本文介绍了一种用于测量从外周血中分离的人原代自然杀伤（NK）细胞在静息状态或经IL15诱导激活后糖酵解和线粒体呼吸的方法。所述方案可轻松扩展应用于其他细胞因子或可溶性刺激物激活的人原代NK细胞。
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本文内容
摘要
摘要
自然杀伤细胞（NK细胞）主要介导先天性抗肿瘤和抗病毒免疫应答，能够响应多种细胞因子及其他刺激，促进细胞存活、增殖、分泌干扰素γ（IFNγ）等细胞因子以及执行细胞毒功能。细胞因子刺激激活NK细胞需要对其代谢通路进行显著重塑，以满足其生物能量和生物合成需求。大量证据表明，NK细胞代谢功能受损与包括肥胖和癌症在内的多种慢性疾病相关，这凸显了建立一种检测NK细胞代谢方法的临床重要性。本文描述了使用细胞外通量分析仪的方法，该平台可实时测定糖酵解和线粒体耗氧量，用于监测人NK细胞能量代谢的变化。本文所述方法还可用于监测NK细胞经IL-15等细胞因子刺激后发生的代谢改变，而IL-15目前正被广泛应用于多项临床试验的研究体系中。
引言
自然杀伤细胞（NK细胞）是一类先天性淋巴细胞，可介导抗肿瘤和抗病毒反应。NK细胞占人类外周血中所有淋巴细胞的5%-15%，也可存在于脾脏、肝脏、骨髓和淋巴结中。NK细胞不表达多态性克隆型受体，如T细胞受体（TCR）或B细胞受体（BCR）。相反，其细胞毒功能的激活是由识别靶细胞表面不变配体的受体结合所触发的1,2。
从外周血中分离的静息态人自然杀伤（NK）细胞在添加了人血清的培养基中可存活数天。通过白细胞介素-15（IL-15）或白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子激活NK细胞，可促进其增殖并增强其杀伤能力，此外还产生其他效应3,4,5。多项研究表明，NK细胞的活化与其代谢活性的变化之间存在直接相关性6。这些代谢变化旨在满足细胞在能量和生物合成方面的特定需求。
需氧细胞和生物体通过一系列化学反应获取能量，这些反应涉及碳水化合物、脂肪和蛋白质的分解代谢与氧化。通过糖酵解、三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化的联合作用，真核细胞满足了其大部分ATP需求，并获得作为大分子合成前体所必需的中间产物，以支持细胞生长与增殖。糖酵解过程（图1A）始于葡萄糖进入细胞。在细胞质中，葡萄糖被磷酸化并转化为丙酮酸（每分子葡萄糖净生成2分子ATP），丙酮酸可被还原为乳酸，或被转运至线粒体中转化为乙酰辅酶A，进而进入TCA循环。TCA循环持续进行，不断接受新的乙酰辅酶A分子作为燃料，产生CO2（最终会扩散出细胞，并在培养基中与H2O反应生成碳酸，导致培养基酸化）以及NADH，后者负责向电子传递链（ETC）提供电子。电子依次经过不同的蛋白质复合物，最终由氧气接受。这些复合物（I、III和IV）同时将H+从线粒体基质泵入膜间隙。由于形成了电化学梯度，H+将通过复合物V（ATP合酶）重新进入基质，利用所积累的势能驱动ATP的生成。
糖酵解和线粒体呼吸均可通过使用抑制剂在不同位点被阻断。对这些抑制剂的了解和应用是开发细胞外通量分析法的基础。通过实时测量pH和氧气浓度这两个简单参数，细胞外通量分析仪可推断出96孔板中细胞的糖酵解速率和线粒体呼吸速率。糖酵解应激测试在不含葡萄糖的基础培养基中进行（图1B)7. 细胞外酸化率（ECAR）的初始测量值反映的是糖酵解非依赖性酸化，称为非糖酵解性酸化，与CO2 由三羧酸循环（TCA）产生的物质，如前所述，会与H结合2O 在培养基中生成 H+ （与三羧酸循环偶联的细胞外酸化率，TCA-linked ECAR）。第一次注射葡萄糖，以诱导葡萄糖利用并促进糖酵解。第二次注射同时加入复合体I抑制剂鱼藤酮（rotenone）和复合体III抑制剂抗霉素A（antimycin A），以阻断电子传递链（ETC）。细胞因线粒体ATP生成急剧下降而激活糖酵解，以维持细胞内ATP水平；该反应代表了在基础状态下未被利用、但在ATP需求增加时可被动员的糖酵解能力（代偿性糖酵解）。第三次注射为葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖（2-Deoxyglucose, 2-DG），其可与葡萄糖竞争己糖激酶的底物结合位点。该磷酸化反应的产物2-脱氧葡萄糖-6-磷酸无法进一步转化为丙酮酸，从而阻断糖酵解途径，使ECAR降至最低水平。此时测得的ECAR还包括非糖酵解及非呼吸活动所致的其他细胞外酸化来源，以及2-DG未能完全抑制的残余糖酵解活性（2-DG后酸化，post 2-DG-acidification）。
线粒体应激测试在含有葡萄糖的培养基中进行（图1C）8。首次测量的氧消耗率（OCR）对应于线粒体呼吸的基础水平（基础呼吸）。第一次注射的试剂为寡霉素，其可抑制质子通过ATP合酶（复合物V）回流，从而阻断ATP合成，迅速导致线粒体膜超极化，进而阻止呼吸链复合物进一步泵送质子，最终引起OCR下降。基础呼吸与加入寡霉素后的OCR值之间的差值，代表与ATP合成相关的呼吸。剩余的对寡霉素不敏感的氧消耗速率称为质子泄漏，反映了质子通过线粒体内膜脂双层或如腺苷酸转位酶等膜蛋白的流动9。第二次注射的试剂为解偶联剂2,4-二硝基苯酚（DNP），它是一种离子载体，可诱导大量H+进入线粒体基质，导致线粒体膜去极化并破坏线粒体ATP合成。细胞为应对质子驱动力的消散，会加速电子传递和氧消耗，达到最大速率，以无效的方式试图恢复膜电位（即最大呼吸能力）。最大呼吸能力与基础呼吸之间的差值即为细胞的备用呼吸能力，代表在基础状态下未用于ATP生成的呼吸潜能，可在ATP需求增加或处于应激条件下被动员利用8。第三次注射为鱼藤酮与抗霉素A的混合物。该注射可完全抑制电子传递链（ETC），使OCR降至最低水平，此时残余的氧消耗为非线粒体来源（如由NADPH氧化酶等引起）。
代谢通路的变化可能在某种程度上预测自然杀伤（NK）细胞的功能，已有研究表明，在体外通过不同代谢通路持续使用细胞因子激活NK细胞可能导致NK细胞耗竭10,11。从癌症免疫治疗的角度来看，NK细胞的代谢状态与其功能之间的关联极为重要。在该领域中，已尝试单独或联合使用单克隆治疗性抗体输注白细胞介素-15（IL-15）来激活NK细胞，以增强对肿瘤细胞的杀伤作用12,13,14。了解NK细胞在这些治疗策略下的代谢状态，将为NK细胞的活化水平和杀伤功能提供有价值的预测指标。
关于单核细胞、T细胞和B细胞等其他髓系和淋巴细胞中代谢通路的研究已有描述15，并已有优化的方法发表16。在本实验方案中，我们提供了一种结合了自然杀伤（NK）细胞分离的方法，可获得大量高纯度且具有活性的NK细胞，同时结合使用细胞外通量分析仪检测代谢活性的优化方案。本文表明，该方法可用于研究静息状态及IL-15激活的人NK细胞中的代谢变化。对于细胞外通量检测，已对细胞数量、药物浓度等参数进行了测试和优化。与其他呼吸测定方法相比，细胞外通量分析仪实现了完全自动化，能够实时检测，仅需极少量细胞即可同时检测多达92个样本，从而可在相对较短时间内实现高通量筛选（含多个样本及重复）17。
该方法可用于通过研究自然杀伤细胞代谢来评估自然杀伤细胞功能的研究人员。该方法也可应用于由其他细胞因子、抗体或可溶性刺激物激活的细胞。
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方案
所有实验均遵循《赫尔辛基宣言》中医学研究的伦理原则进行。供体外周血样本由美国国立卫生研究院输血医学科根据经机构审查委员会批准的99-CC-0168号方案获取，并取得患者的书面知情同意。
1. 试剂准备
- NK细胞分离试剂
注意事项：在细胞培养罩内配制以下试剂。- 配制NK细胞分离缓冲液：在PBS（pH 7.4）中添加1 mM EDTA和2%已灭活的胎牛血清（FCS）（于56 °C加热30分钟灭活）。
- 配制NK细胞培养基：在Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）中添加10%人血清（HS）。经无菌过滤后，于2–8 °C保存。使用前将培养基预热至37 °C。
- 用PBS将人IL-15溶解至200 µg/mL。
- 胞外通量检测试剂
- 配制检测用培养基：线粒体应激检测培养基，在基础培养基中加入1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺和10 mM葡萄糖；糖酵解应激检测培养基，在基础培养基中加入2 mM L-谷氨酰胺。
注意：葡萄糖、丙酮酸和谷氨酰胺的浓度依据胞外通量分析仪制造商的推荐设定。但研究人员可根据需要调整培养基成分，以完全匹配细胞培养基的组成。 - 使用台式pH计，以0.1 N NaOH将两种培养基的pH值调节至7.4，经0.2 µM孔径滤膜无菌过滤后，于2–8 °C保存。使用前将培养基预热至37 °C，检查pH值，必要时重新调节至7.4。
注意：胞外通量分析仪内部气氛仅含环境CO2，因此必须使用不含碳酸氢盐的培养基。 - 配制试剂储备液：寡霉素（ATP合酶抑制剂），用DMSO配制成10 mM储备液；2,4-二硝基苯酚（DNP，解偶联剂），用DMSO配制成1 M储备液；抗霉素A（复合物III抑制剂），用DMSO配制成10 mM储备液；鱼藤酮（复合物I抑制剂），用DMSO配制成10 mM储备液。将所有试剂分装为30 µL每份，于-20 °C保存。
注意：本指南适用于研究人员自行购买并配制的试剂。若试剂购自分析仪制造商，请遵循其提供的试剂配制说明。
- 配制检测用培养基：线粒体应激检测培养基，在基础培养基中加入1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺和10 mM葡萄糖；糖酵解应激检测培养基，在基础培养基中加入2 mM L-谷氨酰胺。
2. 从外周血中分离NK细胞
- 从人血液中制备外周血单个核细胞（PBMCs）
注意：所有步骤均需在细胞培养罩内进行。所有接触血液的残留物和材料均需用漂白剂去污染，并丢弃至指定容器中进行焚烧处理。- 将20 mL淋巴细胞分离液（LSM）移入50 mL锥形管中。
- 将锥形管保持在30˚倾斜角度，小心地沿管壁缓慢加入20 mL血液，使其轻柔地覆盖在LSM液面上方。避免血液与LSM混合，形成清晰且界限分明的两相界面。
注意：可使用外周血或富集的白细胞分离产物。 - 将离心管在室温下以1000 x g离心25分钟。请勿使用刹车功能，以免导致管内两相（LSM与血液）混合。
- 小心地从离心机中取出离心管并置于试管架中。观察是否存在明显的细胞层（单个核细胞），该细胞层位于LSM（透明）与血浆（黄色）之间的界面上，而红细胞则沉淀于管底。
- 用10 mL塑料移液管小心吸取单个核细胞层（约5–8 mL），转移至新的50 mL锥形管中。最多可将两个不同离心管中的淋巴细胞界面合并。
- 用45 mL PBS重悬细胞，以800 x g在室温下离心5分钟，洗涤细胞两次。
注意：此步骤完成后，即可获得外周血单个核细胞（PBMCs）沉淀，研究人员可继续进行NK细胞分离步骤。
- 从PBMCs中分离NK细胞
- 对步骤2.1.6所得细胞进行计数，并将其重悬于NK分离缓冲液中（1×108 PBMCs/mL）。
- 取10 mL细胞悬液（含109 PBMCs）转移至50 mL离心管中。
- 向PBMCs中加入500 µL（50 µL/mL缓冲液）NK细胞分离抗体混合物，以及10 µL（1 µL/mL缓冲液）抗CD3阳性分离抗体混合物，在室温下孵育10分钟。
- 涡旋混匀磁珠后，向PBMCs与抗体的混合物中加入1 mL磁珠（每毫升PBMCs悬液加100 µL磁珠），在室温下孵育10分钟，期间偶尔轻轻搅拌。
- 加入35 mL NK分离缓冲液（每毫升PBMCs加3.5 mL缓冲液），混匀后置于磁架上静置15分钟（2.2×107 PBMCs/mL）。孵育结束后，被磁珠标记的阳性选择细胞（除NK细胞外的所有细胞）将吸附于管壁。
- 用50 mL塑料移液管小心吸取上清液（含NK细胞），避免触碰管壁或管底。
- 使用细胞计数仪对细胞进行计数，并以800 x g离心5分钟。
- 将分离得到的NK细胞以5×106个细胞/mL的密度重悬于含10%人血清（HS）的IMDM培养基中，置于37 ˚C、5% CO2的培养箱中，直至进行实验。
注意：本NK细胞分离方案中的细胞数量和试剂体积适用于50 mL离心管和大型磁架。若获得的PBMCs数量更多，可通过在不同离心管中重复操作进行放大；也可通过减少体积进行缩小。最终体积为14–45 mL时使用50 mL聚苯乙烯管，体积为4–14 mL时使用15 mL聚苯乙烯管，体积为1–4 mL时使用5 mL聚苯乙烯管。磁架需与相应规格的离心管匹配。抗体混合物和磁珠的用量也可根据细胞数量和最终体积按比例调整。
- NK细胞群体的流式细胞术染色
- 从步骤2.2.8中取每样本0.25×106个细胞，在室温下以800 x g离心5分钟去除培养基，将细胞沉淀重悬于500 µL PBS中。
- 根据制造商推荐加入活率染料（每1 mL细胞悬液中加入1 µL DMSO重悬的染料），在室温下避光孵育30分钟。
- 用5 mL PBS重悬细胞，以800 x g在室温下离心5分钟，洗涤两次。
- 在含10% HS的100 µL IMDM中加入相应的抗人抗体，冰上避光染色30分钟（参见表1）。所有抗体可混合后在单一步骤中完成染色。
- 通过流式细胞术分析样本，评估所获得NK细胞群体的纯度。采用已报道的细胞门控与分析方法18,19。
- 用可溶性IL-15刺激NK细胞
- 将步骤2.2.8或2.4.3中获得的0.75×106个细胞重悬于含10% HS的100 µL IMDM中，加入96孔板（圆底）的一个孔中。
- 将人IL-15用含10% HS的IMDM稀释至1 µg/mL，向细胞中加入100 µL稀释后的IL-15，使终浓度为0.5 µg/mL。
注意：0.5 µg/mL为IL-15的饱和浓度。研究人员可根据需要测试更低浓度的IL-15，或其他细胞因子如IL-2、IL-12或IL-18。 - 将细胞置于37 °C培养箱中孵育48小时，之后进行胞外通量分析。将未刺激（对照）组细胞以相同浓度和体积重悬于含10% HS的IMDM中（不加IL-15），置于相同培养箱中孵育48小时。
3. 传感器盒的水合
注意：传感器盒的96个探针尖端含有用于检测 O2 和 H+ 的独立固态荧光染料，需经水合处理后才能检测 O2 和 pH 的变化。
- 开启分析仪并预热至 37 °C。
- 打开传感器盒包装，将传感器盒从工具板上分离。在工具板的每个孔中加入 200 µL 校准液，并将传感器盒重新放回板上，确保传感器完全浸没在溶液中。为获得最佳效果，将传感器盒置于 37 °C、无 CO2 且适当加湿以防止蒸发的培养箱中过夜孵育。在水合过程中避免传感器下方产生气泡。
注意：传感器盒的最短水合时间为 37 °C 无 CO2 培养箱中孵育 4 小时。或者，也可先在 37 °C 无 CO2 培养箱中用 200 µL 无菌水对传感器盒过夜水合，然后在实验开始前 45–60 分钟，用 200 µL 预热的校准液孵育传感器盒。
4. 细胞外通量检测
- 粘附剂包被板的制备
注意：由于代谢参数的测量是在96孔检测板底部形成的微室中进行，悬浮细胞必须首先黏附于孔底。本实验采用从贻贝Mytilus edulis中提取的细胞粘附剂。粘附剂生产商推荐的包被浓度为1至5 µg/cm2。分析仪细胞培养微孔板的每孔表面积约为0.110 cm2。因此，对于5 µg/cm2的浓度，每孔约需0.55 µg粘附剂。由于每孔将使用25 µL粘附剂溶液进行包被，故分析仪细胞培养微孔板的最佳粘附剂溶液浓度约为22.4 µg/mL（22.4 µg/mL × 0.025 mL = 0.56 µg）。- 在0.1 M碳酸氢钠（pH 8.0）中配制2.5 mL细胞粘附剂溶液（22.4 µg/mL）。碳酸氢盐可提供细胞粘附性能的最佳pH值，根据生产商说明，该pH范围为6.5至8.0。
- 向每孔加入25 µL细胞粘附剂溶液，室温孵育20分钟。随后吸除溶液，并用200 µL无菌水/孔洗涤两次。将板敞口置于细胞培养超净台内15分钟，使孔干燥。
注意：包被后的板可在4 °C保存最多1周。
- 在粘附剂包被板中接种细胞
- 将步骤2.4.3 中的细胞在室温下以200 x g离心5分钟。弃去上清液，并用预热的线粒体应激测试培养基（若进行线粒体应激测试）或糖酵解应激测试培养基（若进行糖酵解应激测试）洗涤细胞。再次离心收集细胞沉淀，并用相同培养基重悬至所需细胞浓度（重悬体积取决于所选细胞浓度；由于每孔将含有180 µL细胞悬液，因此需分别配制0.26 × 106、0.52 × 106、1.04 × 106、2.08 × 106、4.17 × 106和8.33 × 106个细胞/mL的细胞悬液，以实现每孔分别含有0.047 × 106、0.094 × 106、0.187 × 106、0.375 × 106、0.75 × 106和1.5 × 106个细胞）。
- 沿每孔侧壁加入180 µL细胞悬液。建议使用多通道移液器。将分析仪培养板的A1、A12、H1和H12孔作为背景校正对照孔，在这些孔中加入180 µL检测培养基（不含细胞）。如需要且板上有足够空间，可增设其他对照孔。
注意：血清的存在可能导致细胞贴附不良。 - 将板置于无CO2培养箱中，37 °C孵育30分钟。在此期间配制10倍浓度的化合物溶液（见下文步骤4.3）。
- 将离心机设置为无刹车模式。以200 x g离心5分钟。在显微镜下观察细胞，确认其在孔底形成单层。将板放回无CO2培养箱中继续孵育25分钟。为获得最佳结果，接种后总时间不应超过约1小时。
- 配制10倍工作液并加载至传感器微孔板
注意：传感器微孔板的96个探针尖端各包含4个加样口（A、B、C和D），可用于将化合物依次注入各个孔中。- 进行线粒体应激测试时，在线粒体应激检测培养基中分别配制2.5 mL的10 µM寡霉素、1 mM DNP，以及10 µM鱼藤酮与10 µM抗霉素A的混合液（使用步骤1.2.3中的储备液）。注射后孔内终浓度分别为1 µM寡霉素、0.1 mM DNP和1 µM抗霉素A/鱼藤酮。
- 进行糖酵解应激测试时，在糖酵解应激检测培养基中配制2.5 mL的10 µM鱼藤酮与10 µM抗霉素A的混合液（使用步骤1.2.3中的储备液）。将葡萄糖溶解于糖酵解应激测试培养基中配制成100 mM溶液，将2-脱氧葡萄糖（2-DG）溶解于糖酵解应激测试培养基中配制成500 mM溶液。注射后孔内终浓度分别为10 mM葡萄糖、1 µM抗霉素A/鱼藤酮和50 mM 2-DG。
- 将上述溶液预热至37 °C，检测pH值并根据需要调整至7.4。使用多通道微量移液器及微孔板附带的加样口引导装置，将步骤4.3.1（用于线粒体应激测试）或4.3.2（用于糖酵解应激测试）中配制的化合物加入已水化的传感器微孔板（来自步骤3.2）的A、B和C加样口，具体见表2。
注意：为确保检测过程中所有孔均能正确注射，每个使用的加样口系列（例如所有A口）在整个传感器微孔板上必须保持相同的注射体积。此要求适用于背景校正孔，甚至包括实验中未使用的孔。 - 将加载完成的传感器微孔板置于无CO2培养箱中37 °C孵育，同时设置检测程序。
- 建立细胞外通量检测方案
- 打开细胞外通量分析仪软件，使用分组定义和板图标签页，标明具有相似条件的孔组（例如相同细胞数量的孔，或静息细胞与IL-15刺激细胞的孔）。同时标明背景校正孔（默认为A1、A12、H1和H12，但也可使用其他孔）以及空孔。
- 使用方案标签页，在软件中设置表3所述的程序。
- 使用运行检测标签页启动程序。将已水化并加载了10倍浓度化合物的传感器微孔板和辅助板放置于仪器托盘上。完成校准步骤（15–20分钟）后，根据提示将校准板更换为带有贴壁细胞的检测板（无需盖盖）。此后检测过程完全自动化（仪器将自动完成所有测量和注射操作）。
注意：只要将特定化合物加载至正确的加样口（在线粒体应激测试孔中，寡霉素、DNP和抗霉素/鱼藤酮分别加入A、B、C口；在糖酵解应激测试孔中，葡萄糖、抗霉素/鱼藤酮和2-DG分别加入A、B、C口），各加样口系列的注射体积保持一致，并通过软件的分组定义和板图标签页正确标识各测试孔，则可在同一块板上同时进行线粒体应激测试和糖酵解应激测试。 - 检测完成后，提取数据并使用软件进行分析。
5. 细胞数量测定
注意：可对结果进行归一化处理，以校正细胞数量可能存在的差异。以下描述了两种主要方法。
- DNA含量测定
- 用移液器从每个孔中移除剩余的检测培养基。吸取培养基时，注意不要扰动细胞。分析前，可将培养板保存在-20 °C条件下。
注意：冷冻步骤对有效裂解细胞和测定DNA含量至关重要。 - 用去离子水将细胞增殖检测试剂盒中的细胞裂解缓冲液（20x）稀释成1x溶液（200 µL/孔）。
- 将细胞增殖检测试剂盒中的染料原液（400x）加入1x细胞裂解缓冲液中。若每孔细胞数为50至50,000，使用1x浓度的细胞增殖检测试剂染料；若细胞数量更高，建议使用高于1x的终浓度。在此情况下，应使用5x终浓度的细胞增殖检测试剂染料（将染料原液用1x裂解缓冲液稀释80倍）。
- 向每孔加入200 µL细胞增殖检测试剂。室温孵育2–5分钟，并避光保存。
- 使用荧光酶标仪按照制造商推荐条件检测样品荧光，激发波长：480 nm；发射波长：520 nm。
- 用移液器从每个孔中移除剩余的检测培养基。吸取培养基时，注意不要扰动细胞。分析前，可将培养板保存在-20 °C条件下。
- 蛋白质含量测定
- 小心地完全吸除每孔中的检测培养基，避免接触细胞，并将细胞在-20 ˚C条件下冷冻至少1小时。或者，细胞可在分析前长期冷冻保存（最长1周） 。
- 向每孔加入50 µL含1x蛋白酶抑制剂（来自100x原液）的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液。将培养板置于摇床上，室温震荡5分钟，然后冰上孵育30分钟，以实现完全细胞裂解。
- 室温下以200 x g离心5分钟。此步骤可沉淀细胞碎片，避免干扰后续蛋白质浓度测定。
- 根据制造商推荐方法，采用双辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。
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结果
从外周血中分离自然杀伤细胞可获得纯净且具有活性的细胞群体
细胞外通量检测基于对孔内H+和O2浓度的测量，无法区分不同的细胞群体或其活性状态。因此，获得高纯度且具有活性的靶细胞群体是此类实验成功的关键步骤。
按照第2节所述方法从外周血中分离NK细胞。为评估所获得NK细胞的纯度和活力，取少量PBMCs和分离的NK细胞群体进行染色，并通过流式细胞术分析（图2A）。在前向散射（FSC-A）与侧向散射面积（SSC-A）的散点图中圈选单个核细胞群体。在此群体中，根据FSC-A与前向散射高度（FSC-H）散点图中沿对角线分布的单细胞进行圈选。在单细胞群体中评估细胞活力，在PBMCs和NK细胞群体中均高于98%。通过针对CD3（T细胞标志物，PBMCs中的主要细胞群）以及CD56或NKp46的双重染色确定分离NK细胞群体的纯度（图2B）。NK细胞定...
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讨论
本文建立了一种高效分离和培养来自外周血的纯度高、活性好的原代人自然杀伤（NK）细胞的实验方案。我们还优化了利用细胞外通量分析仪测定这些NK细胞代谢活性的条件，该活性通过氧消耗率和细胞外酸化率进行评估。与其他呼吸测定方法相比，细胞外通量分析仪检测速度快、所需细胞数量少，并可实现高通量筛选。然而，该方法的试剂成本较高，且最多只能进行四次化合物注射。细胞因子诱导的NK细胞代谢重塑以及糖酵解和氧化磷酸化的激活，对于产生强效的NK细胞应答至关重要21，而本文所述技术可实现实时监测NK细胞的代谢特征。本方案可进一步拓展至由其他细胞因子（如IL-2、IL-12和IL-18）或结合激活受体的抗体所激活的细胞。我们特别强调了一些常被忽视的关键步骤，例如将细胞以最佳密度接种，或使用最佳浓度的解偶联剂以刺激最大氧消耗。尽管如此，若对细胞施加除IL-15以外的其他刺激物，我们仍建议检查实际的O2水平曲线（图3C），以确保微孔中的O2未被耗尽。若出现耗尽情况，应减少细胞数量，直至观察到线性的O2
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢美国国立心肺血液研究所的 Michael N. Sack 博士提供的支持与讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院、国家癌症研究所和国家心肺血液研究所的院内研究项目资助。 JT 得到了西班牙科学与创新部（MICINN）拉蒙·卡哈尔计划（Ramon y Cajal program，项目号 RYC2018-026050-I）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG） | MilliporeSigma | D8375-5G | 糖酵解应激测试注入化合物 |
| 2,4-二硝基苯酚（2,4-DNP） | MilliporeSigma | D198501 | 电子传递链解偶联剂 / 线粒体应激测试注入化合物 |
| 96孔细胞培养板/圆底带盖 | Costar | 3799 | NK细胞培养 |
| 抗霉素A | MilliporeSigma | A8674 | 复合物III抑制剂 / 糖酵解和线粒体应激测试注入化合物 |
| BD FACSDIVA软件 | BD Biosciences | 流式数据采集 | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | 流式数据采集 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | 细胞粘附剂 |
| CyQUANT细胞增殖检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | C7026 | 用于DNA定量的细胞增殖检测试剂盒，包含细胞裂解缓冲液和CyQUANT GR染料 |
| EasySep人CD3阳性选择试剂盒II | Stemcell Technologies | 17851 | 从PBMC中分离NK细胞 |
| EasySep人NK细胞富集试剂盒 | Stemcell Technologies | 19055 | 从PBMC中分离NK细胞 |
| EasySep磁力架 | Stemcell Technologies | 18001 | 从PBMC中分离NK细胞 |
| EDTA 0.5 M，pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK细胞分离缓冲液 |
| 胎牛血清（FCS） | Gibco | 10437-028 | NK细胞分离缓冲液 |
| FACS管 | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | 流式细胞术实验 |
| Falcon 50 ml锥形管 | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK细胞分离 |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | 流式数据分析 | |
| 葡萄糖 | MilliporeSigma | G8270 | 线粒体应激测试培养基组分，糖酵解应激测试注入化合物 |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | ThermoFisher Scientific | 78429 | 100倍浓度蛋白酶抑制剂，用于RIPA裂解缓冲液 |
| 人IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK细胞刺激 |
| 人血清（HS） | Valley Biomedical | 9C0539 | NK细胞培养基补充剂 |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK细胞培养基 |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | 应激测试培养基组分 |
| LIVE/DEAD可固定Aqua死细胞染色试剂盒 | ThermoFisher Scientific | L34965 | 用于流式细胞术染色的活力染料 |
| LSM | mpbio | 50494X | 从人血中分离PBMCs |
| 小鼠抗人CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T细胞流式细胞术染色 |
| 小鼠抗人CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK细胞流式细胞术染色 |
| 小鼠抗人NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK细胞流式细胞术染色 |
| 寡霉素 | MilliporeSigma | 75351 | 复合物V抑制剂 / 线粒体应激测试注入化合物 |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK细胞分离缓冲液 |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23225 | 用于测定蛋白浓度 |
| RIPA缓冲液 | Boston BioProducts | BP-115 | 细胞裂解 |
| 鱼藤酮 | MilliporeSigma | R8875 | 复合物II抑制剂 / 糖酵解和线粒体应激测试注入化合物 |
| Seahorse Wave Controller软件 | Agilent | Seahorse XFe96分析仪的控制器 | |
| Seahorse Wave Desktop软件 | Agilent | 用于数据分析 | |
| Seahorse XF基础培养基 | Agilent | 102353-100 | 细胞外通量检测基础培养基 |
| Seahorse XFe96分析仪 | Agilent | 细胞外通量分析仪 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 包含20块XF96细胞培养板、18个XFe96传感器微孔板、用于将化合物转移至检测微孔板的加样导板，以及1瓶校准液（500 ml） |
| 碳酸氢钠 | MilliporeSigma | S5761 | 用于配制Cell-Tak溶液 |
| 丙酮酸钠（100 mM） | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | 线粒体应激测试培养基组分 |
参考文献
- Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
- Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
- Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
- Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
- Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016(2016).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
- Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278(2019).
- Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219(2018).
- Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
- Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
- Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
- Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918(2016).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615(2016).
- Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
- Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
- Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
- Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464(2015).
- Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
- Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).
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