Eppendorf，德国Wesseling-Berzdorf | 4430000018 | |
| Eppendorf Research plus 可调移液器，0.1 - 2.5 µl | Eppendorf，德国Wesseling-Berzdorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research plus 可调移液器，2 - 20 µl | Eppendorf，德国韦瑟林-贝泽多夫 | 3123000039 | |
| Eppendorf Research plus 可调移液器，10 - 100 µl | Eppendorf，德国Wesseling-Berzdorf | 3123000047 | |
| Eppendorf Research plus 可调移液器，100 - 1000 µl | Eppendorf，德国Wesseling-Berzdorf | 3123000063 | |
| HPLC用无水乙醇（纯度≥99.9%） | Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 2222-1L | |
| 纤维连接蛋白样工程蛋白*poly mer-plus | 德国伦宁根，Th. Geyer GmbH + Co. KG | F8141 | |
| 荧光显微镜 Leica DMI6000 | 徕卡显微系统有限公司，德国韦茨拉尔 | ||
| Gibco 优等改良伊格尔培养基（DMEM），高糖，含GlutaMAX补充剂和丙酮酸钠 | FisherScientific，美国新罕布什尔州汉普顿 | 31966021 | |
| Gibco 胎牛血清（FCS） | 美国新罕布什尔州汉普顿，FisherScientific公司 | 10099141 | 批号：1751893 |
| Gibco 山羊血清，新西兰来源 | FisherScientific，美国新罕布什尔州汉普顿 | 16210064 | 批号：1788320 |
| Gibco 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | 赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 10010015 | |
| Galaxy 48R CO2 培养箱 | 德国威塞尔林-贝岑多夫，艾本道夫，新不伦瑞克 | CO48310001 | |
| Gatan Model 950 Solarus— 等离子清洗机 | Gatan GmbH, Mü德国南肯 | ||
| 戊二醛溶液 I级，25%水溶液，经特殊纯化，专用于电子显微镜固定 | Sigma-Aldrich，默克，德国达姆施塔特 | G5882 | |
| 甘氨酸 ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP | 卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄 | T873.1 | |
| 倒置实验室显微镜 Leica DM IL LED | 德国韦茨拉尔徕卡显微系统有限公司 | DM IL LED | |
| 加热板 | Heidolph Instruments GmbH & CO. KG，德国施瓦巴赫 | MR 3002 | |
| MEM非必需氨基酸（NEAAs）100倍浓缩液，不含L-谷氨酰胺 | Biowest，Nuaillé法国 | X0557-100 | |
| 显微镜载玻片 76 mm × 26 mm | DWK生命科学有限公司，维尔泰姆/美因 | ||
| 非无菌微量离心管（1.5 ml，2 ml） | Labsolute，Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 1.5 ml：7696751，2 ml：7696752 | |
| MSc-Advantage— II级生物安全柜 | 赛默飞世尔科技，美国沃尔瑟姆 | ||
| Ocean Microchips SiN 窗口 400x150 µ米，200 纳米间隔器 | DENSsolutions，荷兰代尔夫特 | ||
| Omnifix一次性使用鲁尔锁型单件式注射器（10 ml、20 ml、50 ml） | B. Braun Melsungen AG，德国美尔松根 | 10 mL：C542.1 20 ml：T550.1 | 通过卡尔·罗斯特有限责任公司（Carl Roth GmbH）购买&Co. KG，卡尔斯鲁厄 |
| 烘箱 | 德国施瓦巴赫，Memmert GmbH + Co. KG | VO 200 | |
| Parafilm | VWR，德国达姆施塔特 | #291-0057 | |
| 16% 甲醛溶液，电镜级 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | 15710 | |
| 带手柄的佩尔弗克特-凯舍尔刀 | Plano GmbH，德国韦茨拉尔 | T5112 | |
| 带气溶胶屏障的移液器吸头，置于架中，非无菌 | Labsolute，Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 2-200µ7695892 | |
| 带气溶胶屏障的无菌移液器吸头，置于架中 | Labsolute，Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 0.1-10 µ7695880 2-100 µl：7695883 100-1000 µ7695886 1250 µl XL：7695887 | |
| 聚-L-赖氨酸 0.01% 溶液，分子量 70,000 - 150,000 | 德国伦宁根，Th. Geyer GmbH + Co. KG | P4707 | |
| Qdot 655 链霉亲和素偶联物 1 µM | Invitrogen，ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | Q10121MP | |
| 剃刀刀片，Gem 无涂层三面刃，钢背，脱脂处理 | Personna，AccuTec Blades，美国弗吉尼亚州维罗纳 | 94-0451 | |
| 圆形滤纸，无灰，589/3 级蓝带，直径 150 mm | 施莱歇尔 & Schuell，达塞尔，德国 | 300212 | |
| 常规体视显微镜 Leica M60 | 德国韦茨拉尔徕卡显微系统有限公司 | M60 | |
| 无菌血清学ROTILABO移液管（1 ml、2 ml、10 ml） | Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 1 ml：N231.1 2 ml：N236.1 10 ml：ET30.1 | |
| 无菌血清移液管（1 ml、2 ml、10 ml） | Labsolute，Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 1毫升：7695550 2毫升：7695551 10毫升：7695553 | |
| 无菌血清移液管（5 ml、25 ml、50 ml） | Labsolute，Th. Geyer GmbH + Co. KG，德国伦宁根 | 5 mL：7695552 25 mL：7695554 50 mL：7695555 | |
| SW22 摇床水浴箱 | Julabo GmbH，Seelbach，德国 | 9550322 | |
| 氯化钠 | 卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄 | HN00.1 | |
| 氯化钠晶体，解理 12 mm × 12 mm × 0.5–1 mm | 国际晶体实验室，加菲尔德，新泽西州，美国 | 9750 | |
| 十水合四硼酸钠，ACS 级试剂 ≥ 99.5 % | Sigma-Aldrich，默克，德国达姆施塔特 | S9640-500G | |
| 过硫酸钠 | 卡尔罗斯特有限责任公司，德国卡尔斯鲁厄 | 4365.2 | |
| 无菌 PES 注射器滤器，ROTILABO，0.22 µm | Carl Roth GmbH + Co KG，德国卡尔斯鲁厄 | P668.1 | |
| 石墨烯，3-5层，1 cm × 1 cm，简易转移法 | 美国加利福尼亚州帕萨迪纳市 ACS 公司 | TTG30011 | |
| 杜莫克丝03号镊子 | 制造 D’Outils Dumont SA，蒙特尼，瑞士 | 0103-7-PO | |
| 不锈钢镊子 02 | 制造 D’Outils Dumont SA，蒙特尼，瑞士 | 0102-7-PO | |
| 塑料可更换吸头镊子 | Ideal-tek SA，Balerna，瑞士 | 5SVR.SA | |
| Water ROTISOLV HPLC 梯度级 | 卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄 | A511.2 |
参考文献
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