一种用于研究急性绒毛膜羊膜炎对新生儿肠道发育影响的小鼠母体炎症致胎儿暴露模型

摘要

我们建立了一种绒毛膜羊膜炎模型，以模拟胎儿在无活体生物并发症的情况下暴露于母体炎症（FEMI）的环境，从而研究FEMI对子代肠道发育的影响。该模型可用于探讨绒毛膜羊膜炎后肠道损伤发生机制的相关病因。

摘要

绒毛膜羊膜炎是早产的常见诱因，且与早产相关的多种发病率密切相关，包括坏死性小肠结肠炎（NEC）。然而，这两种疾病之间的机制性联系尚未被阐明。我们采用了一种小鼠绒毛膜羊膜炎模型，该模型通过脂多糖（LPS）诱导母体炎症对胎儿的暴露（FEMI）。这种FEMI模型可引发无菌性的母体、胎盘及胎儿炎症级联反应，而这种反应在许多临床绒毛膜羊膜炎病例中同样存在。尽管已有使用活菌建立的模型，能更准确地模拟上行感染所致绒毛膜羊膜炎的病理生理过程，但这些方法可能对未成熟肠道及其伴随发育中的微生物组的发育产生间接影响。利用本方案，我们已证明LPS诱导的FEMI会导致妊娠丢失和早产呈剂量依赖性增加，并导致子代肠道正常发育的破坏。此外，我们还发现FEMI显著增加子代肠道损伤和血清细胞因子水平，同时减少杯状细胞和潘氏细胞的数量，而这两类细胞均在抵御肠道炎症的先天免疫中发挥第一道防线作用。尽管类似的LPS诱导FEMI模型已被用于研究绒毛膜羊膜炎与中枢神经系统后续异常之间的关联，但据我们所知，本方案是首个尝试阐明绒毛膜羊膜炎与后期肠道发育紊乱之间机制性联系的研究，从而为绒毛膜羊膜炎与NEC之间的关联提供潜在解释。

引言

绒毛膜在哺乳动物妊娠过程中发挥着至关重要的作用。它包括绒毛膜和羊膜，具有多种功能：包裹并保护胎儿，促进母体与胎儿隔室之间的旁分泌信号传递¹，并在绒毛膜内部形成局部反馈环路，这些环路可能参与启动分娩过程¹。目前对这些膜结构的认识表明，羊膜主要提供结构屏障功能，而绒毛膜则主要作为免疫缓冲层，保护发育中的胎儿免受母体免疫系统的攻击²。这些膜的炎症被称为绒毛膜羊膜炎。传统上，临床诊断绒毛膜羊膜炎需满足母体发热，并伴有至少一项胎儿或母体的临床表现^3,4。然而，尽管该定义在临床上具有实用性，但其缺乏精确性，使得绒毛膜羊膜炎的研究面临挑战。2015年，美国尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国立儿童健康与人类发育研究所（Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development）的一个专家小组通过研讨会，将绒毛膜羊膜炎定义为宫内炎症、感染或两者兼有（即“三I”：intrauterine inflammation, infection, or both）³。这一定义的澄清至关重要，因为虽然微生物引起的感染是子宫/羊膜炎症的重要原因，但其发生频率低于无菌性子....

方案

所有动物实验均经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（协议编号 #8041401）批准。所有动物均饲养于爱荷华大学经国际实验动物评估和认可委员会（AALAC）认证的动物实验设施中。所有小鼠均为野生型 C57Bl/6J 品系。

1. 在妊娠小鼠中建立母体炎症致胎儿暴露模型（FEMI）

1. LPS 制备
   1. 使用来自大肠杆菌的脂多糖（LPS） 大肠杆菌 O55:B5（储存浓度 2 mg/mL）。
   2. 将LPS储备液用无菌生理盐水按1:100稀释，得到20的使用浓度 µg/mL
2. 母体LPS注射
   1. 在妊娠第15天（e15）对怀孕母鼠进行注射。该时间点约为小鼠妊娠期的75%，在发育阶段上与人类妊娠的早期第三孕期相似，而大多数由绒毛膜羊膜炎引发的早产发生于这一时期。
   2. 注射前立即称量怀孕小鼠的体重，以确定适当的LPS剂量。
   3. 使用以下公式计算工作浓度的剂量：5 µL × 克体重（gbw），LPS 总剂量为 100 µg/kg。对于对照组动物，使用等体积的生理盐水进行注射。
   4. 每次注射前，将LPS溶液在高速下涡旋振荡三次，每次15秒。
   5. 用1 mL注射器抽取LPS体积。
   6. 用抓颈法固定怀孕小鼠，使其呈背卧位，然后进行注射....

结果

在胚胎发育第15天暴露于FEMI会导致剂量依赖性的妊娠丢失以及剂量依赖性的早产率（图1）⁴²。在实验中，我们选择使用100 µg/kg的LPS剂量，以尽量减少妊娠丢失和早产（早产与宫内胎儿死亡合计丢失率为50%），同时使胎儿暴露于显著的炎症刺激。

采用该方法，我们随后考察了母体炎症（FEMI）对子代后续损伤的影响。使用3分制组织学评分来评估总体肠道损伤程度，我们发现出生时（P0）以及成年期（P56或生后8周）均存在显著的肠道损伤（图2）。值得注意的是，这些动物除受到FEMI影响外，并未接受任何其他额外刺激，这表明FEMI本身即可破坏新生小鼠肠道的正常稳态。由于小鼠出生时肠道相对不成熟，并在出生后前4周内持续发育^47,48，这一现象与同样具有不成熟肠道的早产儿具有相关性。

讨论

绒毛膜羊膜炎影响2%–4%的足月分娩和25%–30%的早产分娩^8,9。然而，绒毛膜羊膜炎的影响可能持续至出生后很长时间，因其已被证实对胎儿和新生儿具有显著影响^{10,11,12,13,14,15,16}。尤为重要的是，绒毛膜羊膜炎已被证明与坏死性小肠结肠炎（NEC）的后续发生相关^15,16。尽管目前尚不完全清楚，NEC的发病机制可能涉及肠道发育不成熟.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10%中性缓冲甲醛	Sigma	HT501128
阿辛蓝染色	新进人员供应	1003A
C57Bl6/J 小鼠	杰克逊实验室	664
乙醇	Decon 实验室	2701
HCl	Sigma	H1758
苏木精染色	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO₃	Sigma	S6014
尼康Eclipse Ni-U显微镜	尼康	2CE-MQVJ-1
高碘酸	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	赛默飞世尔科技	Am7021
希夫试剂	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex 检测	Meso Scale Discovery (MSD)
二甲苯	Sigma	534056