用于吸入的干粉制剂在治疗呼吸系统疾病方面具有巨大潜力。在开展人体研究之前，有必要通过临床前研究评估干粉制剂的疗效。本文介绍了一种通过气管途径在小鼠中给药干粉的简单且无创的方法。
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本文内容
摘要
摘要
在可吸入干粉制剂的研发过程中，必须在临床前动物模型中评估其生物活性。本文介绍了一种非侵入性的小鼠气管内递送干粉制剂的方法。该方法采用一种干粉装载装置，由一个200 µL凝胶上样枪头通过三通旋塞连接至1 mL注射器构成。将少量干粉（1–2 mg）装入枪头中，并利用注射器内的0.6 mL空气将其分散。由于枪头为一次性且成本低廉，可预先将不同干粉制剂分别装入不同枪头中。因此，在同一动物实验中可依次评估多种制剂，无需清洗装置或重新装填剂量，从而节省时间并避免残留粉末导致的交叉污染风险。可通过观察枪头内残留粉末的量来判断粉末分散程度。本文还包含使用自制光源和引导套管进行小鼠插管的操作方案。正确的插管是影响干粉制剂能否递送至小鼠肺深部区域的关键因素之一。
引言
肺部给药途径在递送局部和全身作用的治疗药物方面具有多种优势。对于肺部疾病的治疗，通过肺部给药可实现较高的局部药物浓度，从而减少所需剂量并降低全身不良反应的发生率。此外，肺部相对较低的酶活性可减少药物的过早代谢。由于肺部具有较大的、血流丰富的表面积、极薄的上皮细胞层以及肺毛细血管中较高的血容量，因此在实现药物全身吸收方面也十分高效1。
吸入式干粉制剂已广泛用于哮喘、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病以及肺部疫苗接种等多种疾病的预防和治疗2,3,4。固态药物通常比液态更稳定，且干粉吸入器比雾化器更便携、更易于使用5,6。在开发吸入式干粉制剂的过程中，需通过肺部给药后在临床前动物模型中评估其安全性、药代动力学特征及治疗效果7。与能够主动吸入干粉的人类不同，将干粉递送至小型动物肺部具有挑战性。因此，有必要建立一种高效地将干粉递送至动物肺部的实验方案。
小鼠被广泛用作研究动物模型，因其成本低廉、繁殖性能良好，且易于操作，同时已有大量成熟的疾病模型....
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方案
本研究中进行的实验已获得香港大学教学与研究使用活体动物委员会（CULATR）的批准。本研究采用喷雾冷冻干燥法（SFD）制备的干粉制剂，其中含有0.5%的荧光素酶信使RNA（mRNA）、5%的合成肽PEG12KL4以及94.5%的甘露醇（w/w），用于展示mRNA在肺部的表达16。SFD粉末的质量中值空气动力学直径（MMAD）为2.4 μm。喷雾干燥（SD）的甘露醇粉末用于研究粉末分散过程中所用气体体积的影响16。SD粉末的MMAD为1.5 μm。
1. 干粉吸入器的制备与干粉装载
- （可选） 中和冻干粉（置于小瓶中）和200 µL无滤芯圆头凝胶加样枪头的静电荷。根据制造商说明，使用防静电枪或具有去离子功能的天平。
- 准备一张约4 cm × 4 cm大小的称量纸。将纸沿对角线对折，然后展开。
- 在称量纸上称取1-2 mg的干燥粉末。
- 通过移液枪头的较宽一端将粉末装入凝胶上样枪头中。轻轻敲击，使粉末在枪头狭窄端附近形成疏松的团聚物（图1A避免将粉末压得过紧，以免影响粉末的分散。
- 将装有粉末的针头通过三通旋塞连接至1 mL注射器（图1B）。可....
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结果
当使用干粉吸入器将粉雾递送至动物肺部时，所用空气体积至关重要，因其会影响给药的安全性及粉末分散效率。为优化该方法，采用不同体积的空气（0.3 mL、0.6 mL 和 1.0 mL）分散干粉（1 mg 喷雾干燥甘露醇），并在给药后连续 48 小时监测小鼠体重变化（图6）。使用 0.3 mL 和 0.6 mL 空气未导致小鼠在给药后 48 小时内出现体重下降。而使用 1 mL 空气分散粉末则导致小鼠在 24 小时内体重下降超过 5%，且在 48 小时后仍未完全恢复。本方案中使用 7–9 周龄的 BALB/c 小鼠。根据动物种类、品系与年龄、粉末性质（如粒径分布、黏聚性及密度）以及拟给药的粉末质量，研究者可能需要针对不同动物模型优化用于实现高效粉末分散且动物可耐受的空气体积。
采用喷雾冷冻干燥法（SFD）制备的干粉制剂，按照上述方法递送至小鼠体内。该SFD制剂包含0.5%表达荧光素酶蛋白的mRNA、5%作为递送载体的合成肽以及94.5%的甘露醇16。通过气管内途径向BALB/c小鼠.......
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讨论
本文介绍了一种用于干粉吹入和气管内插管的定制装置。在粉末装填步骤中，将干粉装入一支200 µL的凝胶加样枪头中。应轻轻敲击枪头，使粉末在枪头狭窄端松散地填充。然而，若粉末压得过紧，则会卡在枪头内，无法有效分散。建议对粉末和枪头进行静电中和，以促进粉末装填，特别是对于低密度粉末或在低相对湿度环境下操作时尤为重要。引导套管是该装置的关键部件，用于辅助将装有粉末的枪头插入小鼠气管。引导套管的直径不宜过宽，否则难以插入气管并可能损伤小鼠。引导套管的直径应恰好能够容纳光纤和装有粉末的枪头，且枪头应比引导套管前端突出约1–2 mm。
观察到气管开口对于插管过程至关重要，这有助于正确插入引导套管。气管开口位于咽喉后部，由呈规律开合运动的白色杓状软骨构成。借助光纤照明，可清晰观察气管开口。通过精细塑料移液管尖端吹入微量空气，若胸部出现膨胀，则表明插管位置正确。若未观察到胸部膨胀，或在插入过程中感到阻力，应迅速撤回引导套管，并重复操作步骤。
既往有一种广泛使用的市售干粉吹入器12,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢李先⽣、梁汉昌先⽣和苏华⼒先⽣在光源和粉末吹⼊装置制作过程中提供的帮助，以及 Faculty Core Facility 在动物成像⽅⾯的协助。本研究工作由香港研究资助局（17300319）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BALB/c 小鼠 | 雌性；7–9 周龄；体重 20–25 g | ||
| CleanCap 萤火虫荧光素酶 mRNA | TriLink Biotechnology | L-7602 | |
| 干粉喷雾器 | PennCentury | 型号 DP-4M | |
| 10% 氯胺酮 | Alfasan International B.V. | NA | |
| 发光二极管（LED）手电筒 | Unilite Internation | PS-K1 | |
| 甘露醇（Pearlitol 160C） | Roquette | 450001 | |
| 无滤芯圆形凝胶加样吸头（200 µL） | Labcon | 1034-800-000 | |
| 尼龙牙线 | Reach | 30017050 | |
| 1 毫升无针注射器 | Terumo | SS-01T | |
| 光纤 | Fibre Data | OMPF1000 | |
| PEG12KL4 肽 | EZ Biolab | (PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2 | |
| 塑料巴斯德细尖移液管 | Alpha Labotatories | LW4061 | |
| 三通旋塞阀 | Braun | D201 | |
| 2% 赛拉嗪 | Alfasan International B.V. | NA | |
| Zerostat 3 防静电枪 | MILTY | 5036694022153 |
参考文献
- Newman, S. P. Drug delivery to the lungs: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 8 (8), 647-661 (2017).
- Setter, S. M., et al. Inhaled dry powder insulin for the treatment of diabetes mellitus. Clinical Therapeutics. 29 (5), 7....
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