Na+/K+泵在节律性簇状放电中的作用：基于建模与动态钳分析的研究

Ricardo  Javier Erazo-Toscano; Parker  J. Ellingson; Ronald  L. Calabrese; Gennady  S. Cymbalyuk

doi:10.3791/61473

方法文章

Na⁺/K⁺泵在节律性簇状放电中的作用：基于建模与动态钳分析的研究

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DOI：

10.3791/61473

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2021年5月9日

Ricardo Javier Erazo-Toscano¹^,² , Parker J. Ellingson² , Ronald L. Calabrese^*¹ , Gennady S. Cymbalyuk^*²

¹Department of Biology, Emory University, ²Neuroscience Institute, Georgia State University

^* These authors contributed equally

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摘要

本文介绍了一种利用动态钳技术研究钠钾泵（Na⁺/K⁺ pump）和持续性钠电流（persistent Na⁺ current）在蛭心脏中间神经元中作用的方法。

摘要

Na⁺/K⁺ 泵通常被视为神经元活动中的背景功能，它产生一种外向电流（I_pump），该电流响应细胞内 Na⁺ 浓度（[Na⁺]_i）。在爆发式放电的神经元中，例如产生节律性运动的中枢模式发生器（CPG）神经网络中的神经元，[Na⁺]_i 以及由此决定的 I_pump 可望在爆发周期中发生变化。这种对电活动的响应性，加上其对膜电位的独立性，赋予了 I_pump 不同于基于离子通道电流（如电压门控、递质门控或漏通道）的动力学特性。此外，在许多神经元中，泵的活性受到多种调节因子的调控，进一步扩展了 I_pump 在节律性爆发活动中的潜在作用。本文将展示如何结合建模与动态钳制技术，来确定 I_pump 及其与持续性 Na⁺ 电流的相互作用如何影响 CPG 中的节律性活动。具体而言，本文将聚焦于医用水蛭心脏中间神经元中的动态钳制实验方案和计算建模方法。

引言

蛭类的心跳由一个中央模式发生器（CPG）驱动，该发生器由分布在相同数量的中段体节神经节中的9对双侧心脏中间神经元（HNs）组成。CPG的核心是由位于第3节段的相互抑制的中间神经元对构成^rd 和 4^th 形成半中心振荡器（HCOs）的节段性神经节图1A）。当使用荷包牡丹碱药理学手段进行突触隔离后，这些神经元仍持续产生簇状放电。¹. 其他如第7对^th 节段性神经节（本方案的重点）也具有爆发放电特性，当突触隔离时能够产生节律性爆发活动。它们彼此之间无相互连接，仅接受下行输入，因此可通过切断神经节与其余神经索的联系而轻易实现隔离。这种独立的爆发活动对使用尖锐微电极穿刺记录时引入的漏电流敏感。但使用松贴片方法记录时剧烈破裂¹.

已对单个HN神经元和HN半中心振荡器（HN HCOs）建立了模型（基于Hodgkin-Huxley的单等电位区室模型，包含实验已鉴定出的所有电压门控电流和突触电流），成功再现了生物系统中所有爆发活动的特征²。肌调节素（myomodulin）是水蛭体内的一种内源性神经肽，可显著缩短离体HN神经元和HN HCOs爆发节律的周期（T）。该调节因子通过增强h电流（超极化激活的内向电流，I_h）并减弱I_pump发挥作用³。这一发现促使研究者进一步探究I_pump与I_h之间的相互作用，以及二者共调节如何影响HN神经元的节律性活动。通过提高细胞内钠离子浓度（[Na⁺]_i，使用离子载体莫能菌素）激活钠钾泵，可加快HN HCOs和离体HN神经元的爆发节律⁴。这种加速效应依赖于I_h 。当阻断I_h（使用2 mM Cs⁺）后，通过该方法激活泵不再改变爆发周期；然而，爆发持续时间（BD）缩短，且HN HCOs和离体HN神经元的爆发间期（IBI）均延长⁴。

在本方案中，包括泵电流 I_pump 在内的活体 HN(7) 神经元的所有电流均按如下方式纳入 HN 模型：

figure-introduction-1 (1)

其中 C 是膜电容（单位：nF）， V 是膜电位（单位为 V), t 是时间（单位为 s）。详细的离子电流描述和方程已在其他文献中阐述²^,⁴完整的 HN 模型神经元可实时运行（图2）。该软件将在发表后发布于 GitHub，适用于文中所述的数字信号处理板运行。 材料清单。此处研究的重点是 Na⁺/⁺ 泵电流（I_泵）以及对显著 Na 电流有贡献的电压门控电流⁺ flux：一种快速的钠离子流⁺ 电流I_Na）和持续性钠电流（persistent Na⁺ 电流I_P）。这些电流的最大电导为 figure-introduction-2 figure-introduction-3 分别。Na⁺/ K⁺ 泵交换三个细胞内 Na⁺ 细胞外 K 的离子条件⁺ 离子，从而产生净外向电流。重要的是，它泵出的 Na 数量是其他离子的 3 倍⁺ 离开神经元，因为该电流表明了这一点，这对于计算细胞内 Na⁺ 浓度至关重要⁺ 浓度

Na⁺/K⁺ 泵电流取决于细胞内 Na⁺ 浓度，并由以下S形函数表示：

figure-introduction-4 (2)

其中 [Na]_i 是细胞内 Na⁺ 浓度 figure-introduction-5 是最大 Na⁺/⁺ 泵电流， [Na]_ih 是细胞内 Na⁺ 半激活钠通道的浓度⁺/⁺ 泵，和 [Na]_是 Na的敏感性⁺/⁺ 泵至 [Na]_i. [Na]_i 由于Na的积累而形成⁺ 由……介导的内流 I_P 和 I_Na 并被 Na 减弱⁺ Na⁺ 外流⁺/⁺ 泵。其贡献的 I_h 和 I_渗漏总钠⁺ 通量较小，在实时模型中不予考虑。

figure-introduction-6 (3)

其中，v 是细胞内 Na⁺ 储库的体积（约 6.7 pL），F 为法拉第常数，细胞外 Na⁺ 浓度保持恒定。

电压门控电导和漏电导（这些电导对膜电位产生响应）与泵电流有所区别，后者受计算得到的细胞内 Na⁺ 浓度（[Na⁺]_i）调节。[Na⁺]_i 通过产生动作电位（即峰电位）的快速 Na⁺ 电流（I_Na）以及提供去极化以维持峰电位发放的持续性 Na⁺ 电流（I_P）介导的 Na⁺ 内流而逐渐累积；同时，[Na⁺]_i 又通过泵将 Na⁺ 排出细胞的作用而降低。我们假设 HN 的基础活体值为 figure-introduction-7 (5 nS) 和 figure-introduction-8 (150 nS)，并计入所添加的动态钳制 figure-introduction-9 的影响。

本方案的目标是实时、精确且可逆地调控 I_pump，以探究其如何与电压门控电流（在本方案中为持续性 Na⁺ 电流）相互作用，从而调控单个 HN 神经元的节律性簇状放电。为实现这一目标，采用了动态钳技术，该技术可根据指令在模型运行过程中实时引入精确数量的任意电流。与药理学手段调控泵活性相比，该方法具有优势：药理学方法作用于整个组织，可能产生难以逆转的脱靶效应，且无法实现精确操控。动态钳⁵^,⁶ 可实时读取记录神经元的膜电位（图 1B），并根据模型方程及设定的 figure-introduction-10 或 figure-introduction-11 值，实时计算并注入相应量的电流。类似的方法可轻松应用于任何可进行细胞内记录的神经元。然而，相关参数需根据所选神经元重新标定，且应通过药理学等手段将该神经元与突触输入隔离。

方案

注意：无脊椎动物实验对象不受美国国立卫生研究院（NIH）或埃默里大学及佐治亚州立大学的监管。但本研究仍采取了一切可能措施，以尽量减少实验所用医用水蛭的痛苦。

1. 准备蛭神经索中分离的第7神经节

保持水蛭的饲养 Hirudo verbana 在去离子水中稀释的人工池塘水（含0.05% w/v海盐）中 16 °C 12小时光照-12小时黑暗循环
将水蛭置于碎冰床上进行低温麻醉，以备解剖 >10 分钟直至不动。
用冰冷的生理盐水填充一个黑色树脂内衬的解剖皿，液面深度约为 1 cm，生理盐水中含有 115 mM NaCl、4 mM KCl、1.7 mM CaCl₂、1.2 mM MgSO₄、1.2 mM NaH₂PO₄、26 mM NaHCO₃、10 mM 葡萄糖，用 95% O₂ 和 5% CO₂ 混合气体预充氧至少 30 分钟。₂，10 mM D-葡萄糖，以及10 mM HEPES溶于去离子水中；用1 M NaOH调节pH至7.4。将水蛭背侧朝上固定于黑色树脂衬里的记录腔内（腔体尺寸至少为20 cm × 10 cm，树脂厚度至少2 cm，腔内液深至少2 cm）。
在体视显微镜下，使用斜射光照明，以20倍放大倍数观察，用5 mm弹簧剪刀在身体前1/3段的体壁上进行至少3 cm长的纵向切口^rd 身体的一部分。用大头针将体壁拉开，以暴露内部器官。
注意：可使用火焰抛光的巴斯德吸管通过抽吸去除任何储存的血餐。
分离单个中段第7神经节（脑后第7个游离节段神经节）。
1. 使用5 mm弹簧剪打开容纳神经索的窦腔。注意从背侧和腹侧剪开窦腔，保留两片窦组织。使用锋利的#5镊子辅助引导切割并夹持窦组织。
2. 将窦保持附着于从神经节发出的两条侧支神经根上（窦与每条神经根紧密粘连），利用这些窦条来固定神经节。
3. 通过切断连接神经节的吻侧和尾侧神经束（尽可能远离7）将神经节从身体上移除^th 尽可能保留神经节，并保留窦状条带，然后在神经根自窦部发出的外侧位置将其切断。
将神经节（使用旧的钝头#5镊子）用截短的昆虫针固定在透明、树脂衬里的培养皿中，腹面朝上。将针插入附着于根部以及头侧和尾侧连接处的窦状组织条和疏松组织中，尽量远离神经节。
注意：若要在记录期间实现良好的底部透射照明，树脂厚度不得超过3 mm。确保神经节在纵向和横向均处于紧绷状态。
将体视显微镜的放大倍数增加至40倍或更高，并调整斜射照明，使神经节腹侧表面、神经外膜下方的神经元胞体清晰可见。
用显微剪刀剥离神经节的神经外膜（去鞘）。
1. 从一侧根部之间的疏松鞘膜处开始去鞘，沿侧向继续切割至另一侧，注意保持剪刀刀片贴近表面，避免损伤鞘膜下方的神经元细胞体。
2. 从侧切口沿中线向尾侧做一相似的浅表切口。
3. 现在用精细的#5镊子夹住一侧鞘膜的尾外侧瓣，将其从神经节上拉开，然后用显微剪将其剪除。
4. 另一侧重复相同操作；该步骤可暴露两侧的 HN(7) 神经元，以便用微电极进行记录。
将制备皿放入记录装置中，并以5的流速用生理盐水进行灌流 mL/min，室温条件下。

2. 使用尖锐微电极识别并记录蛭心脏中间神经元

在记录 HN(7) 神经元期间（记录持续时间为 30 至 60 分钟），使用数字数据采集系统（模拟转数字，A 到 D）和刺激系统（数字转模拟，D 到 A），以 5 kHz 的采样率从神经生理电位仪获取并数字化细胞内电流和电压信号，并在计算机屏幕上实时显示。
注意：数据采集（A 到 D）可使用任何商用或自行开发的软件及 A 到 D/D 到 A 数据采集板。动态钳实验则需要 D 到 A 转换功能及自行开发的软件。
在 50–100 倍暗场透射照明的体视显微镜下，根据 HN(7) 神经元在第七体节神经节中外侧后部的典型位置，初步识别该双侧成对神经元中的 HN(7) 神经元。
现在使用充满 2 M 醋酸钾和 20 mM KCl 的尖锐微电极，通过显微操作器尝试穿刺疑似 HN(7) 神经元。
1. 将微电极置于目标细胞体附近。
2. 持续观察电位仪记录的电位信号，并在穿刺神经元前将该电位调零至 0 mV。
3. 通过操作器沿微电极长轴缓慢推进电极以穿刺神经元。使用电位仪的蜂鸣功能（设定蜂鸣持续时间为 100 ms），直至观察到膜电位出现负向偏移及强烈的放电活动。
将电位仪设置为不连续电流钳模式（DCC），频率 ≥ 3 kHz，以使用单根微电极同时记录膜电位并注入电流（电容补偿调节至刚好低于振铃阈值，然后回调 10%）。
1. 在示波器上监测 DCC 模式下电极信号的稳定情况。
2. 使用电位仪的稳流注入功能，注入 -0.1 nA 的稳定电流持续一至两分钟，以稳定记录状态。
根据其特征性的动作电位波形和微弱的簇状放电活动，最终确认 HN(7) 神经元的身份（图 1Ci）。
实验结束后进行离线数据分析，并将所有数据保存至磁盘。

3. 构建实时 HN 或其他模型神经元

使用台式计算机中的数字信号处理板（DSB；D/A 和 A/D）开发自定义软件，以实时实现文献²^,⁴中所述的模型电流，或为其他神经元或实验设计不同的模型电流。
1. 采用霍奇金-赫胥黎（Hodgkin-Huxley）类型的方程，因其是表示模型电流的通用首选方法。
2. 参见文献⁷，了解在加入泵电流前，实时 HN 模型与动态钳技术实现的详细描述。有关电流、细胞内 Na⁺ 浓度以及 HN 模型中活体 HN(7) 神经元电导的描述，请参见引言部分。

4. 实施并调整动态钳制电导/电流

使用为 DSB 开发的定制动态钳制软件，通过图形用户界面实时实施和更改动态钳制图3)（图形用户界面）可访问的、程序化控制的电导与电流，以及 HN(7) 神经元 HN 实时模型的电流输出。
注意：再次提醒，和是持续性钠通道的最大电导⁺ 电流I_P）和最大泵电流（I_泵），分别。
在模型运行过程中，使用软件中的图形用户界面输入框进行修改（PumpMaxL 盒）和 (GpinHNLive 盒)图3).
注意：图形用户界面输入框接受键入的数值，建议以 0.1 nA 为步长进行调整。建议使用1 nS的步长 .
1. 加入少量和使用动态钳技术稳定 HN(7) 神经元的簇状放电活动，由微电极引起的泄漏所致，如图所示 图1Cii.
  注意：尖锐微电极穿刺会造成膜损伤，表现为漏电导增加或输入电阻降低。
2. 首先添加一个数值 0.1–0.2 nA，以补偿微电极引起的漏电流，但会抑制兴奋性，然后逐渐增加，从而增强兴奋性，直至出现规律的簇状放电，通常发生在约1-4 nS（图 4A).
系统性地共同改变这些电流（以 0.1 nA 为增量）和 1 nS 用于 ) 到通过动态钳记录的 HN(7) 神经元图3），并评估其对簇放电特征的影响：放电频率（f：簇内平均峰间间隔的倒数）、簇间间隔（IBI：前一簇的最后一个峰与下一簇的第一个峰之间的时间）、簇持续时间（BD：簇中第一个峰与最后一个峰之间的时间）以及簇周期（T：一簇的第一个峰与下一簇的第一个峰之间的时间）。
1. 更改以下数值和，如视频演示中所示，先熟悉该技术后再进行实际操作。
  1. 保持在特定固定值处，以1 nS为步长，在一定范围内进行扫描支持规律的爆发性活动。
  2. 现在增加固定值 0.1 nA，并再次在一定范围内扫描支持规律的爆发性活动。
  3. 针对每一对设定的参数，需收集至少包含8个簇放电的数据，以便对放电频率（f）、簇间间隔（IBI）、簇持续时间（BD）和总时长（T）进行可靠的平均值计算。
  4. 根据神经元的放电强度和振荡基线电位的稳定性评估其活性，在神经元保持活性期间持续进行记录。
  5. 从多个神经元（来自不同动物）收集数据，以生成复合图图5).

结果

通过引入I_pump⁴进行建模，使引言部分所展示的实验结果更加清晰，并开始解释泵辅助的簇发放机制。此处展示的实时模型已进行调参（ figure-results-1 和 figure-results-2 参数已选定），使其产生的节律性活动处于实验中观察到的正常活动范围之内——包括频率（f）、爆发间期（IBI）、爆发持续时间（BD）和周期（T） ——并且当模型中调节肌调节素（myomodulin）的相关参数 figure-results-3 （最大泵电流）和 figure-results-4 （h电流的最大电导）单独或联合变化时，模型仍能持续产生此类活动。所确定的参数值可作为建模实验的基准或标准参数集。在这些模型实例中，随着胞内钠离子浓度[Na⁺]_i围绕基线水平波动，I_pump在整个簇发放周期中持续振荡。I_pump在簇发放阶段促进簇的终止，其引起的超极化在爆发间期激活I_h；请注意在簇发放起始附近I_h达到最大值（图 2）。

尽管实时 HN 模型已实现了所有电流²^,⁴ 可用于动态钳制，此处的重点是 figure-results-5 和 figure-results-6 ，这些参数可在模型运行期间通过动态钳制图形用户界面（dynamic clamp GUI）进行修改图3）。动态钳制技术允许实验者添加（或通过负值减去） figure-results-7 或 figure-results-8 ）人为地向神经元引入某种电导或电流，以模拟真实电导或电流的电压和离子依赖特性。因此，可以全面探究特定电导或电流如何与细胞内源性的电导或电流相互作用。图1）。实时HN模型表明，持续性Na⁺ 电流I_P在HN神经元中，) 对Na贡献很大⁺ 进入对[Na⁺]_i (图2）因此， I_泵。因为 I_P 在相对较负的膜电位下具有活性，因此起到拮抗作用 I_泵 即使在IBI期间。

这些观察结果表明，有必要利用动态钳技术在分离的 HN 神经元中进一步探究 figure-results-9 与 figure-results-10 之间的相互作用，如前所述⁸^,⁹^,¹⁰。这些实验（正在进行中）采用尖锐微电极记录技术，针对单个突触隔离的 HN(7) 神经元（第七神经节与神经索分离）进行。迄今为止的实验结果显示，通过动态钳同时引入 I_P 和 I_pump，可在因微电极穿刺导致漏电流而持续活跃的 HN 神经元中恢复稳定的节律性放电（图4）。这一重要发现表明，这些神经元中存在一种节律性放电机制（即使在漏电流受损的情况下），该机制源于 I_pump 与 I_P 的相互作用。初步结果提示二者之间存在复杂的相互作用，可在模型与实验中进一步深入研究（图5）。

总之， I_泵 在响应周期性升高的[Na⁺]_i 在爆发活动中通过爆发终止（降低BD）对爆发节律产生影响。这种相互作用 I_P 和 I_泵 足以支持内源性簇状放电活动的机制；该机制可在第7神经节内通过细胞内记录的HN中间神经元中恢复强烈的簇状放电。该机制与 I_P 和 I_泵 通过 [Na⁺]_i 非单调地影响HN簇发放周期，并确保自主簇发放的鲁棒性。这些结论与脊椎动物系统中的实验和建模结果一致¹¹^,¹².

figure-results-11
图1：水蛭心脏中间神经元的电活动及通过动态钳制技术实现 I_pump 和 I_P 电流。（A）从第三神经节的心跳半中心振荡器（HCO）中同时记录到的正常簇状放电活动，上方为细胞外记录，下方为细胞内记录；右侧为所记录神经元及其相互抑制性突触连接的示意图。（B）在分离的第7神经节中记录HN(7)中间神经元时的动态钳制示意图；注意两个HN(7)中间神经元之间无突触相互作用。（Ci）在漏电受损的HN(7)中间神经元中的簇状放电活动。（Cii）通过添加动态钳制的 I_pump 电流（ figure-results-12 = 0.1 nA），可补偿微电极引起的漏电，但会降低兴奋性，同时添加 figure-results-13 （1 nS）可增强兴奋性，从而产生更稳定的簇状放电。黑色虚线表示基线值。缩写：HN = 心脏中间神经元；HCO = 半中心振荡器；I_pump= 外向电流；I_P= 持久性Na⁺电流； figure-results-14 = 最大Na⁺/K⁺泵电流； figure-results-15 = 持久性Na⁺电流的最大电导；Vm = 膜电位；[Na⁺]_i = 细胞内Na⁺浓度。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-16
图2：单个 HN 中间神经元模型，显示膜电位（Vm）的轨迹， I_h, I_泵，[Na⁺]_i，以及 I_P. 外向超极化电流为负值，内向去极化电流为正值。黑色虚线表示基线值。缩写：HN = 心脏中间神经元； I_泵= 外向电流 I_P= 持续性钠电流⁺ 电流 figure-results-17 = 最大钠离子⁺/⁺ 泵电流 I_h= 超极化激活的内向电流 figure-results-18 = 持久性钠通道的最大电导⁺ 电流 figure-results-19 = 超极化激活的内向电流的最大电导；Vm = 膜电位；[Na⁺]_i = Na⁺ 的内部浓度⁺. 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-20
图3：基于数字信号处理板实现的实时心脏节律性中间神经元（HN）模型与动态钳制技术的图形用户界面。左上方：红色 Math 框为用户设定的实时模型参数框，而蓝色 Live 框为动态钳制中使用的用户设定参数框。El：漏电流的反转电位；Gl：漏电导；Gh：h 电流最大电导；Gp：P 电流最大电导；GCaS：慢钙电流最大电导；PumpMax：泵最大电流；[GSyn2：到相应神经元的最大突触电导；ThreshSyn2：介导突触电位的放电阈值——这些用于构建混合（活体/模型）半中心振荡器，但此处未示出]。左下方为动态钳制部分。最左侧为动态钳制变量的 5 个计算值： I_泵 = 泵电流注入；Ih = H型电流注入（此处未使用）；IP = P型电流注入；NaI = 计算的胞内钠浓度⁺ 浓度；ENa = 计算的钠离子反转电位。动态钳左下角。在计算变量右侧有6个用户设定的参数框：GNa = 假定的内源性快速钠离子最大电导，用于计算Na⁺ 与动作电位相关的离子流；PumpMaxL = 动态钳制技术中注入的最大泵电流；Naih 参见公式(2)；Gh = 用于确定动态钳制技术中注入的h电流的最大电导；Gp = 假定的内源性P电流用于计算钠离子最大电导的参数⁺ 与内源性 P 电流相关的流；GpinHNLive = 用于确定通过动态钳技术注入 P 电流的最大电导。请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-21
图4：独立HN(7)节律性爆发的动态钳制分析。将 figure-results-22 从（A）4.0 nS上调至（B）9.0 nS，可减慢独立HN神经元的节律性爆发频率。实验迹线显示，在动态钳制条件下分离的HN(7)神经元呈现节律性爆发活动。随着 figure-results-23 的上调，[Na⁺]_i和Vm的振荡范围增大。迹线从上至下依次为：记录的Vm、注入的I_pump、计算的[Na⁺]_i以及注入的I_P。黑色虚线表示基线值。缩写：HN = 心脏中间神经元；I_pump= 外向电流；I_P=持续性Na⁺电流； figure-results-24 = 最大Na⁺/K⁺泵电流； figure-results-25 = 持续性Na⁺电流的最大电导；Vm = 膜电位；[Na⁺]_i = Na⁺的胞内浓度。请点击此处查看该图的高清版本。

figure-results-26
图5：独立 HN(7) 神经元簇发放的动态钳分析上调 figure-results-27 倾向于减少，随后 HN 爆发周期增加。在使用动态钳技术的单个实验中（由线条连接的点） figure-results-28 数值被扫描的同时 figure-results-29 保持恒定。颜色代表添加的不同恒定水平 figure-results-30 用于不同的实验。缩写：HN = 心脏中间神经元； figure-results-31 = 最大钠离子⁺/⁺ 泵电流 figure-results-32 = 持久性钠电流的最大电导⁺ 电流请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

建模、动态钳制及其所支持的分析是研究单个及多组离子电导/电流如何影响神经元电活动的有用技术（图1, 图2,图4，以及图5). 这些技术的应用展示了Na⁺/⁺ 泵电流（我_泵) 与电压门控电流相互作用，特别是持续性钠离子流（persistent Na⁺ 电流I_P)，以促进蛭类心脏节律发生器核心HN神经元的强健节律性放电。通过结合动态钳实验与建模方法，可比常规的电压记录和电流钳技术更直接地检验相关模型。动态钳实验所获得的结果（图5将使用这些数据进一步优化HN模型。此处展示的动态钳基本方法可根据所研究神经元的特性进行定制，只要通过电压钳实验确定了神经元电流的数学模型，即可应用该方法。

使用尖锐微电极进行此类实验时，成功的关键在于对HN或其他神经元进行精细的穿刺，因为电极插入会抑制强烈的簇状放电活动¹。（全细胞膜片钳记录技术可最大程度减少引入的漏电流，适用于其他类型的神经元，但在医用水蛭神经元上效果不佳。）穿刺HN神经元时必须尽可能减少对细胞的损伤（避免增加漏电流），并应持续监测输入电阻，只有当其保持在60–100 MΩ范围内时，实验才能成功⁴。

动态钳是一种强大的技术，但由于神经元几何结构的限制，其应用受到制约，因为人工电导是在记录电极所在位置（通常是细胞体）实现的，而非在节律产生电流通常所在的部位⁵^,⁶^,¹⁰。在沙蚕HN神经元中，细胞体在电学上接近神经元的整合区（主神经突），而大多数活性电流正集中于此区域，并在此产生动作电位。

致谢

我们感谢Christian Erxleben对HN(7)神经元进行的初步动态钳实验，这些实验展示了它们的簇状放电能力。Angela Wenning为实验提供了专业的建议。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为1 R21 NS111355，资助对象为GSC和RLC。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
动物
Hirudo verbana	Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches		活体水蛭，2-3 克
化学试剂
人工池水
CaCl₂	Sigma Aldrich	C5670-100G	1.8 mM，调节 pH 后最后加入
葡萄糖	Sigma Aldrich	G7021-100G	10 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G	10 mM
Instant Ocean（海盐）	Spectrum Brands Inc., Madison, WI		0.05% (w/v)，溶于去离子水中
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	4 mM
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-250G	115 mM
NaOH 0.1 N 溶液	Sigma Aldrich	2105-50ML	用 NaOH 调节至 pH 7.4
微电极
乙酸钾	Sigma Aldrich	P1190-100G	2 M
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	20 mM
生理盐水
设备
#5 镊子	Fine Science Tools Dumont	11251-30 OR 11251-20	用于水蛭常规解剖
AxoClamp 2A/2B DCC 电位计	Axon Instruments Molecular Devices	2A/2B	用于记录神经元膜电位和不连续电流钳
黑色树脂	Dow Sylguard	170	用于铺垫通用解剖皿
毛细玻璃管，外径 1 mm，内径 0.75 mm	A-M Systems	615000	用于制备尖锐微电极
透明树脂	Dow Sylguard	184	用于铺垫用于电生理实验中固定神经节的培养皿
暗场聚光镜	Nikon	Dry 0.95-0.80 MBL 1210	用于细胞穿刺过程中神经节制备的照明
Digidata 1440A	Axon CNS Molecular Devices	1440A	在电生理实验中执行数据采集和刺激的模数与数模转换
数字信号处理板	dSpace	CLP1104	我们的软件在 DS1103 dSPACE PPC 控制器板上以 20 kHz 的速率实时实现模型 HN 神经元中的所有电导/电流，并通过 ControlDesk 图形用户界面（dSPACE，德国帕德博恩）进行控制
Falming/Brown 微电极拉制仪	Sutter Instruments	P-97	用于制备尖锐微电极
Fiber-Lite 高强度照明器	Dolan Jenner Industries	170D	用于通用解剖照明以及细胞穿刺过程中神经节制备的照明
AxoClamp 2A 头级放大器	Axon Instruments	HS-2A 增益：0.1LU	现属于 Molecular Devices，用于记录神经元膜电位和不连续电流钳
导光管	Dolan Jenner Industries	Rev R 38 08 3729107	用于通用解剖照明以及细胞穿刺过程中神经节制备的照明
显微操作器	Sutter Instruments	MPC-385	用于微电极穿刺细胞的显微操作
显微操作器控制器	Sutter Instruments	MPC-200	控制用于微电极穿刺细胞的显微操作器
微小固定针（Minuten pins）	BioQuip	直径 0.15 mm，1208SA	应剪短至约 5 mm
光学面包板 3' x 5' x 8"	Newport	已停产	配合下方四个气动隔振器，用于构建电生理实验的无振动工作平台
示波器	HAMEG Instruments	HM303-6	用于在 DCC 过程中监测电极稳定情况
Pascheff-Wolff 弹簧剪	Moria		由 Fine Science Tools（美国加利福尼亚州福斯特城）提供，目录号 #15371-92
pClamp 9 软件	Axon Instruments	9	现属于 Molecular Devices，使用 Digidata 1440 进行电生理实验中的数据采集和刺激
气动隔振器 28"	Newport	已停产	与光学面包板配合使用，用于构建电生理实验的无振动工作平台
Simulink / MATLAB 软件	MathWorks	2006（已停产）	在数字信号处理板上实现动态钳技术
体视显微镜	Wild	M5A	配备 10x 目镜，用于水蛭解剖及神经节的剥离和去鞘
体视显微镜	Wild	M5	配备 20x 目镜，用于电生理工作站中可视化神经元以便微电极穿刺
Student Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	91500-09	用于水蛭常规解剖

参考文献

Cymbalyuk, G. S., Gaudry, Q., Masino, M. A., Calabrese, R. L. Bursting in leech heart interneurons: cell-autonomous and network-based mechanisms. Journal of Neuroscience. 22, 10580-10592 (2002).
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重印与许可

勘误

Formal Correction: Erratum: Contribution of the Na⁺/K⁺ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses
Posted by JoVE Editors on 7/28/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contribution of the Na⁺/K⁺ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses. An author name was updated.

The name of the first author was updated from:

Ricardo Javier Erazo Toscano

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Ricardo Javier Erazo-Toscano