一种用于研究急性绒毛膜羊膜炎对新生儿肠道发育影响的小鼠母体炎症致胎儿暴露模型

摘要

我们建立了一种绒毛膜羊膜炎模型，以模拟胎儿在无活体生物并发症的情况下暴露于母体炎症（FEMI）的环境，从而研究FEMI对子代肠道发育的影响。该模型可用于探讨绒毛膜羊膜炎后肠道损伤发生机制的相关病因。

摘要

绒毛膜羊膜炎是早产的常见诱因，且与早产相关的多种发病率密切相关，包括坏死性小肠结肠炎（NEC）。然而，这两种疾病之间的机制性联系尚未被阐明。我们采用了一种小鼠绒毛膜羊膜炎模型，该模型通过脂多糖（LPS）诱导母体炎症对胎儿的暴露（FEMI）。这种FEMI模型可引发无菌性的母体、胎盘及胎儿炎症级联反应，而这种反应在许多临床绒毛膜羊膜炎病例中同样存在。尽管已有使用活菌建立的模型，能更准确地模拟上行感染所致绒毛膜羊膜炎的病理生理过程，但这些方法可能对未成熟肠道及其伴随发育中的微生物组的发育产生间接影响。利用本方案，我们已证明LPS诱导的FEMI会导致妊娠丢失和早产呈剂量依赖性增加，并导致子代肠道正常发育的破坏。此外，我们还发现FEMI显著增加子代肠道损伤和血清细胞因子水平，同时减少杯状细胞和潘氏细胞的数量，而这两类细胞均在抵御肠道炎症的先天免疫中发挥第一道防线作用。尽管类似的LPS诱导FEMI模型已被用于研究绒毛膜羊膜炎与中枢神经系统后续异常之间的关联，但据我们所知，本方案是首个尝试阐明绒毛膜羊膜炎与后期肠道发育紊乱之间机制性联系的研究，从而为绒毛膜羊膜炎与NEC之间的关联提供潜在解释。

引言

绒毛膜在哺乳动物妊娠过程中发挥着至关重要的作用。它包括绒毛膜和羊膜，具有多种功能：包裹并保护胎儿，促进母体与胎儿隔室之间的旁分泌信号传递¹，并在绒毛膜内部形成局部反馈环路，这些环路可能参与启动分娩过程¹。目前对这些膜结构的认识表明，羊膜主要提供结构屏障功能，而绒毛膜则主要作为免疫缓冲层，保护发育中的胎儿免受母体免疫系统的攻击²。这些膜的炎症被称为绒毛膜羊膜炎。传统上，临床诊断绒毛膜羊膜炎需满足母体发热，并伴有至少一项胎儿或母体的临床表现^3,4。然而，尽管该定义在临床上具有实用性，但其缺乏精确性，使得绒毛膜羊膜炎的研究面临挑战。2015年，美国尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国立儿童健康与人类发育研究所（Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development）的一个专家小组通过研讨会，将绒毛膜羊膜炎定义为宫内炎症、感染或两者兼有（即“三I”：intrauterine inflammation, infection, or both）³。这一定义的澄清至关重要，因为虽然微生物引起的感染是子宫/羊膜炎症的重要原因，但其发生频率低于无菌性子宫/羊膜炎症^5,6,7。总体而言，绒毛膜羊膜炎仍是一个重要的公共卫生问题，在足月分娩中发生率为2‒4%，在早产分娩中发生率高达25‒30%^8,9。

绒毛膜羊膜炎可对胎儿和新生儿产生显著影响。文献中已有充分记载，绒毛膜羊膜炎与早产相关多种发病率风险升高有关，包括支气管肺发育不良¹⁰，脑白质损伤¹¹脑室内出血¹²早产儿视网膜病变¹³，以及疑似和确诊的早发性新生儿败血症^14,15由于我们关注的是未成熟肠道的损伤与修复机制，值得注意的是，绒毛膜羊膜炎还与早产儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）的后续发生相关。^15,16坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种早产儿严重的胃肠道疾病，可导致机体对炎症产生异常的免疫反应，并继发肠组织坏死。¹⁷每年，美国有超过4000名婴儿受到坏死性小肠结肠炎（NEC）的影响，其中多达三分之一的患儿死于该疾病。¹⁸新生儿坏死性小肠结肠炎的发病机制可能涉及肠道发育不成熟、未成熟免疫系统的调节失调、肠道炎症以及细菌移位等多种因素的共同作用¹⁹，最终导致肠道坏死的共同通路。值得注意的是，坏死性小肠结肠炎（NEC）的发病常出现在出生后数周，且存在宫内绒毛膜羊膜炎暴露史，因此绒毛膜羊膜炎与后续NEC发生之间的机制联系尚不明确²⁰绒毛膜羊膜炎可能通过激活母体免疫系统，进而引发强烈的胎儿炎症反应，从而干扰胎儿正常的发育模式，这可能是其参与坏死性小肠结肠炎病理生理过程的一种潜在机制。^21,22,23.

已有多种哺乳动物的绒毛膜羊膜炎模型，包括啮齿类动物和绵羊模型^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}。然而，关于绒毛膜羊膜炎所致母体炎症胎儿暴露（FEMI）后，肠道在新生儿早期之后的发育情况，相关数据仍十分有限。为了探究FEMI与未成熟肠道后续损伤发展之间的关系，我们采用了脂多糖（LPS）诱导的FEMI模型。脂多糖是革兰氏阴性菌胞外表面的主要成分，可强烈激活包括人类在内的多种真核生物的先天免疫系统³³。母体注射LPS可引发无菌性炎症级联反应，避免了活菌带来的混杂效应，该模型已被广泛用于早产诱导研究³⁴，同时也是急性绒毛膜羊膜炎及胎儿炎症反应综合征（FIRS）的成熟模型，而FIRS是绒毛膜羊膜炎最严重的形式^24,35。已有研究证实，该模型可在绵羊模型中引起脑白质和灰质损伤³⁶，并在小鼠模型中产生类似效应^37,38,39,40。据我们所知，我们是首个利用该绒毛膜羊膜炎及FEMI模型，研究其对出生后胃肠道发育影响的研究团队，同时也是首个探索绒毛膜羊膜炎与坏死性小肠结肠炎（NEC）后期发生之间潜在机制联系的研究^41,42。

方案

所有动物实验均经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（协议编号 #8041401）批准。所有动物均饲养于爱荷华大学经国际实验动物评估和认可委员会（AALAC）认证的动物实验设施中。所有小鼠均为野生型 C57Bl/6J 品系。

1. 在妊娠小鼠中建立母体炎症致胎儿暴露模型（FEMI）

1. LPS 制备
   1. 使用来自大肠杆菌的脂多糖（LPS） 大肠杆菌 O55:B5（储存浓度 2 mg/mL）。
   2. 将LPS储备液用无菌生理盐水按1:100稀释，得到20的使用浓度 µg/mL
2. 母体LPS注射
   1. 在妊娠第15天（e15）对怀孕母鼠进行注射。该时间点约为小鼠妊娠期的75%，在发育阶段上与人类妊娠的早期第三孕期相似，而大多数由绒毛膜羊膜炎引发的早产发生于这一时期。
   2. 注射前立即称量怀孕小鼠的体重，以确定适当的LPS剂量。
   3. 使用以下公式计算工作浓度的剂量：5 µL × 克体重（gbw），LPS 总剂量为 100 µg/kg。对于对照组动物，使用等体积的生理盐水进行注射。
   4. 每次注射前，将LPS溶液在高速下涡旋振荡三次，每次15秒。
   5. 用1 mL注射器抽取LPS体积。
   6. 用抓颈法固定怀孕小鼠，使其呈背卧位，然后进行注射。
      1. 将30号8 mm针头斜面向上插入腹部右下象限（以避开膀胱和腹腔血管），角度为30‒40° 角度。插入约 ¼ 至 ½ 针的长度。
      2. 回拉注射器活塞，以确保注射前存在负压。若存在负压，则进行注射。
      3. 注射后，观察小鼠约30分钟，随后将其放回笼中继续妊娠。

2. 后代的分娩与护理，以及肠道组织采集

1. 在妊娠第20天（e20）通过阴道分娩正常产下仔鼠。
   注意：该模型存在预期的剂量依赖性胎儿丢失率，如图1所示，并在下文结果部分中讨论。
2. 让仔鼠留在母鼠身边，自由进食。
3. 在取材当天（通常为出生后第14天，P14），根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规程，通过颈椎脱位法对仔鼠实施安乐死。
4. 使用剪刀和镊子，沿腹中线自上而下切开皮肤和腹膜，切口贯穿整个腹部。用剪刀将小肠从胃部至盲肠处完整剪下，并用镊子去除肠系膜。 
5. 分离并保留小肠远端的1/3部分（相当于人类回肠的区域），弃去近端小肠、盲肠和结肠。
6. 用剪刀将回肠部分均分为两半。
7. 将近端一半放入RNA稳定保存液中，用于后续RNA定量分析。
8. 将远端一半放入10%中性缓冲福尔马林溶液中，用于制片。

3. 肠道损伤评分

1. 将石蜡包埋的组织切片至5 µm厚度，并贴附于玻璃载玻片上。
   
   注：我们将样本送至组织学核心实验室进行石蜡包埋、切片及贴片。
2. 根据标准操作程序对载玻片进行脱蜡。
3. 根据标准操作程序对切片进行苏木精-伊红染色。
4. 按照先前描述的方法^42,43，采用3分制对切片的肠道损伤程度进行评分。
   1. 使用光学显微镜，由两名独立且不知分组情况的研究人员在20倍放大、数值孔径0.50条件下，依据绒毛完整性及其与基底膜分离情况，按3分制评估总体肠道损伤程度⁴³（补充图1）。
   2. 评分为0分表示黏膜正常。
   3. 评分为1分表示轻度损伤，表现为上皮下Gruenhagen间隙形成、空泡化或局限于固有层或绒毛顶端的上皮下抬升。
   4. 评分为2分表示重度损伤，表现为超过一半绒毛区域的上皮抬升和空泡化、绒毛结构扭曲，或黏膜溃疡及固有层崩解。

4. 潘氏细胞和杯状细胞的定量分析

1. 脱蜡后，按照以下步骤，对第2.8步获得的组织切片进行阿利新蓝-过碘酸雪夫（Alcian Blue/Periodic Acid Schiff）染色，以标记杯状细胞和潘氏细胞^44,45。
   注意：尽管阿利新蓝-过碘酸雪夫染色对潘氏细胞或杯状细胞均无特异性，但根据我们的经验，经盲法评估的资深研究人员使用该染色方法进行细胞定量的结果与使用特异性靶向抗体的结果相当，且背景染色显著更少⁴⁶。
2. 按以下步骤进行脱蜡、染色和脱水。
   1. 将切片浸入二甲苯中，每次10分钟，重复两次。
      注意：二甲苯应在通风橱中使用。
   2. 用100%乙醇（EtOH）冲洗。
   3. 将切片依次浸入100%乙醇中3分钟、90%乙醇中3分钟、70%乙醇中3分钟，最后浸入50%乙醇中3分钟。
   4. 在流动的自来水下冲洗5分钟。
      注意：冲洗时应使组织切片面避开水流，以防组织样本脱落。
   5. 使用标准咖啡滤纸过滤阿利新蓝染液。
   6. 将切片置于阿利新蓝染液中染色15分钟，然后在流动的自来水下冲洗2分钟。
   7. 将1 mg过碘酸溶于200 mL双蒸水中，将切片浸入该溶液中5分钟，随后在流动的自来水下冲洗1分钟。
   8. 用雪夫试剂（Schiff’s reagent）染色10分钟，在流动的自来水下冲洗5分钟。
   9. 用苏木精染色1分钟，然后在流动的自来水下冲洗2分钟。
   10. 将切片浸入酸性酒精（1 mL盐酸与99 mL 70%乙醇混合）中1分钟。
   11. 将切片浸入Scott氏自来水（自来水含0.1% NaHCO₃）中1分钟，然后在流动的自来水下冲洗1分钟。
   12. 脱水切片。
       1. 将每张切片在70%乙醇中浸蘸10次，然后在90%乙醇中浸蘸10次，在100%乙醇中浸蘸10次。
       2. 将切片浸入100%乙醇中10分钟，随后在新鲜二甲苯中浸入两次，每次3分钟。
   13. 在样本上滴加一滴封片介质，并盖上盖玻片。
3. 杯状细胞计数
   1. 使用光学显微镜计数杯状细胞（补充图2）。对每一块肠组织，计数杯状细胞数量及500个上皮细胞，将杯状细胞比例表示为每100个上皮细胞中的数量。杯状细胞的最佳计数条件为20倍放大倍数和0.5数值孔径。
4. 潘氏细胞计数
   1. 使用光学显微镜计数潘氏细胞（补充图2）。对每一块肠组织，以每条肠隐窝中潘氏细胞的数量表示比例。每块肠组织计数100条肠隐窝。潘氏细胞的最佳计数条件为20倍至60倍放大倍数和0.50至1.30数值孔径。

结果

在胚胎发育第15天暴露于FEMI会导致剂量依赖性的妊娠丢失以及剂量依赖性的早产率（图1）⁴²。在实验中，我们选择使用100 µg/kg的LPS剂量，以尽量减少妊娠丢失和早产（早产与宫内胎儿死亡合计丢失率为50%），同时使胎儿暴露于显著的炎症刺激。

采用该方法，我们随后考察了母体炎症（FEMI）对子代后续损伤的影响。使用3分制组织学评分来评估总体肠道损伤程度，我们发现出生时（P0）以及成年期（P56或生后8周）均存在显著的肠道损伤（图2）。值得注意的是，这些动物除受到FEMI影响外，并未接受任何其他额外刺激，这表明FEMI本身即可破坏新生小鼠肠道的正常稳态。由于小鼠出生时肠道相对不成熟，并在出生后前4周内持续发育^47,48，这一现象与同样具有不成熟肠道的早产儿具有相关性。

讨论

绒毛膜羊膜炎影响2%–4%的足月分娩和25%–30%的早产分娩^8,9。然而，绒毛膜羊膜炎的影响可能持续至出生后很长时间，因其已被证实对胎儿和新生儿具有显著影响^{10,11,12,13,14,15,16}。尤为重要的是，绒毛膜羊膜炎已被证明与坏死性小肠结肠炎（NEC）的后续发生相关^15,16。尽管目前尚不完全清楚，NEC的发病机制可能涉及肠道发育不成熟...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10%中性缓冲甲醛	Sigma	HT501128
阿辛蓝染色	新进人员供应	1003A
C57Bl6/J 小鼠	杰克逊实验室	664
乙醇	Decon 实验室	2701
HCl	Sigma	H1758
苏木精染色	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO₃	Sigma	S6014
尼康Eclipse Ni-U显微镜	尼康	2CE-MQVJ-1
高碘酸	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	赛默飞世尔科技	Am7021
希夫试剂	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex 检测	Meso Scale Discovery (MSD)
二甲苯	Sigma	534056