小鼠气管内给药干粉制剂

摘要

用于吸入的干粉制剂在治疗呼吸系统疾病方面具有巨大潜力。在开展人体研究之前，有必要通过临床前研究评估干粉制剂的疗效。本文介绍了一种通过气管途径在小鼠中给药干粉的简单且无创的方法。

摘要

在可吸入干粉制剂的研发过程中，必须在临床前动物模型中评估其生物活性。本文介绍了一种非侵入性的小鼠气管内递送干粉制剂的方法。该方法采用一种干粉装载装置，由一个200 µL凝胶上样枪头通过三通旋塞连接至1 mL注射器构成。将少量干粉（1–2 mg）装入枪头中，并利用注射器内的0.6 mL空气将其分散。由于枪头为一次性且成本低廉，可预先将不同干粉制剂分别装入不同枪头中。因此，在同一动物实验中可依次评估多种制剂，无需清洗装置或重新装填剂量，从而节省时间并避免残留粉末导致的交叉污染风险。可通过观察枪头内残留粉末的量来判断粉末分散程度。本文还包含使用自制光源和引导套管进行小鼠插管的操作方案。正确的插管是影响干粉制剂能否递送至小鼠肺深部区域的关键因素之一。

引言

肺部给药途径在递送局部和全身作用的治疗药物方面具有多种优势。对于肺部疾病的治疗，通过肺部给药可实现较高的局部药物浓度，从而减少所需剂量并降低全身不良反应的发生率。此外，肺部相对较低的酶活性可减少药物的过早代谢。由于肺部具有较大的、血流丰富的表面积、极薄的上皮细胞层以及肺毛细血管中较高的血容量，因此在实现药物全身吸收方面也十分高效¹。

吸入式干粉制剂已广泛用于哮喘、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病以及肺部疫苗接种等多种疾病的预防和治疗^2,3,4。固态药物通常比液态更稳定，且干粉吸入器比雾化器更便携、更易于使用^5,6。在开发吸入式干粉制剂的过程中，需通过肺部给药后在临床前动物模型中评估其安全性、药代动力学特征及治疗效果⁷。与能够主动吸入干粉的人类不同，将干粉递送至小型动物肺部具有挑战性。因此，有必要建立一种高效地将干粉递送至动物肺部的实验方案。

小鼠被广泛用作研究动物模型，因其成本低廉、繁殖性能良好，且易于操作，同时已有大量成熟的疾病模型。向肺部递送干粉主要有两种方法 小鼠给药方法：吸入法和气管内给药。进行吸入给药时，将小鼠置于全身暴露或仅鼻部暴露的染毒舱内，干粉被雾化后以气溶胶形式释放，动物在无麻醉状态下吸入该气溶胶^8,9需要昂贵的设备，且药物递送效率较低。尽管全身暴露舱在技术上难度较小，但仅鼻部暴露的暴露舱可尽量减少药物对体表的暴露。然而，仍难以精确控制和确定递送至肺部的剂量。干粉主要沉积在纤毛清除作用显著的鼻咽部位¹⁰此外，在给药过程中，由于小鼠在腔室内受到束缚且无法获得食物和水，因此处于显著的应激状态。¹¹对于气管内给药，通常是指将物质直接引入气管。实现该方法有两种不同技术：气管切开术和经口气管插管术。前者需要通过手术在气管上做切口，具有侵入性，很少用于粉末给药。本文仅描述第二种技术。与吸入法相比，由于气管内给药具有较高的递送效率且药物损失极少，因此在小鼠肺部给药中更为常用。^12,13这是一种简单快速的方法，可将几毫克的粉末精确递送至小鼠体内。尽管小鼠在解剖结构和生理特征上与人类存在差异，且在插管过程中需要进行麻醉，但气管内给药可绕过上呼吸道，为评估干粉制剂的生物学活性（如肺部吸收、生物利用度及治疗效果）提供更为有效的方式。^14,15.

为了将干粉经气管给药，需要对小鼠进行插管，这一操作可能具有挑战性。本文介绍了自制干粉喷雾器和插管装置的制备方法，并演示了对小鼠进行气管插管及肺部干粉喷雾给药的具体操作步骤。

方案

本研究中进行的实验已获得香港大学教学与研究使用活体动物委员会（CULATR）的批准。本研究采用喷雾冷冻干燥法（SFD）制备的干粉制剂，其中含有0.5%的荧光素酶信使RNA（mRNA）、5%的合成肽PEG₁₂KL4以及94.5%的甘露醇（w/w），用于展示mRNA在肺部的表达¹⁶。SFD粉末的质量中值空气动力学直径（MMAD）为2.4 μm。喷雾干燥（SD）的甘露醇粉末用于研究粉末分散过程中所用气体体积的影响¹⁶。SD粉末的MMAD为1.5 μm。

1. 干粉吸入器的制备与干粉装载

1. （可选） 中和冻干粉（置于小瓶中）和200 µL无滤芯圆头凝胶加样枪头的静电荷。根据制造商说明，使用防静电枪或具有去离子功能的天平。
2. 准备一张约4 cm × 4 cm大小的称量纸。将纸沿对角线对折，然后展开。
3. 在称量纸上称取1-2 mg的干燥粉末。
4. 通过移液枪头的较宽一端将粉末装入凝胶上样枪头中。轻轻敲击，使粉末在枪头狭窄端附近形成疏松的团聚物（图1A避免将粉末压得过紧，以免影响粉末的分散。
5. 将装有粉末的针头通过三通旋塞连接至1 mL注射器（图1B）。可根据用于分散粉末的空气体积调整注射器的大小。连接时应将吸头和注射器垂直持握，以防粉末洒出。若不能立即给药，需用封口膜密封吸头开口，并将其暂时存放于适当条件下，直至给药。

2. 插管装置的制备

1. 光源（图2）
   1. 准备一个自制光源，包括一个发光二极管（LED）手电筒和一根直径为0.8-1 mm的柔性光纤。
   2. 使用手钻或钻头在LED手电筒的透明透镜中心钻一个孔，使光纤刚好能够穿过。
   3. 将光纤穿过该孔。打开LED手电筒，调整光纤插入的位置和深度，以使光纤另一端的亮度达到最大。
   4. 用透明环氧树脂胶将光纤固定在位。
2. 引导套管（图3）
   1. 取一支1 mL塑料巴斯德吸管（图3A），用手握住吸管两端。
   2. 使用酒精灯（或实验室中的其他热源，如本生灯），将吸管置于火焰上方5-10 cm处加热（图3B）。旋转吸管以确保其受热均匀。
   3. 当塑料变软并具有可塑性时，将吸管移离火焰，并轻轻拉伸。
   4. 用剪刀在拉伸后的吸管中间剪断，分为A段和B段（图3C-E）。将A段用作细尖吸管，B段用作引导套管。为提高使用引导套管插管的成功率，可在B段末端制作一个斜面（不宜过尖，以免增加损伤动物的风险）（图3F）。当将200 µL加样枪头（用于粉末装载）插入引导套管时，枪头应超出套管1-2 mm。
      注意：一个尺寸合适（内径和外径适当）的引导套管（B段）应能容纳21号针头，同时自身又能插入17号针头内。可能需要多次尝试拉伸吸管以获得合适的尺寸。
   5. （可选）：在引导套管较宽的一端切开一个小口，使其更具弹性，从而更易于固定光纤（图3F）。此开口还可用于安装微型喷雾器，以便给予液体气溶胶。

3. 插管

1. 通过腹腔注射给予小鼠（BALB/c，7-9周龄）氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。
2. 准备一个由有机玻璃制成的平台，并用夹子将其固定在支架上（图4A）。将麻醉后的小鼠以仰卧位放置在平台上（倾斜角度约为60°）。通过调节夹子在支架上的位置，可调整平台的高度和倾斜角度。
3. 用尼龙线钩住小鼠的门齿将其悬挂固定，并用胶带或橡皮筋固定小鼠的位置（图4B）。
4. 在插管前将光纤插入引导套管中，使光纤尖端与引导套管开口齐平。打开LED手电筒以提供照明。
5. 用镊子轻轻拉出小鼠舌头，以暴露其气管。
6. 用另一只手握住内置光纤的引导套管，经口腔插入。借助光纤照明，可在声门之间观察到气管开口，表现为一个孔状结构。
7. 将引导套管的斜面朝向气管开口的中线（图5A），并将带有光纤的引导套管轻柔地插入气管，使套管最细的尖端对准气管开口。
8. 完成插管后，迅速抽出光纤，保留引导套管在气管内（图5B），此时应可观察到正常的呼吸运动。
9. 将细尖移液器（A部分）置于引导套管开口处，向小鼠肺部吹入一小口气流（约0.2 mL）。若观察到小鼠胸部轻微膨胀，则表明插管位置正确。在给予粉末前，先移除细尖移液器。

4. 粉末给药

1. 握住已连接注射器的载粉吸头，操作方式如步骤1.5所述。确保注射器与吸头之间的气流处于断开状态。
2. 向后拉动注射器活塞，抽取0.6 mL空气。
   注意：用于分散粉末的空气体积取决于粉末的性质及其装载量。结果部分对此有进一步说明。
3. 旋转三通阀的方向，使注射器与载粉吸头之间连通气流。
4. 将载有粉末的吸头插入已置于小鼠气管内的引导套管中（图5C）。固定引导套管，并用力将注射器活塞一次性快速推进，以将粉末以气溶胶形式分散至肺部。
   注意：应尽量减少设备的前向移动，以避免对动物造成损伤。
5. 取出吸头，检查其内部粉末是否已完全排出。若未排空，则重复步骤4.1至4.4。
   注意：若因过度敲击导致粉末压得过实，则可能无法充分分散。
6. 给药完成后，将引导套管从小鼠气管中取出。
7. 将小鼠水平仰卧放置，舌头半伸出，以防止气道阻塞，使其自行恢复。

结果

当使用干粉吸入器将粉雾递送至动物肺部时，所用空气体积至关重要，因其会影响给药的安全性及粉末分散效率。为优化该方法，采用不同体积的空气（0.3 mL、0.6 mL 和 1.0 mL）分散干粉（1 mg 喷雾干燥甘露醇），并在给药后连续 48 小时监测小鼠体重变化（图6）。使用 0.3 mL 和 0.6 mL 空气未导致小鼠在给药后 48 小时内出现体重下降。而使用 1 mL 空气分散粉末则导致小鼠在 24 小时内体重下降超过 5%，且在 48 小时后仍未完全恢复。本方案中使用 7–9 周龄的 BALB/c 小鼠。根据动物种类、品系与年龄、粉末性质（如粒径分布、黏聚性及密度）以及拟给药的粉末质量，研究者可能需要针对不同动物模型优化用于实现高效粉末分散且动物可耐受的空气体积。

采用喷雾冷冻干燥法（SFD）制备的干粉制剂，按照上述方法递送至小鼠体内。该SFD制剂包含0.5%表达荧光素酶蛋白的mRNA、5%作为递送载体的合成肽以及94.5%的甘露醇¹⁶。通过气管内途径向BALB/c小鼠...

讨论

本文介绍了一种用于干粉吹入和气管内插管的定制装置。在粉末装填步骤中，将干粉装入一支200 µL的凝胶加样枪头中。应轻轻敲击枪头，使粉末在枪头狭窄端松散地填充。然而，若粉末压得过紧，则会卡在枪头内，无法有效分散。建议对粉末和枪头进行静电中和，以促进粉末装填，特别是对于低密度粉末或在低相对湿度环境下操作时尤为重要。引导套管是该装置的关键部件，用于辅助将装有粉末的枪头插入小鼠气管。引导套管的直径不宜过宽，否则难以插入气管并可能损伤小鼠。引导套管的直径应恰好能够容纳光纤和装有粉末的枪头，且枪头应比引导套管前端突出约1–2 mm。

观察到气管开口对于插管过程至关重要，这有助于正确插入引导套管。气管开口位于咽喉后部，由呈规律开合运动的白色杓状软骨构成。借助光纤照明，可清晰观察气管开口。通过精细塑料移液管尖端吹入微量空气，若胸部出现膨胀，则表明插管位置正确。若未观察到胸部膨胀，或在插入过程中感到阻力，应迅速撤回引导套管，并重复操作步骤。

既往有一种广泛使用的市售干粉吹入器^12,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BALB/c 小鼠			雌性；7–9 周龄；体重 20–25 g
CleanCap 萤火虫荧光素酶 mRNA	TriLink Biotechnology	L-7602
干粉喷雾器	PennCentury	型号 DP-4M
10% 氯胺酮	Alfasan International B.V.	NA
发光二极管（LED）手电筒	Unilite Internation	PS-K1
甘露醇（Pearlitol 160C）	Roquette	450001
无滤芯圆形凝胶加样吸头（200 µL）	Labcon	1034-800-000
尼龙牙线	Reach	30017050
1 毫升无针注射器	Terumo	SS-01T
光纤	Fibre Data	OMPF1000
PEG12KL4 肽	EZ Biolab		(PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2
塑料巴斯德细尖移液管	Alpha Labotatories	LW4061
三通旋塞阀	Braun	D201
2% 赛拉嗪	Alfasan International B.V.	NA
Zerostat 3 防静电枪	MILTY	5036694022153