本文介绍了一种用于测量从外周血中分离的人原代自然杀伤（NK）细胞在静息状态或经IL15诱导激活后糖酵解和线粒体呼吸的方法。所述方案可轻松扩展应用于其他细胞因子或可溶性刺激物激活的人原代NK细胞。
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本文内容
摘要
摘要
自然杀伤细胞（NK细胞）主要介导先天性抗肿瘤和抗病毒免疫应答，能够响应多种细胞因子及其他刺激，促进细胞存活、增殖、分泌干扰素γ（IFNγ）等细胞因子以及执行细胞毒功能。细胞因子刺激激活NK细胞需要对其代谢通路进行显著重塑，以满足其生物能量和生物合成需求。大量证据表明，NK细胞代谢功能受损与包括肥胖和癌症在内的多种慢性疾病相关，这凸显了建立一种检测NK细胞代谢方法的临床重要性。本文描述了使用细胞外通量分析仪的方法，该平台可实时测定糖酵解和线粒体耗氧量，用于监测人NK细胞能量代谢的变化。本文所述方法还可用于监测NK细胞经IL-15等细胞因子刺激后发生的代谢改变，而IL-15目前正被广泛应用于多项临床试验的研究体系中。
引言
自然杀伤细胞（NK细胞）是一类先天性淋巴细胞，可介导抗肿瘤和抗病毒反应。NK细胞占人类外周血中所有淋巴细胞的5%-15%，也可存在于脾脏、肝脏、骨髓和淋巴结中。NK细胞不表达多态性克隆型受体，如T细胞受体（TCR）或B细胞受体（BCR）。相反，其细胞毒功能的激活是由识别靶细胞表面不变配体的受体结合所触发的1,2。
从外周血中分离的静息态人自然杀伤（NK）细胞在添加了人血清的培养基中可存活数天。通过白细胞介素-15（IL-15）或白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子激活NK细胞，可促进其增殖并增强其杀伤能力，此外还产生其他效应3,4,5。多项研究表明，NK细胞的活化与其代谢活性的变化之间存在直接相关性6。这些代谢变化旨在满足细胞在能量和生物合成方面的特定需求。
需氧细胞和生物体通过一系列化学反应获取能量，这些反应涉及碳水化合物、脂肪和蛋白质的分解代谢与氧化。通过糖酵解、三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化的联合作用，真核细胞满足了其大部分ATP需求，并获得作为大分子合成前体所必需....
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方案
所有实验均遵循《赫尔辛基宣言》中医学研究的伦理原则进行。供体外周血样本由美国国立卫生研究院输血医学科根据经机构审查委员会批准的99-CC-0168号方案获取，并取得患者的书面知情同意。
1. 试剂准备
- NK细胞分离试剂
注意事项：在细胞培养罩内配制以下试剂。- 配制NK细胞分离缓冲液：在PBS（pH 7.4）中添加1 mM EDTA和2%已灭活的胎牛血清（FCS）（于56 °C加热30分钟灭活）。
- 配制NK细胞培养基：在Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）中添加10%人血清（HS）。经无菌过滤后，于2–8 °C保存。使用前将培养基预热至37 °C。
- 用PBS将人IL-15溶解至200 µg/mL。
- 胞外通量检测试剂
- 配制检测用培养基：线粒体应激检测培养基，在基础培养基中加入1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺和10 mM葡萄糖；糖酵解应激检测培养基，在基础培养基中加入2 mM L-谷氨酰胺。
注意：葡萄糖、丙酮酸和谷氨酰胺的浓度依据胞外通量分析仪制造商的推荐设定。但研究人员可根据需要调整培养基成分，以完全匹配细胞培养基的组成。 - 使用台式pH计，以0.1 N NaOH将两种培养基的....
- 配制检测用培养基：线粒体应激检测培养基，在基础培养基中加入1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺和10 mM葡萄糖；糖酵解应激检测培养基，在基础培养基中加入2 mM L-谷氨酰胺。
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结果
从外周血中分离自然杀伤细胞可获得纯净且具有活性的细胞群体
细胞外通量检测基于对孔内H+和O2浓度的测量，无法区分不同的细胞群体或其活性状态。因此，获得高纯度且具有活性的靶细胞群体是此类实验成功的关键步骤。
按照第2节所述方法从外周血中分离NK细胞。为评估所获得NK细胞的纯度和活力，取少量PBMCs和分离的NK细胞群体进行染色，并通过流式细胞术分析（图2A）。在前向散射（FSC-A）与侧向散射面积（SSC-A）的散点图中圈选单个核细胞群体。在此群体中，根据FSC-A与前向散射高度（FSC-H）散点图中沿对角线分布的单细胞进行圈选。在单细胞群体中评估细胞活力，在PBMCs和NK细胞群体中均高于98%。通过针对CD3（T细胞标志物，PBMCs中的主要细胞群）以及CD56或NKp46的双重染色确定分离NK细胞群体的纯度（图2B）。NK细胞定.......
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讨论
本文建立了一种高效分离和培养来自外周血的纯度高、活性好的原代人自然杀伤（NK）细胞的实验方案。我们还优化了利用细胞外通量分析仪测定这些NK细胞代谢活性的条件，该活性通过氧消耗率和细胞外酸化率进行评估。与其他呼吸测定方法相比，细胞外通量分析仪检测速度快、所需细胞数量少，并可实现高通量筛选。然而，该方法的试剂成本较高，且最多只能进行四次化合物注射。细胞因子诱导的NK细胞代谢重塑以及糖酵解和氧化磷酸化的激活，对于产生强效的NK细胞应答至关重要21，而本文所述技术可实现实时监测NK细胞的代谢特征。本方案可进一步拓展至由其他细胞因子（如IL-2、IL-12和IL-18）或结合激活受体的抗体所激活的细胞。我们特别强调了一些常被忽视的关键步骤，例如将细胞以最佳密度接种，或使用最佳浓度的解偶联剂以刺激最大氧消耗。尽管如此，若对细胞施加除IL-15以外的其他刺激物，我们仍建议检查实际的O2水平曲线（图3C），以确保微孔中的O2未被耗尽。若出现耗尽情况，应减少细胞数量，直至观察到线性的O2
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢美国国立心肺血液研究所的 Michael N. Sack 博士提供的支持与讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院、国家癌症研究所和国家心肺血液研究所的院内研究项目资助。 JT 得到了西班牙科学与创新部（MICINN）拉蒙·卡哈尔计划（Ramon y Cajal program，项目号 RYC2018-026050-I）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG） | MilliporeSigma | D8375-5G | 糖酵解应激测试注入化合物 |
| 2,4-二硝基苯酚（2,4-DNP） | MilliporeSigma | D198501 | 电子传递链解偶联剂 / 线粒体应激测试注入化合物 |
| 96孔细胞培养板/圆底带盖 | Costar | 3799 | NK细胞培养 |
| 抗霉素A | MilliporeSigma | A8674 | 复合物III抑制剂 / 糖酵解和线粒体应激测试注入化合物 |
| BD FACSDIVA软件 | BD Biosciences | 流式数据采集 | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | 流式数据采集 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | 细胞粘附剂 |
| CyQUANT细胞增殖检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | C7026 | 用于DNA定量的细胞增殖检测试剂盒，包含细胞裂解缓冲液和CyQUANT GR染料 |
| EasySep人CD3阳性选择试剂盒II | Stemcell Technologies | 17851 | 从PBMC中分离NK细胞 |
| EasySep人NK细胞富集试剂盒 | Stemcell Technologies | 19055 | 从PBMC中分离NK细胞 |
| EasySep磁力架 | Stemcell Technologies | 18001 | 从PBMC中分离NK细胞 |
| EDTA 0.5 M，pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK细胞分离缓冲液 |
| 胎牛血清（FCS） | Gibco | 10437-028 | NK细胞分离缓冲液 |
| FACS管 | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | 流式细胞术实验 |
| Falcon 50 ml锥形管 | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK细胞分离 |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | 流式数据分析 | |
| 葡萄糖 | MilliporeSigma | G8270 | 线粒体应激测试培养基组分，糖酵解应激测试注入化合物 |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | ThermoFisher Scientific | 78429 | 100倍浓度蛋白酶抑制剂，用于RIPA裂解缓冲液 |
| 人IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK细胞刺激 |
| 人血清（HS） | Valley Biomedical | 9C0539 | NK细胞培养基补充剂 |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK细胞培养基 |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | 应激测试培养基组分 |
| LIVE/DEAD可固定Aqua死细胞染色试剂盒 | ThermoFisher Scientific | L34965 | 用于流式细胞术染色的活力染料 |
| LSM | mpbio | 50494X | 从人血中分离PBMCs |
| 小鼠抗人CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T细胞流式细胞术染色 |
| 小鼠抗人CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK细胞流式细胞术染色 |
| 小鼠抗人NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK细胞流式细胞术染色 |
| 寡霉素 | MilliporeSigma | 75351 | 复合物V抑制剂 / 线粒体应激测试注入化合物 |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK细胞分离缓冲液 |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23225 | 用于测定蛋白浓度 |
| RIPA缓冲液 | Boston BioProducts | BP-115 | 细胞裂解 |
| 鱼藤酮 | MilliporeSigma | R8875 | 复合物II抑制剂 / 糖酵解和线粒体应激测试注入化合物 |
| Seahorse Wave Controller软件 | Agilent | Seahorse XFe96分析仪的控制器 | |
| Seahorse Wave Desktop软件 | Agilent | 用于数据分析 | |
| Seahorse XF基础培养基 | Agilent | 102353-100 | 细胞外通量检测基础培养基 |
| Seahorse XFe96分析仪 | Agilent | 细胞外通量分析仪 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 包含20块XF96细胞培养板、18个XFe96传感器微孔板、用于将化合物转移至检测微孔板的加样导板，以及1瓶校准液（500 ml） |
| 碳酸氢钠 | MilliporeSigma | S5761 | 用于配制Cell-Tak溶液 |
| 丙酮酸钠（100 mM） | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | 线粒体应激测试培养基组分 |
参考文献
- Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. ....
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