动物实时fMRI脑图谱绘制

摘要

利用实时功能磁共振成像（fMRI）实验装置，可促进动物脑功能图谱的研究。通过在动物磁共振成像系统中采用最新的软件，我们建立了一个用于小型动物fMRI的实时监测平台。

摘要

动态fMRI信号响应在很大程度上取决于动物的生理状态，无论其处于麻醉状态还是清醒状态。我们开发了一种实时fMRI平台，可指导实验人员在数据采集过程中即时监测fMRI响应，从而通过调节动物生理状态，实现动物大脑中期望的血流动力学响应。该实时fMRI系统基于14.1 T的临床前MRI设备，能够在麻醉大鼠的初级前爪体感皮层（FP-S1）中实现动态fMRI响应的实时成像。与通过事后分析来探究导致fMRI信号变异的混杂因素不同，该实时fMRI平台利用MRI系统内置的自定义宏函数和通用神经影像分析软件，提供了一种更高效的方法来识别动态fMRI响应。此外，该平台还具备即时故障排查能力，并为动物脑功能研究提供了实时生物反馈刺激范式。

引言

功能磁共振成像（fMRI）是一种非侵入性方法，用于测量与大脑神经活动相关的血流动力学反应^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}，例如血氧水平依赖（BOLD）、脑血容量和脑血流信号。在动物研究中，血流动力学信号可能受到麻醉¹⁰、清醒动物的应激水平¹¹以及潜在的非生理性伪影（如心脏搏动和呼吸运动）^12,13,14,15的影响。尽管已有多种后处理方法被开发用于任务态和静息态功能动态及功能连接图谱的回顾性分析^16,17,18,19，但能够提供动物脑内实时脑功能图谱和即时读数的技术仍十分有限²⁰（其中大多数主要应用于人脑图谱研究^{21,22,23,24,25,26,27}）。特别是，在动物研究中尚缺乏此类实时fMRI图谱方法。因此，有必要建立一个fMRI平台，以实现对实时脑状态依赖性生理阶段的探究，并为动物脑功能研究提供实时生物反馈刺激范式。

在本研究中，我们展示了利用 MRI 控制台软件的自定义宏功能构建的实时 fMRI 实验装置，用于演示在麻醉大鼠初级前爪体感皮层（FP-S1）中诱发的 BOLD-fMRI 反应的实时监测。该实时装置能够利用现有的神经影像分析软件——功能神经影像分析工具（Analysis of Functional NeuroImages, AFNI）²⁸，以体素为单位在功能图上可视化持续进行的脑激活情况，以及各个时间进程。本方案详细描述了动物实验中实时 fMRI 实验装置的准备工作。除了动物实验设置外，我们还提供了详细的步骤，用于并行设置基于最新控制台软件的实时 fMRI 信号可视化与分析流程，同时结合图像处理脚本。总之，本研究所提出的动物实验用实时 fMRI 装置是一种强大的工具，可用于利用 MRI 控制台系统监测动物大脑中动态的 fMRI 信号。

方案

本研究严格遵循德国动物福利法（TierSchG）和动物福利实验动物条例（TierSchVersV）。此处描述的实验方案已通过伦理委员会（§15 TierSchG）审查，并获得州级主管部门（德国巴登-符腾堡州图宾根区政府）批准。

1. 准备用于小动物研究的BOLD-fMRI实验装置

1. 启动控制台软件以调节成像参数并采集 MRI 数据。
   注意：建议的实时 fMRI 设置通过并行使用控制台软件（版本 6）的宏功能和 AFNI 的图像处理功能来实现。
2. 在工作区浏览器中查找 MR 序列（即 Position、Localizer、快速采集弛豫增强序列（RARE）和 3D 回波平面成像（EPI）），然后将其拖动并添加到扫描列表中。
   注意：Position 和 Localizer 序列用于识别脑部感兴趣区域（ROI）。RARE 序列用于解剖结构扫描。3D EPI 序列用于测量动态 BOLD 反应。
3. 将预定义的宏脚本“Setup_rt3DEPI”和“Feed2AFNI_rt3DEPI”放置于宏脚本路径中（例如，“/opt/(PV version)/prog/curdir/(user name)/ParaVision/macros”）。在“数据重建”用户界面菜单中激活 3D EPI 重建选项“Pre Image Series Activities”和“Execute Macro”，然后在点击“扫描”按钮前链接预定义的宏脚本“Setup_rt3DEPI”。
   注意：宏脚本包含在补充文件中。
4. 安装 AFNI 软件用于实时 BOLD-fMRI 的分析与可视化。

2. 导管插入与通气手术

1. 如图1所示，设置呼吸机及生理状态监测系统，如体温、血压和呼吸记录系统。使用呼吸机设置恒定频率为60 ± 1 次/分钟，并使用带有反馈控制装置的磁共振兼容加热垫将体温维持在37 °C。
2. 在诱导室内使用5%异氟烷对成年雄性Sprague-Dawley大鼠（300–600 g）进行麻醉，手术期间通过蒸发器输送2–2.5%异氟烷。通过夹捏后肢足掌并确认无回缩反应来检查麻醉深度。
3. 使用14 G塑料套管对动物进行气管插管以实施通气（通气频率为60 ± 1 次/分钟，气体混合比例为70%空气和30%氧气）。调节呼气末二氧化碳（CO₂）浓度至25 ± 5 mmHg范围内²⁹。
   注意：在fMRI实验过程中，气管插管对于维持适当的CO₂水平至关重要。
4. 将动物仰卧位固定于手术台上，使用电动剃刀剃除一侧大腿部位的毛发，然后使用手术剪在剃毛区域的皮肤上做一切口。
   注意：切口长度约为1–2 cm，沿纵向方向。
5. 在切口区域下方找到股动脉和股静脉，用于插管，并将股动脉与股静脉从周围组织中分离出来。
6. 用外科缝线结扎分离出的股动脉一端，另一端用微型鳄嘴钳夹住，然后在结扎区域之间的股动脉上做一个小切口。
7. 通过股动脉上的小切口插入导管，并用外科缝线将导管与动脉结扎固定。使用生理监测系统持续监测动脉血压，使其维持在80–120 mmHg范围内，并定期检测动脉血气，确保扫描期间pO₂不低于90 mmHg，pCO₂维持在30–45 mmHg之间。
   注意：该插管操作对于在fMRI实验期间监测动脉血压至关重要。
8. 用编织丝线外科缝线结扎股静脉的两端，然后在结扎区域之间的股静脉上做一个小切口。使用镊子辅助完成缝合操作。
   注意：缝线长度约为1–2 cm。
9. 将导管插入股静脉，并用外科缝线将导管与静脉结扎固定。
   注意：该插管操作对于通过静脉给予α-氯醛糖以调节fMRI实验期间的麻醉水平至关重要。若动物麻醉不足，将开始自主呼吸。此时必须追加α-氯醛糖给药，以避免呼吸运动伪影。
10. 缝合皮肤上的手术切口。手术操作完成后，通过连接于股静脉的导管注入剂量约为80 mg/kg的α-氯醛糖推注液以维持麻醉状态，同时停止异氟烷的给药。

3. 将动物放入MRI扫描仪内

1. 完成2.10步骤后，立即将麻醉后的动物转移至MRI扫描仪，并将其固定在定制的托架上。
2. 将实时反馈式直肠温度计插入动物体内以监测其体温，并在动物躯干下方放置加热垫以控制温度。在MRI扫描期间，维持动物体温在37.0 ± 0.5 °C。
3. 持续输注α-氯醛糖（约25 mg/kg/h）与泮库溴铵（约2 mg/kg/h，一种肌肉松弛剂）的混合溶液，以维持麻醉状态并减少fMRI图像中的运动伪影。根据动物的生理状态，通过调节药物剂量和通气速率来监测血压和呼吸。
4. 在动物眼睛上涂抹眼用软膏，以防止fMRI实验期间角膜干燥。使用两个耳杆安全固定动物头部，避免头部运动产生的伪影。
5. 将发射/接收表面线圈固定于动物头部，并在MRI测量前将线圈调谐并匹配至拉莫尔频率（例如，在14.1 T下为599 MHz）。
   注意：此处使用直径为22 mm的线圈，以覆盖大鼠全脑。
6. 将一对针状电极插入动物前肢第1和第4趾之间的皮肤，并用外科胶带固定。随后连接刺激输入电缆至电极，确认刺激功能正常³⁰。
7. 将动物送入MRI磁体孔内，并大致置于等中心位置。

4. 测量解剖学磁共振图像

1. 在主用户界面中点击校准菜单按钮。在Adjustment Platform用户界面中依次点击以下项目，执行MRI系统的校准操作（参见控制台软件中的Help菜单）：查找基本共振频率、校准射频脉冲功率、设置最佳接收增益、测量动物体内的B0图以进行匀场、基于非定位自由感应衰减（FID）积分运行全局线性匀场。
   注意：此步骤耗时少于2分钟。
2. 点击“Scan”按钮运行定位序列，以确定动物头部在MRI孔内的位置。如果头部未位于等中心处，请前后移动托架调整头部位置，直至头部位于等中心。
3. 点击“Scan”按钮运行局部成像序列，以识别头部感兴趣区域（ROI）。选择Map Shim，并在局部成像图像中定义匀场体积的ROI，使其覆盖整个脑部，然后使用“Shim up to”选项执行高阶（例如2^nd或3^rd阶）匀场，以减少感兴趣区域内的主磁场（B0）不均匀性。
   注意：当使用EPI序列时，高阶匀场是提高BOLD-fMRI数据质量的关键步骤。
4. 点击“Scan”按钮运行T2加权RARE序列，获取冠状面全脑解剖图像（例如，使用以下序列参数：重复时间（TR）4000 ms，有效回波时间（TE）36.1 ms，矩阵128 x 128，视野（FOV）19.2x19.2 mm²，切片数32，层厚0.3 mm，RARE因子8）。
   注意：在后续的实时fMRI可视化步骤中，将使用这些解剖图像作为模板，对3D EPI图像进行配准。

5. 实时 fMRI 软件设置与 fMRI 反应可视化

1. 打开终端窗口，并使用以下命令进入实时 AFNI 插件路径：
   cd /home/(user name)/rt_afni
   注意：AFNI 插件脚本“afni_rt”包含在补充文件中。
2. 使用以下命令和选项执行带有实时插件的 AFNI 软件。
   afni -rt
   -yestplugouts
   -DAFNI_REALTIME_MP_HOST_PORT=localhost:(port number)
   -DAFNI_REALTIME_Graph=Realtime
   -DAFNI_FIM_IDEAL=(Paradigm)
   注意：在第一种情况下，该代码允许外部程序与 AFNI 交换数据；在第二种情况下，实时插件将尝试连接到用户定义的本地主机和端口上的 TCP 套接字。在第三和第四种情况下，当实时 fMRI 数据被采集时，代码将分别实时绘制 fMRI 数据的时间进程以及用户定义范式在 fMRI 时间进程中的对应曲线。更多详细信息，请访问 https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/README.environment.html。
3. 使用“Dimon”命令并配合以下选项，监控即将生成的 AFNI BRIK 文件，如图 2所示：
   Dimon -tr (EPI 的 TR) -nt (EPI 的重复次数)
   -rt -quit
   -infile_pattern realtime*.BRIK
   -file_type AFNI
   注意：“Dimon”是一个用于监控 AFNI 图像文件实时采集的命令，其选项“-rt”用于启动实时插件，而“-infile_pattern (data name).BRIK -file_type AFNI”则允许插件读取特定的 BRIK 文件，并将其发送至 AFNI 进行显示和格式化处理。更多详细信息，请访问 https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/Dimon.html。
4. 使用以下选项运行“pvcmd”命令：
   pvcmd -a JMacroManager JMMExecuteMacro -category $USER -macro Feed2AFNI_rt3DEPI
   注意：此代码存在于宏脚本“Setup_rt3DEPI”中，用于在点击 EPI 采集的“扫描”按钮后立即运行后台宏脚本“Feed2AFNI_rt3DEPI”。
5. 使用“exec pvcmd”命令并配合以下选项获取 EPI 采集参数：
   exec pvcmd -a ParxServer -r ParamGetValue -psid $ParSpaceId -param (EPI 的 PVM 参数) -id 10 -args $AcqKey $ParSpaceId $ProcnoPath
6. 在后台宏脚本“Feed2AFNI_rt3DEPI”中，使用“exec to3d”命令并配合以下选项，将 EPI 原始数据实时转换为 AFNI 文件：
   exec to3d -omri -xFOV $FOV_X -yFOV $FOV_Y -zFOV $FOV_Z -prefix $LastVolName $ImgFormat$Path2dseq
7. 确保 EPI 几何信息与解剖图像的方向一致。
   注意：“to3d” AFNI 命令将根据视野（FOV）和矩阵大小等几何信息自动运行，每当单个 TR 结束后存储一个 3D 体积数据时，便将 fMRI 原始数据转换为一个 AFNI BRIK 数据，如图 2所示。图像方向可通过“to3d”的几何参数进行调整。更多详细信息，请访问 https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/to3d.html。
8. 开启电刺激隔离器，并使用刺激区块对前肢进行一次诱发 fMRI 研究的电刺激（例如，3 Hz，脉冲宽度 300 µs，持续 4 秒，电流 2.5 mA）。
   注意：此处的区组设计范式包括 10 次刺激前扫描、3 次刺激期间扫描和 12 次刺激间期扫描（每周期共 15 次扫描）。
9. 点击“扫描”按钮运行 T2*加权 3D EPI 序列，以进行 BOLD-fMRI 研究（例如，使用以下参数：TR/TE 1500/14 ms，矩阵 64 × 64 × 32，视野 19.2 × 19.2 × 9.6 mm³，分辨率为 300 × 300 × 300 µm³）。
   注意：一旦点击“扫描”按钮，将通过预定义的宏脚本实时监控和处理原始数据。每当一个 AFNI BRIK 数据集被转换后，AFNI 软件中即会显示 3D EPI 图像的体素级时间进程图，并在每个 TR 结束后自动更新。
10. 为将 EPI 图像叠加在解剖 RARE 图像之上，使用“to3d”命令将 RARE 图像转换为 AFNI BRIK 数据集（方法同步骤 5.6），然后使用“align_epi_anat.py” AFNI 脚本并配合以下选项将 EPI 图像配准至解剖图像：
    align_epi_anat.py -anat anatomy_template_al+orig -epi epi.$(epi data number)+orig -epi_base 1 -suffix _volreg -rat_align -cost lpa -epi2anat
    注意：更多详细信息，请访问 https://afni.nimh.nih.gov/pub/dist/doc/program_help/ align_epi_anat.py.html。
11. 为处理 BOLD 反应的功能图，使用“3dDeconvolve”命令并配合以下选项，对 3D+时间数据集与特定刺激时间序列进行反卷积计算：
    3dDeconvolve -input (输入文件名)+orig. -nfirst 0 -polort 3 -num_stimts 1 -stim_times 1 (刺激范式文件名) 'BLOCK(4,1)' -stim_label 1 forepaw -tout -fout -rout
    注意：空间平滑和时间滤波等图像处理步骤已整合至自定义的 AFNI 数据处理脚本中。更多详细信息，请访问 https://afni.nimh.nih.gov/afni/doc/help/3dDeconvolve.html。
12. 为可视化 BOLD 信号的功能图，在 AFNI 软件中使用交互式聚类功能。打开“Define Overlay”选项，并从 AFNI 用户界面菜单中选择“Clusters”功能。
13. 完成最后一次 fMRI 扫描后，将动物从 MRI 扫描仪中取出，并根据批准的方案实施安乐死。
    注意：本研究使用了 AFNI 软件的图像处理功能以及最新控制台软件中的宏功能来处理实时 fMRI 数据。宏功能的详细信息和说明可在控制台软件的帮助菜单中找到。AFNI 软件为免费软件，可通过 NIMH-AFNI 网站直接下载。用于建立 AFNI 与控制台系统之间连接的相关脚本已附上。

结果

图3 和 图4 展示了在电刺激前爪（3 Hz，4 秒，脉宽 300 us，2.5 mA）条件下，具有代表性的实时体素级 BOLD-fMRI 时间进程及功能图谱。fMRI 实验设计范式包括 10 次刺激前扫描、3 次刺激期间扫描和 12 次刺激间期扫描，共包含 8 个周期（总计 130 次扫描）。总扫描时间为 3 分 15 秒（195 秒）。图3 显示了对侧前爪感觉皮层（FP-S1）的体素级时间进程（黑线），其对应于实时采集格式下的区组设计范式（红线）。图4 显示了对应于电刺激前爪所激活的 BOLD 图谱。激活区域以彩色簇状形式（红色和黄色）被检测并呈现。实验人员可使用 AFNI 软件中的“Clusters”功能，交互式地探索聚类体积，并将其以叠加的彩色编码图像形式显示。

讨论

实时监测fMRI信号有助于实验人员调节动物的生理状态，以优化功能定位。清醒动物中的运动伪影以及麻醉效应是介导fMRI信号变异性的主要因素，这会干扰对信号本身的生物学解释^{31,32,33,34,35,36,37,38}。实时fMRI平台可提供即时信息，辅助优化扫描参数和麻醉给药方案。此外，实时脑血流动力学反应还可用于提供基于fMRI的生物反馈控制信号，服务于多模态脑功能研究中的新型刺激范式。

关于所提出的实时fMRI设置，一个尚未解决的问题是其对厂商特定控制...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14.1T Bruker MRI 系统	Bruker BioSpin MRI GmbH	N/A
A365 刺激隔离器	World Precision Instruments	N/A
AcqKnowledge 软件	Biopac	RRID:SCR_014279, http://www.biopac.com/product/acqknowledge-software/
AFNI	Cox, 1996	RRID:SCR_005927, http://afni.nimh.nih.gov
CO2SMO（ETCO2/SpO2 监测仪），型号 7100	Novametrix Medical Systems Inc	N/A
异氟烷	CP-Pharma	货号# 1214
Master-9	A.M.P.I	N/A
纳升级注射器	World Precision Instruments	货号# NANOFIL
泮库溴铵	Inresa Arzneimittel	货号# 34409.00.00
ParaVision 6	Bruker BioSpin MRI GmbH	RRID:SCR_001964
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	货号# 10010-023
大鼠：Sprague Dawley 大鼠	Charles River Laboratories	Crl:CD(SD)
SAR-830/AP 呼吸机	CWE	N/A
α-氯醛糖	Sigma-Aldrich	货号# C0128-25G;RRID