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方法文章

通过dCas9协同激活介质系统在原位强制激活增强子RNA

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DOI：

10.3791/61460

⸱

2020年6月5日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center, 2Graduate School of Biomedical Sciences, University of Texas MD Anderson Cancer Center and UTHealth

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

增强子RNA（eRNA）是由活性增强子转录产生的非编码RNA。研究eRNA功能的最佳方法是在其天然染色质区域中调控其表达水平。本文介绍了一种利用CRISPR-dCas9融合转录激活因子诱导特定eRNA表达的可靠研究系统。

摘要

增强子是散布于哺乳动物基因组中的关键基因组元件，可调控组织特异性基因表达程序。越来越多的证据表明，增强子不仅为转录因子（TFs）提供DNA结合基序，还能产生一类被称为增强子RNA（eRNA）的非编码RNA。研究表明，eRNA转录本在生理和疾病状态下均可发挥重要的基因调控作用。目前研究eRNA功能的常用方法主要局限于通过敲低eRNA或化学抑制增强子转录来实现“功能缺失”研究。然而，尚缺乏一种可靠的方法来开展“功能获得”研究，以模拟某些eRNA常呈过表达状态的特定疾病情况，例如人类癌症。本文介绍一种利用dCas9介导的协同激活介质（SAM）系统精确且高效激活eRNA的方法，以实现对其功能的深入探究。我们展示了eRNA激活的完整工作流程，包括eRNA的筛选、gRNA的设计，以及通过RT-qPCR验证eRNA的激活效果。该方法为研究特定eRNA在基因调控和疾病发展中的作用提供了独特手段。此外，该系统还可用于无偏倚的CRISPR筛选，以鉴定在特定疾病背景下驱动表型的eRNA靶点。

引言

人类基因组包含一系列调控元件1,2,3。其中，增强子被认为是最重要的类别之一4,5,6。增强子在调控发育过程中发挥关键作用，并负责生成时空特异性的基因表达程序，从而决定细胞身份5,6,7。传统上，增强子仅被视为提供转录因子（TFs）结合位点的DNA元件，进而调控靶基因的表达6,8。然而，一系列研究发现，许多活跃的增强子还会转录产生非编码的增强子RNA（即eRNAs）4,9,10。

eRNA转录水平被发现与增强子的活性相关4,10。活跃的增强子产生更多的eRNA转录本，并表现出更高水平的与活跃转录相关的表观基因组标志物，例如H3K27ac和H3K4me19,11,12。一些研究表明，eRNA转录本可在靶基因的转录激活中发挥重要作用10,12。大量eRNA被发现在中国台湾人类癌症中出现失调13,14,15,16，其中许多表现出高度的癌症类型特异性和临床相关性。这些发现带来了新的机遇：阐明能够驱动或促进肿瘤发生的eRNA可能为治疗干预提供新的靶点13,15。 

目前研究eRNA功能的方法几乎完全依赖于敲低策略，这些方法使用小干扰RNA（siRNA）、短发夹RNA（shRNA）或反义寡核苷酸（ASO，其中锁核酸（LNA）是研究中常用的主要类型）10,12,17。然而，人类疾病（如癌症）通常表现出eRNA相较于邻近正常组织的显著过表达15，因此需要能够“过表达”eRNA的工具，以模拟其在疾病相关状态下的表达模式，从而开展功能研究。为实现这一目标，基于质粒的异位过表达系统并非理想选择，因为eRNA的精确转录起始位点和终止位点在很大程度上仍不明确。此外，质粒表达系统可能改变eRNA的定位，从而导致其功能出现潜在的人工假象18。本文提供了一套详细的操作方案，通过在eRNA生成的天然基因组位点（即原位）强制“过表达”eRNA，以促进其功能表征，该方法基于CRISPR/dCas9-协同激活介质系统（SAM）。

SAM 系统最初是为激活与黑色素瘤细胞中 BRAF 抑制剂耐药性相关的编码基因和长链基因间非编码 RNA（lincRNA）而开发的19。与其他 CRISPR 激活（CRISPRa）技术不同，SAM 系统由多种转录激活因子组合而成，可实现对靶区域强有力的转录激活。这些激活因子包括：与 VP64 融合的无酶活性 Cas9（dCas9，即 dCas9-VP64）；含有两个 MS2 RNA 适配体的向导 RNA（gRNA）；以及 MS2-p65-HSF1 融合激活蛋白。gRNA 中的 MS2 适配体可招募 MS2-p65-HSF1 融合蛋白至 dCas9/gRNA 结合位点附近。其中，VP64 是单纯疱疹病毒 VP16 转录激活结构域的工程化四聚体，已被证明可通过招募通用转录因子强烈激活基因转录20,21,22。MS2-p65-HSF1 融合蛋白由三部分组成：第一部分 MS2-N55K 是 MS2 结合蛋白的一种突变体形式，具有更强的亲和力23；该融合蛋白的另外两个部分是 p65 和热休克因子 1（HSF1）的转录激活结构域，二者均为具有强转录激活能力的转录因子，能够诱导强烈的转录程序24,25。因此，SAM 系统本质上构建了一个高效能的激活复合物，用于激活特定编码基因和 lincRNA 的转录19。

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方案

本方案的完整工作流程如图1所示。

1. 增强子RNA（eRNA）的选择

  1. 利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）数据中的结合峰来鉴定感兴趣的潜在增强子区域，例如组蛋白修饰（如 H3K4me1 和 H3K27ac）或转录共激活因子（如 p300）的结合峰。
  2. 通过将 ChIP-Seq 峰与 RNA-seq 信号（例如来自总 RNA-seq 或新生 RNA-seq，如全局延伸测序（GRO-Seq））相交叠，来鉴定感兴趣的增强子 RNA（eRNA）。
    注意：设计 gRNA 的区域通常应限定在“增强子核心”区域，即转录因子或共激活因子（如 p300）在 ChIP-seq 中显示出明显峰信号的区域（图 2A）。dCas9 及其融合的共激活因子将通过 gRNA 被招募至该区域，以模拟共激活因子在天然状态下的结合（图 2A）。如果有特定数据集可用，例如基因表达帽分析（Cap Analysis of Gene Expression, CAGE）4 或 GRO-cap26，可用于精确定义“增强子核心”，即两个反向转录的 eRNA 转录起始位点之间的区域4,10,26。

2. gRNA 设计

  1. 使用常见的CRISPR gRNA设计工具，例如CRISPOR27 选择脱靶效应潜力较低的gRNA（http://crispor.tefor.net/）。
    注意：其他工具如 Benchling28，或 CHOPCHOP29 也可作为gRNA设计的附加选项。 
  2. 将增强子核心DNA序列插入到 步骤1 在CRISPOR网站的列中，点击下拉按钮以选择相应的基因组（例如，human） 步骤 2 列。点击下拉按钮，将原间隔序列邻近基序（PAM）序列设置为“NGG” 步骤 3 柱，然后单击“提交”按钮以生成长度为20 bp的引导序列。
  3. 在CRISPOR工具中选择特异性评分最高的向导序列（即脱靶效应潜力最低），然后分别在5’端添加“CACCG”，在3’端添加“C”。 
    注意：选择特异性评分最高的向导（>在CRISPOR中推荐使用85。
  4. 从商业来源订购每条正义链和反义链序列的寡核苷酸。
    注意：有关 CRISPR/Cas9 gRNA 设计的更多说明可参见其他研究30,31步骤2.2中的突出端将使gRNA与SAM gRNA骨架（Addgene #61427）兼容，该骨架使用BsmBI限制性内切酶。

3. 将gRNA克隆至慢病毒载体

  1. 退火引物：将每种配对引物各1 µL（100 µM）、1 µL 10× T4连接酶缓冲液、0.5 µL T4 DNA连接酶（400,000单位/mL）和6.5 µL H2O混合，总体积为10 µL。37 °C孵育30分钟，然后95 °C孵育5分钟，并以5 °C/min的速率降温至25 °C。用H2O稀释至100 µL。
  2. 消化gRNA骨架：将2 µL 10×限制性内切酶（RE）缓冲液、1 µL含300 ng lenti_gRNA(MS2)_zeo骨架质粒（Addgene #61427）、1 µL BsmBI酶和16 µL H2O混合，总体积为20 µL。55 °C孵育15分钟。
  3. 连接反应：在25 µL体系中，向20 µL消化产物中加入2.5 µL 10× T4连接酶缓冲液、1 µL稀释后的退火产物和1.5 µL T4 DNA连接酶（400,000单位/mL）。室温孵育30分钟。 
  4. 将步骤3.3中的2 µL连接产物转化至Stbl3感受态E.coli细胞中。涂布于氨苄青霉素LB琼脂平板，37 °C过夜培养。 
  5. 挑取单菌落进行接种并提取质粒。送Sanger测序以确认gRNA序列正确插入。
    注意：引物和gRNA序列见补充表1。推荐使用Stbl3化学感受态E.coli细胞，因其在构建易不稳定的慢病毒质粒时具有更高的质粒DNA产量和更优的质粒稳定性32。

4. gRNA 效率检测 

注意：尽管并非每条 gRNA 都必须进行检测，但建议研究人员通过 Surveyor 检测（即错配切割检测）来评估 gRNA 质量，以检测插入缺失（indels）或突变，这些变异仅能由高质量的 gRNA 有效产生33,34。其他方法如通过分解追踪插入缺失（Tracking of Indels by Decomposition, TIDE）也可用于测定 gRNA 的效率30,35。Surveyor 核酸酶是一类特异性识别错配的内切酶家族成员，能够切割含有错配的双链 DNA（图 3A）。gRNA 的质量可通过其产生较小 DNA 片段的效率来反映。实际上，Surveyor 的切割效率也可能受到 gRNA 与 Cas9 转染效率的影响。 

  1. 使用脂质体转染试剂，将gRNA与表达Cas9蛋白的pSpCas9(BB)-2A-Puro质粒（Addgene #62988）共同转染至293T细胞中。在6孔板中，每孔使用各质粒1.2 µg/mL。转染后继续培养细胞3天。随后收集细胞，并按照试剂盒说明书提取基因组DNA。36. 
  2. 使用聚合酶链式反应（PCR）从基因组DNA中扩增目标增强子区域。采用如下所示的PCR条件 补充表 2. 使用引物在 补充表1 以增强子NET1e为例。将PCR产物在95 °C孵育10分钟以变性，然后以-0.3 °C/s的速率从95 °C逐步降温至25 °C，使含有或不含gRNA诱导的插入缺失（indel）或突变的单链DNA（ssDNA）相互退火杂交。 
  3. 用Surveyor核酸酶消化杂交的DNA（图 3A按照制造商的说明书进行37将步骤4.2中获得的400 ng杂交DNA、1 µL Surveyor核酸酶、1 µL Surveyor增强剂和5 µL 0.15 M MgCl₂混合2 在50 µL体系中，42 °C孵育60分钟。将DNA在琼脂糖凝胶上进行分析。实验和凝胶电泳中使用阴性对照，例如仅表达Cas9但不含有靶向gRNA的细胞。图3B). 

5. 慢病毒的制备

  1. 在1.5 mL 聚丙烯管中，按3 µg : 1 µg : 4 µg的比例加入psPAX2、pMD2.G和目标质粒（例如lenti_dCas9-VP64_Blast，Addgene #61425；或lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro，Addgene #61426）。加入500 µL Opti-MEM混匀，并在室温下孵育5分钟。
  2. 在另一个管中，将10 µL脂质转染试剂加入500 µL Opti-MEM中，室温孵育5分钟。
  3. 将步骤5.1和5.2的产物混合，室温孵育20分钟。
  4. 转染前一天接种293T细胞，使其在转染时于10 cm培养皿中汇合度达到约30%。加入4 mL常规培养基（含10% FBS的DMEM），然后将步骤5.3所得复合物逐滴加入细胞中。再加入含10% FBS的DMEM，使最终体积达到6 mL。在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中过夜孵育。 
  5. 次日，更换为10 mL新鲜DMEM（含10% FBS）。换液后24小时收集培养基。使用注射器滤器（例如0.45 µm）过滤含病毒的培养基，随后进行步骤6或将病毒在-80 °C保存。 
    注意：慢病毒操作需在生物安全二级（BioSafety Level II）柜中进行。操作时应谨慎处理与病毒相关的实验；任何直接接触病毒培养基的容器，在作为生物危害物丢弃前必须用漂白剂处理超过20分钟。

6. 细胞培养

  1. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的 CO2 细胞培养孵育箱中培养­。 
  2. 使用含 10% 胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养 MCF7 和 293T 细胞。
  3. 在 10 cm 培养皿中培养细胞，当细胞融合时以 1:3 至 1:5 的比例传代。

7. 细胞感染与筛选

  1. 将靶细胞（例如 MCF7）直接接种于含有 0.5 mL lenti_dCas9-VP64_Blast（Addgene #61425）和 0.5 mL lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro（Addgene #61426）的病毒培养基混合液中。加入 8 µg/mL 的 Hexadimethrine bromide 以提高感染效率。使用未感染的细胞作为阴性对照，用于评估抗生素筛选的效果。 
    注意：推荐的病毒培养基用量如下：10 cm 培养皿使用 6 mL，6 孔板每孔使用 1 mL，12 孔板每孔使用 0.5 mL。
  2. 感染后 24 小时，向细胞中加入含有杀稻瘟菌素（Blasticidin，MCF7 细胞为 5 µg/mL）和潮霉素（Hygromycin，MCF7 细胞为 200 µg/mL）的新鲜培养基。
  3. 将细胞持续培养在含抗生素的筛选培养基中，直至阴性对照细胞完全死亡。 
    注意：不同细胞系达到稳定状态所需时间可能不同。对于 MCF7 细胞，通常需要 5–7 天使未感染细胞完全死亡。在正式实验前，应对新细胞系进行抗生素浓度梯度的杀灭曲线实验以确定最佳筛选浓度。可接受使用细胞混合群体进行后续步骤，也可选择单克隆细胞株，以确保两种效应蛋白表达的均一性。本研究中将获得的稳定细胞系称为 SAM 效应子亲本细胞系（例如 MCF7 SAM 效应子细胞系）。建议在感染不同靶向或非靶向 gRNA 时使用同一 SAM 效应子亲本细胞系，尤其是当需要比较其效应时。 
  4. 通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测细胞是否稳定表达两种效应蛋白（示例见图 4A）。也可采用总 RNA 的逆转录后定量 PCR（RT-qPCR）方法检测两种 mRNA（dCas9-VP64 和 MS2-p65-HSF1）的表达水平（图 4B）。
    注意：用于检测两种 dCas9 效应子 mRNA 水平的引物列于补充表 1中。
  5. 制备步骤 3.5 中构建的 gRNA 慢病毒，并分别感染稳定表达 dCas9-VP64 和 MS2-p65-HSF1 的 SAM 细胞系。在 gRNA 慢病毒感染后 24 小时，向培养基中添加 Zeocin（MCF7 细胞为 100 µg/mL）。在 SAM 亲本细胞系中构建表达非靶向 gRNA（NT-gRNA）的阴性对照。 
    注意：确保所用筛选药物针对目标载体具有特异性。

8. 提取RNA并进行定量RT-PCR以检测eRNA水平

  1. 使用RNA提取试剂盒38或其他基于苯酚-氯仿的方法，从表达NT-gRNA或靶向gRNA的SAM细胞系中提取总RNA。 RNA提取时使用六孔板中一个孔内约80%融合度的细胞。
    注意：在我们的实验中，使用商业化的结合柱法或苯酚-氯仿试剂提取RNA进行eRNA检测时，未观察到显著差异。
  2. 按照制造商的说明书39，使用随机六聚体引物通过逆转录反应将纯化的RNA合成互补DNA（cDNA）。使用补充表2中的条件。
    注意：由于大多数eRNA不含有poly(A)尾1,2,4,9,10，因此通常使用随机六聚体引物进行cDNA合成。
  3. 使用可靠的引物设计工具（例如Primer 3）设计用于RT-qPCR检测目标eRNA的引物。通过检测引物对系列稀释的cDNA是否能线性扩增，并表现出预期的qPCR循环数差异，来验证引物的扩增线性。 使用补充表2中的条件。
    注意：RT-qPCR引物应靶向新生RNA-seq中高转录的区域；引物的线性测试应包含广泛浓度范围的cDNA稀释样本，以确保涵盖所有可能遇到的eRNA表达水平。线性测试示例如图5A所示。
  4. 对对照细胞（表达NT-gRNA的SAM细胞系）和表达靶向eRNA的gRNA的SAM细胞系（例如NET1e gRNA#1）进行RT-qPCR，分析eRNA的表达水平（例如图6A）。NET1e RNA的引物列于补充表1中。使用补充表2中的条件。 

9. dCas9 ChIP 与 qPCR

注意：此步骤为可选实验，用于通过特异性gRNA验证dCas9/SAM-gRNA复合物与靶增强子的结合。建议用户进行此步骤，但无需对每一个gRNA都进行测试。参见图5B所示示例。引物列表见补充表1。

  1. 交联细胞
    1. 移除细胞培养基，加入含1%甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS），室温孵育10分钟。
    2. 按1:20体积加入2.5 M甘氨酸以终止交联反应，用预冷的PBS洗涤细胞两次。加入700 µL预冷PBS，刮取细胞转移至1.5 mL离心管中。 
    3. 在4 °C下以2,000 x g离心5分钟。继续进行步骤9.2，或迅速冷冻后于-80 °C保存。
  2. 超声处理
    1. 新鲜配制LB1、LB2和LB3缓冲液。LB1：50 mM Hepes-KOH（pH 7.5）、140 mM NaCl、1 mM EDTA、10%甘油、0.5% NP-40、0.25% Triton-X 100及1×蛋白酶抑制剂。LB2：10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、200 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA及1×蛋白酶抑制剂。LB3：10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、0.1% Na-脱氧胆酸钠、0.5% N-月桂酰肌氨酸及1×蛋白酶抑制剂。实验前新鲜加入1×蛋白酶抑制剂。
    2. 向细胞沉淀中加入1 mL LB1缓冲液，充分吹打混匀，在4 °C旋转孵育10分钟，然后在4 °C以2,000 x g离心5分钟。弃上清，加入1 mL LB2缓冲液，在4 °C旋转孵育10分钟，再以2,000 x g在4 °C离心5分钟。弃上清并尽量去除残留LB2缓冲液。加入300 µL LB3缓冲液。
    3. 使用合适的超声破碎仪将染色质DNA打断至平均片段大小约为200–400 bp。超声结束后，加入30 µL 10% Triton-X 100并充分混匀。若使用新的细胞系，需预先测试合适的超声时间。 
    4. 以14,000 x g离心去除沉淀。将上清转移至新离心管，加入630 µL LB3缓冲液和70 µL 10% Triton X-100，总体积调至1 mL。向上清中加入2 µg Cas9抗体，4 °C旋转孵育过夜。 
  3. 免疫复合物捕获与交联逆转 
    1. 配制RIPA缓冲液（50 mM HEPES pH 7.6、1 mM EDTA、0.7% Na-脱氧胆酸钠、1% NP-40、0.5 M LiCl）和洗脱缓冲液（1% SDS和0.1 M NaHCO3）。
    2. 用含1% BSA的PBS洗涤Protein G Dynabeads三次，再用LB3缓冲液洗涤一次。 
    3. 向样品中加入30 µL Protein G Dynabeads，4 °C孵育4小时。
    4. 用500 µL RIPA缓冲液洗涤beads-免疫复合物6次。注意避免beads干燥。 
    5. 用TE缓冲液洗涤beads-免疫复合物一次，弃去缓冲液。
    6. 向beads-免疫复合物中加入200 µL洗脱缓冲液，涡旋混匀，随后置于可调温加热振荡器中，65 °C、600 rpm振荡6–16小时以逆转交联。 
  4. DNA提取
    1. 从振荡器中取出离心管，短暂离心使beads沉降，置于磁力架上。将200 µL上清转移至新离心管，加入200 µL TE缓冲液。
    2. 向管中加入1 µL RNase A（1 mg/mL），37 °C孵育1小时。 
    3. 孵育1小时后，向样品中加入2 µL Proteinase K（20 mg/mL），65 °C孵育2小时。
    4. 短暂离心后，加入400 µL酚-氯仿-异戊醇混合液。充分混匀后，在10,000 x g离心5分钟。
    5. 取上层水相400 µL转移至含有16 µL 5 M NaCl和1 µL糖原（20 µg/µL）的1.7 mL离心管中，充分混匀。
    6. 加入800 µL 100%乙醇，-20 °C过夜沉淀。
    7. 次日早晨，在4 °C以14,000 x g离心15分钟。
    8. 弃上清，用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，在14,000 x g离心10分钟。 
    9. 弃乙醇，空气干燥沉淀，溶于50 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA）中。
  5. 采用一对靶向增强子核心区域的引物进行ChIP-qPCR，检测SAM复合物在靶位点的招募情况。使用靶向无关区域的一对引物作为阴性对照。

10. eRNA过激活的细胞生长实验及其他功能检测 

  1. 用胰蛋白酶消化表达非靶向gRNA或eRNA靶向gRNA的SAM细胞系，并在96孔板中每孔接种约3,000个细胞。 
  2. 使用活细胞成像仪或其他方法（如细胞计数或水溶性四唑盐-1法）检测细胞生长。
  3. 利用半数抑制浓度（IC50）检测SAM介导的NET1e过表达对细胞响应特定抗癌药物的影响15。
    注意：乳腺癌细胞在过表达位于NET1基因邻近区域的eRNA（称为NET1e）后，其细胞生长实验和药物敏感性测试结果已有所呈现15。根据各个具体项目的需求，还可开展其他在细胞或整体生物水平上的实验。

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结果

图1 展示了本方案的整体工作流程。我们的研究重点是一种具有代表性的eRNA， NET1e15，其在乳腺癌中过表达，利用SAM系统对其进行激活并研究其在调控基因表达、细胞增殖及癌症药物反应中的生物学功能。为此 NET1 增强子，多个p300 ChIP-Seq峰，两侧为转录的eRNA转录本（图2A，B) 被标记。根据强烈的GRO-Seq信号，选择其中一个p300 ChIP-Seq峰作为增强子核心（即双向eRNA转录起始的位置， 图2B). NET1 增强子区域也显示出密集的H3K4me1和H3K27ac ChIP-Seq峰。在该增强子核心p300峰内设计了多个gRNA，其中两个gRNA在插图中以箭头标示图2B

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讨论

根据我们的数据，我们得出结论：SAM 系统适用于研究 eRNA 在调控细胞表型（例如细胞生长或药物耐受性）中的作用。然而，由于以下原因，在使用 SAM 系统时需要谨慎设计 gRNA，以实现稳定的 eRNA 激活。首先，特定细胞系或细胞类型中 eRNA 的转录起始位点（TSS）尚未被清晰注释。因此，需要利用表观基因组信息（例如 H3K27ac、转录因子或 p300 的 ChIP-Seq 数据），以及 GRO-Seq 所揭示的转录活性（若有，还可结合 CAGE4 或 GRO-cap26 数据集），来推断转录起始位点，从而合理设计 gRNA，避免 dCas9/SAM 复合物干扰增强子区域正常的转录过程。其次，当前设计工具提供的 gRNA 在 SAM 系统中可能表现出差异化的 eRNA 激活能力，其背后的机制尚不明确。这可能与不同 gRNA 序列的结合动力学差异30有关，也可能与 gRNA/dCas9 结合位点相对于增强子核心区域附近其他关键调控 DNA 元件的相对位置有关。为确保 eRNA 的有效激活...

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披露

内容仅由作者负责，不一定代表德克萨斯州癌症预防与研究所的官方观点。

致谢

本工作获得了对 W.L. 的资助（德克萨斯州癌症预防研究所 CPRIT RR160083 和 RP180734；美国国家癌症研究所 K22CA204468；美国国家普通医学科学研究所 R21GM132778；德克萨斯大学 UT Stars 奖项；以及 Welch 基金会 AU-2000-20190330）以及对 J.L. 的博士后奖学金资助（UTHealth 癌症预防研究培训项目博士后奖学金，CPRIT RP160015）。我们感谢原始出版物15，本文部分图示引自该文献（经修改），该文献遵循知识共享许可协议（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杀稻瘟菌素GoldbioB-800-100
BsmBI 限制性内切酶New England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 单克隆抗体Active Motif61757批号: 10216001
脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物New England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基Corning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
胎牛血清GenDEPOTF0900-050
糖原Thermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
六亚甲基溴化铵SigmaH9268
潮霉素 BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte 活细胞成像仪Essen BioScienceIncuCyte S3 活细胞分析系统
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo 骨架Addgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-脱氧胆酸钠SigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-月桂酰肌氨酸Sigma97-78-9
Opti-MEM 低血清培养基Thermo Fisher Scientific31985070
PES 注射器滤器BASIX13-1001-07
蛋白酶抑制剂混合片剂Roche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 高保真 DNA 聚合酶New England BioLabs Inc.M0491S
Q5 反应缓冲液New England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA 小量提取试剂盒ZYMO ResearchD3025
Quick-RNA 小量提取试剂盒ZYMO ResearchR1054
限制性内切酶缓冲液New England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR 检测系统Thermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
超声破碎仪QsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 感受态细胞Thermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV 逆转录酶Thermo Fisher Scientific719000
Surveyor 突变检测试剂盒Integrated DNA Technologies706020
T4 DNA 连接酶New England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA 连接酶反应缓冲液New England BioLabs Inc.B0202S
TE 缓冲液Thermo Fisher Scientific46009CM
PCR 仪Bio-Rad LaboratoriesT100
恒温混匀仪Sigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

参考文献

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