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方法文章

用于啮齿类动物缺血性视网膜疾病的氧诱导视网膜病变模型

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DOI：

10.3791/61482

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2020年9月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

本文内容

摘要

氧诱导的视网膜病变（OIR）可用于模拟缺血性视网膜疾病，如早产儿视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变，并可作为评估抗血管生成药物治疗新生血管疾病的概念验证研究模型。OIR 可在视网膜中诱导出显著且可重复的新生血管形成，且该过程可被定量分析。

摘要

缺血性视网膜病变的常用模型之一是氧诱导视网膜病变（OIR）模型。本文详细描述了小鼠和大鼠OIR模型的建立方法及其检测指标。在OIR模型中，通过将新生啮齿类动物暴露于高氧环境（小鼠）或交替的高氧与低氧环境（大鼠）来诱导视网膜新生血管形成。该模型的主要检测指标是视网膜新生血管（NV）区域和无血管（AVA）区域的大小。这一临床前体内模型可用于评估潜在抗血管生成药物的疗效，或利用基因修饰动物研究特定基因在视网膜血管生成中的作用。该模型在不同品系和供应商之间存在一定的OIR诱导差异，在实验设计时应予以考虑。

引言

为了研究血管生成性眼病的病理机制并开发针对这些严重疾病的新型治疗方法，需要可靠且可重复的实验模型。病理性血管生成是湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）以及多种缺血性视网膜疾病（包括早产儿视网膜病变（ROP）、增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）和视网膜静脉阻塞（RVO））的典型特征1,2,3,4。人类和啮齿类动物的视网膜发育模式相似，两者均属于最后完成血管化的组织之一。在视网膜血管系统完全发育之前，视网膜的营养供应来自玻璃体血管系统，而当视网膜血管开始发育时，玻璃体血管系统则随之退化1,2。在人类中，视网膜血管发育在出生前即已完成，而在啮齿类动物中，视网膜血管的生长则发生在出生后。由于啮齿类动物的视网膜血管发育发生在出生后，因此为研究血管生成提供了理想的模型系统2,3。新生啮齿类动物具有无血管的视网膜，该结构逐渐发育，直至出生后第三周结束时完成完整的视网膜血管化4。新生小鼠的生长中血管具有可塑性，在高氧刺激下会发生退化5。

ROP 是西方国家儿童失明的主要原因，几乎影响了出生体重低于 1,250 g 的早产儿中的 70%6,7。ROP 发生于早产儿，这些婴儿出生时视网膜血管尚未完成 其正常发育过程。ROP 的发展分为两个阶段：在第一阶段，早产导致视网膜血管生长延迟；在第二阶段，发育中视网膜未完成的血管化引发缺氧，从而诱导促血管生成生长因子的表达，刺激异常新生血管的形成8。OIR 模型已被广泛用于研究 ROP 及其他缺血性视网膜病变的病理生理机制，并用于测试新型候选药物2,3,9。该模型被普遍认为是开展潜在抗血管生成药物概念验证研究的可重复模型，适用于眼部及非眼部疾病。两种啮齿类动物模型，即小鼠和大鼠 OIR 模型，在模型诱导方式和疾病表型上有所不同。大鼠模型更准确地模拟了人类 ROP 的表型，而小鼠模型则为视网膜新生血管（NV）提供了更稳定、快速且可重复的模型。在小鼠模型中，新生血管向视网膜中央区域发展。这一病理学读数在多种缺血性视网膜病变（如 PDR、RV 和渗出性 AMD）以及非眼部血管生成性疾病（如癌症）的药理学疗效研究中具有重要意义。此外，由于存在大量可进行遗传操作（转基因和基因敲除）的小鼠品系，小鼠 OIR 模型成为更受欢迎的选择。然而，无论是小鼠还是大鼠 OIR 模型，均不产生人类疾病中常见的视网膜纤维化。

20世纪50年代认识到高氧水平可促进早产儿视网膜病变（ROP）的发生10,11 导致了动物模型的开发。关于氧气作用的首批研究 视网膜血管的研究始于1950年12,13,14 直到20世纪90年代，氧诱导视网膜病变（OIR）模型经历了多次改进。Smith等人在1994年的研究为该模型确立了标准 当前将玻璃体病变与视网膜病变分离的小鼠OIR模型15康纳等人（Connor et al.，2009）提出的方法被广泛用于量化血管消退和病理性新生血管，进一步提升了该模型的普及程度16. 在该模型中，小鼠被置于75%氧气（O2) 在P7开始持续5天，随后在常氧条件下维持5天。从P7至P12暴露于高氧环境可导致视网膜中央区域血管系统退化。当恢复至常氧条件时，无血管视网膜区域出现缺氧（图1A）。由于无血管的中央视网膜受到缺氧刺激，部分视网膜血管向玻璃体方向出芽，形成视网膜前新生血管，称为视网膜前血管簇2,3。这些血管丛未成熟且通透性过高。新生血管（NV）数量在出生后第17天（P17）达到峰值，随后开始退化。视网膜在出生后第23至25天（P23–P25）完全再血管化，新生血管完全消退。图2A)2,3.

大鼠OIR模型（使用不同浓度的O₂）2) 于20世纪90年代首次被描述，表明变化的O2 80% 和 40% 水平下的缺氧比在 80% 氧气条件下引起更显著的新生血管形成2 持续暴露17随后发现，间歇性低氧模型，即O2 从高氧（50%）循环至低氧（10-12%）的条件比80/40%氧浓度循环引发更显著的新生血管形成2 模型18在50/10%模型中，新生大鼠先暴露于50%氧气环境中24小时，随后转入10%氧气环境中继续暴露24小时。2这些循环持续至P14，随后将大鼠幼崽恢复至常氧条件（图1B）。与人类早产儿视网膜病变（ROP）患者相似，在大鼠模型中，由于视网膜血管丛发育不成熟，无血管区会向视网膜周边部扩展图3).

在这两种模型中，通常量化的关键参数是新生血管面积（AVA）和新生血管（NV）的大小。这些参数通常通过视网膜铺片进行分析，其中血管内皮细胞被标记4,16。此前，通过计数穿过内界膜延伸至玻璃体的血管或血管细胞核的数量，来评估视网膜前新生血管的量。该方法的主要局限性在于无法对新生血管面积（AVA）进行量化。

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方案

本方案已获得芬兰国家动物伦理委员会批准（方案编号：ESAVI/9520/2020 和 ESAVI/6421/04.10.07/2017）。

1. 实验动物与小鼠氧诱导视网膜病变模型的建立

注意：使用配型时间一致的动物，例如常用的 C57BL/6J 小鼠，以获得同一天出生的仔鼠。使用代乳母鼠，例如 129 品系（129S1/SvImJ 或 129S3/SvIM）的哺乳期母鼠，在高氧暴露诱导期间及之后哺育仔鼠。或者，确保有额外的哺乳期母鼠备用，以防因母鼠疲劳需要更换。当使用 C57BL/6J 小鼠/母鼠时，每只母鼠哺育的仔鼠数量应限制在 6–7 只（若窝仔数超过此范围，仔鼠体重增长通常会受限）16。

  1. 记录动物在高氧暴露前、高氧暴露后以及处死时的体重。
  2. 确保笼底有足够的食物，以便母鼠能方便地取食。
  3. 在腔室底部加入含指示剂的钠石灰，以吸收多余的 CO2 当未使用过滤系统时。
  4. 监测培养室内的湿度和温度，将湿度维持在40%至65%之间。必要时，可通过在培养室底部放置盛水的培养皿（如Petri培养皿）来提高湿度。
  5. 校准 O2 传感器，含100% O2 和正常室温空气。
  6. 将P7小鼠放入密闭室并设置O2 水平调至75%。将小鼠置于舱内5天，直至P12。在高氧诱导期间避免打开舱室。检查氧气的气体压力2 气瓶并在需要时更换气瓶。在诱导过程中监测动物。
  7. 将小鼠笼子从饲养箱中取出，称量所有仔鼠的体重。根据体重对仔鼠进行分组，使各实验组内仔鼠的体重分布相似。

2. 实验动物与大鼠氧诱导视网膜病变模型的建立（使用半封闭系统）

注意：使用同期交配的动物以获得同一天出生的幼鼠。对于大鼠氧诱导视网膜病变（OIR）模型，应增加每窝幼崽数量，约为每只母鼠18只幼崽，以在大鼠模型中获得足够的新生血管诱导。将多个窝的幼崽合并，以确保每组有足够的幼崽数量。

  1. 在诱导前、诱导后以及处死时记录动物的体重。
  2. 确保笼底有足够的食物，以便母鼠能够方便地获取食物。
  3. 当未使用过滤系统时，在舱底加入带有颜色指示剂的钠石灰，以吸收过量的 CO2。
  4. 监测舱内的湿度和温度。通过在舱底添加硅胶来吸收因多只大鼠产生的额外湿气。
  5. 使用 100% N2 和正常室内空气校准 O2 传感器。
  6. 在 P0（出生后数小时内）将大鼠放入舱内。将 O2 浓度设定为 50%，并将氧气（O2）气瓶连接至舱内持续 24 小时。之后，将设置切换为 10% O2，并将氮气（N2）气瓶连接至舱内持续 24 小时。在 14 天内持续进行 50% 与 10% O2 浓度之间的 24 小时循环。
  7. 在实验期间监测气体消耗情况及动物的健康状况。在切换 50%/10% O2 条件时打开舱体，根据需要补充食物和水。在诱导过程中将动物笼具更换为清洁的笼具。
  8. 将大鼠笼具从舱内取出，称量所有仔鼠体重。根据体重对仔鼠进行分组，使各实验组中仔鼠的体重分布相似。

3. 药物给药（可选）

注意：氧诱导视网膜病变（OIR）模型中常用的给药途径为玻璃体内注射（ivt），小鼠在出生后12至14天（P12-P14）进行，大鼠在出生后14天（P14）进行。具体治疗时间应根据实验设计确定。当实验中使用多个窝的幼崽时，应将各窝动物均分配至各个处理组中。建议仅对单眼注射药物，对侧眼作为对照。

  1. 称重动物，并在尾部和/或耳朵上做识别标记 。
  2. 使用注射麻醉剂（例如，氯胺酮和美托咪啶混合物，小鼠剂量分别为30 mg/kg和0.4 mg/kg）或吸入麻醉（异氟烷浓度为2–3.5%，气流速度为200–350 mL/min）对动物进行麻醉。通过夹捏脚趾检查麻醉深度。处理过程中将动物置于加热垫上。
  3. 局部麻醉时，在眼睑上滴加一滴镇痛剂。进行玻璃体内注射（ivt）前，用镊子小心打开眼睑，因为小鼠和大鼠约在出生后第14天（P14）开始睁眼。在角膜上滴加一滴镇痛剂（例如盐酸奥布卡因）。
  4. 进行玻璃体内注射前，先滴加一滴碘溶液。
  5. 玻璃体内注射时使用连接33–34 G针头的玻璃注射器。下压眼睑，用镊子夹住眼球。从角膜缘后方进针，针头与眼球表面呈约45°角，方向朝向视神经。
  6. 避免向玻璃体腔内注射超过1.0 µL 的液体。注射药物后，保持针头留置30秒，以防止注射液反流。
  7. 拔出针头后，检查眼睛是否有并发症（例如出血或视网膜损伤），可使用检眼镜进行观察。注射完成后，在角膜表面涂抹抗生素软膏。
    注意：小鼠玻璃体内注射体积应为0.5 – 1.0 µL。
  8. 使用拮抗剂逆转麻醉作用（例如，使用α2-受体拮抗剂逆转美托咪啶的作用，剂量为2.5 mg/kg），然后将幼鼠放回笼中。在实验结束前，按常规方式饲养同窝幼鼠。

4. 体内成像与视网膜电图检测（可选）

  1. 如有需要，可在随访期间对活体动物进行活体成像，以记录视网膜在血管生成反应过程中发生的变化。例如，采用荧光素眼底血管造影（FA）或扫描激光共聚焦显微镜19 观察血管结构（图4）；使用谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）在活体内观察视网膜层次结构（图4）。
  2. 如有需要，可通过视网膜电图（ERG）检测OIR诱导后不同视网膜细胞群体的功能变化（图5）。

5. 组织采集与视网膜平铺片制备

注意：根据所需的研究假设收集组织。对于小鼠，例如可在P12（研究高氧阶段后的血管闭塞）或缺氧期（P13-P17）采集样本。在P17采集小鼠氧诱导视网膜病变（OIR）样本，这是最常用的取样时间点，用于检测新生血管（NV）数量的峰值。在大鼠OIR模型中，于P18-P21采集样本以观察到最显著的新生血管量（图3）。

  1. 采样前称量动物体重。
  2. 为了标记视网膜血管系统，可对深度麻醉的动物进行经心脏灌注FITC-葡聚糖。（或者，之后可使用异凝集素对视网膜平铺片进行染色）。
  3. 通过过量麻醉药物（例如，小鼠使用300 mg/kg氯胺酮和4 mg/kg美托咪啶的混合物）或吸入CO2的方式处死动物。
  4. 用弯头镊子夹住眼球后部，剪除眼球周围组织，将眼球从眼眶中取出。
  5. 将眼球置于新配制并过滤的4%多聚甲醛（溶于磷酸盐缓冲液PBS中）中固定1–4小时。去除固定液后，用PBS洗涤眼球3次，每次10分钟。立即解剖视网膜，或将其保存在+4 °C的PBS中。
    注意：多聚甲醛经吸入、皮肤接触或吞咽具有毒性。使用前请仔细阅读安全数据表。
    备注：若需制备完整眼球的横切片，在采样或组织处理的任何阶段均不得对眼球施加压力，以避免视网膜脱离。
  6. 制备视网膜平铺片以定量新生血管（NV）的数量和动静脉吻合处（AVA）的大小。或者，可将眼球/视网膜用于组织学、RNA或蛋白质分析。在体视显微镜下使用显微剪刀和镊子解剖视网膜。
    1. 将眼球置于PBS中保持湿润，用针头（23G）在角巩膜缘处刺破眼球，再用弯头显微剪刀沿角巩膜缘剪开，去除虹膜和角膜。
    2. 小心将剪刀尖插入巩膜与视网膜之间，沿视神经方向剪开巩膜。对眼球另一侧进行相同操作，并小心剪开或撕开巩膜，直至暴露视网膜杯状结构。将晶状体从视网膜杯中取出，并向杯内加入PBS。
    3. 在不损伤视网膜的前提下，彻底清除玻璃体血管、玻璃体及碎片。向视网膜杯中加入PBS清洗视网膜。使用直头显微剪刀在视网膜的12点、3点、6点和9点位置做四个切口，形成类似花朵的结构。如需要，可在样本封片前先用手术刀完成切口。使用软毛画笔将视网膜转移至培养板中进行染色。
  7. 使用异凝集素B4标记视网膜血管系统，该试剂可染色内皮细胞表面（适用于未进行FITC-葡聚糖灌注的动物）。将视网膜在封闭缓冲液（TBS中含10%正常山羊血清NGS和0.5% Triton）中孵育1小时，随后用TBS中含1% NGS和0.1% Triton的溶液洗涤10分钟。再将视网膜置于含荧光标记的异凝集素B4（5–10 µg/mL）的TBS溶液（含1% NGS和0.1% Triton）中，在+4 °C避光条件下过夜孵育。
    备注：如需要，可使用特异性抗体对其他细胞（如炎症细胞和周细胞）进行标记。
  8. 用含1% NGS和0.1% Triton的TBS溶液洗涤视网膜3次，每次10分钟。用软毛画笔将视网膜转移至载玻片上，确保内层视网膜朝上。小心展开视网膜，去除残留的玻璃体血管或碎片。在盖玻片上滴加封片剂，覆盖于视网膜上。将样本置于+4 °C保存，并避光。

6. 平铺样品的分析

  1. 使用10倍物镜的荧光显微镜拍摄视网膜平铺片的图像。聚焦于浅层血管丛和视网膜前新生血管。进行多视野拼接扫描以捕获整个视网膜，并将各图像拼接合并。
  2. 使用图像处理软件（参见材料表）对图像进行定量分析，测量无血管区（AVA）、新生血管（NV）面积以及视网膜总面积。
    1. 使用手绘工具勾画无血管区和视网膜总面积，使用选择工具选中新血管区域。软件将以像素为单位测量感兴趣区域，通过将AVA和NV面积（以像素表示）与视网膜总面积进行比较，计算其百分比。此外，也可使用一些专门的软件工具对新生血管进行定量分析。
      注意：近年来已推出基于深度学习神经网络的开源全自动程序 ，可用于OIR图像关键参数的定量分析，为视网膜AVA和NV的可重复定量提供了可靠工具（例如：https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64）20,21。
  3. 若使用抗体对特定细胞群体进行免疫组织化学检测，可通过手动或自动图像分析系统（根据需要）对视网膜平铺片中染色细胞的数量（如小胶质细胞，图2B）进行定量。

7. 统计学

  1. 根据数据情况，采用 Student's t 检验或单因素方差分析（One-Way ANOVA），并随后进行 Dunnett's 或 Tukey's 多重比较检验来分析正态分布的数据。对于非正态分布的数据，使用非参数检验方法，如 Mann-Whitney U 检验或 Kruskal-Wallis 检验。当 P < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。

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结果

该模型的主要结果是血管表型：即动静脉吻合支（AVA）的大小和新生血管（NV）的数量。在小鼠氧诱导视网膜病变（OIR）模型中，血管闭塞发生在视网膜中央区域（图2A），而在大鼠模型中则发生在视网膜周边区域，即类似于人类早产儿视网膜病变（ROP）22（图3A）。这是因为小鼠在暴露于高氧环境时，其视网膜浅层血管丛已经发育；而在大鼠模型中，视网膜在OIR诱导时（P0）仍处于无血管状态。视网膜前新生血管形成于无血管区域附近，即小鼠位于视网膜中央，大鼠则位于周边区域（图2A 和 图3A）。

可利用视网膜的横切面或平铺片进行组织学分析，以评估氧诱导视网膜病变（OIR）模型中视网膜的形态学改变，或检测特定细胞类型（例如炎性细胞）的存在情况（图2B）。除视网膜...

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讨论

在小鼠和大鼠的氧诱导视网膜病变（OIR）模型中，疾病表型的严重程度不仅取决于品系，甚至受供应商影响23。这表明在病理发展过程中存在广泛的基因型变异。通常情况下，有色大鼠比白化大鼠表现出更严重的表型。例如，白化BALB/c小鼠的视网膜血管在高氧暴露后能迅速再血管化，且完全不发生新生血管（NV）24。同样，在大鼠中，有色的Brown Norway大鼠比白化的Sprague Dawley（SD）大鼠表现出更严重的病理变化25。SD大鼠是常用的品系，但在该品系中也已报道存在供应商相关的OIR表型差异。例如，来自Charles River的SD大鼠产生的新生血管显著多于来自Harlan或Zivic-Miller的SD大鼠23。而C3H/HeJ小鼠由于携带视网膜变性1（Rd1）基因的突变 ，其视网膜较薄，且不发生新生血管26。由于上述原因以及转基因小鼠品系的可获得性，近交系C57BL/...

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披露

作者 Maria Vähätupa（博士）、Niina Jääskeläinen、Marc Cerrada-Gimenez（博士）和 Rubina Thapa 是 Experimentica Ltd. 的员工。

作者 Giedrius Kalesnykas 博士是 Experimentica Ltd. 的雇员（总裁兼首席执行官）及股东，该公司提供利用本文章中所用的临床前 OIR 模型的合同研究服务。

Tero Järvinen，医学博士，哲学博士，以及 Hannele Uusitalo-Järvinen，医学博士，哲学博士，无任何利益冲突披露。

致谢

感谢Marianne Karlsberg、Anne Mari Haapaniemi、Päivi Partanen和Anne Kankkunen提供的出色技术支持。本工作由芬兰科学院、Päivikki和Sakari Sohlberg基金会、坦佩雷结核病基金会、芬兰医学基金会、皮尔坎马医院区研究基金会以及坦佩雷大学医院研究基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
33 号小柄 RN 针头Hamilton Company7803-05, 10mm, 25°, PS4用于玻璃体内注射
Adobe PhotoshopAdobe Inc.用于图像分析
气泵 air100Eheim GmbH & Co. KG.143207用于吸入麻醉
麻醉仪 410 APUniventor Ltd.2360309用于吸入麻醉
AnalaR NORMAPUR 钠石灰VWR International Ltd22666.362用于模型诱导期间的 CO₂ 控制
Attane Vet 1000 mg/gVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 17 05 79用于吸入麻醉
刷子用于制备平铺标本
二氧化碳气体用于安乐死
Celeris D430 ERG 系统Diagnosys LLC121用于 in vivo ERG
细胞培养皿Greiner Bio-One International GmbH664 160用于制备平铺标本
Cepetor Vet 1 mg/mLVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 08 78 96用于麻醉
盖玻片Thermo Fisher Scientific15165452用于制备平铺标本
O₂ 控制 InVivo 柜、动物过滤系统和除湿机Coy Laboratory Products用于疾病模型诱导的封闭系统，可选用于半封闭系统
E702 O₂ 传感器BioSphenix, Ltd.E207, 1801901用于氧浓度测量
Envisu R2200 谱域光学相干断层扫描仪（SD-OCT）Bioptigen, Inc.BPN000668用于 in vivo 成像
眼球穿刺针Beaver-Visitec International, Inc.0008685用于玻璃体内注射和 in vivo 成像
Flexilux 600LL 冷光源Mikron11140用于玻璃体内注射或组织采集
荧光素钠盐Merck KGaAF6377-100G用于 in vivo 成像
废气排放装置（含双三通阀、小鼠和大鼠面罩、UNOsorb 滤芯）UNO Roestvaststaal BVGEX 17015249用于吸入麻醉
玻璃注射器，型号 65 RNHamilton Company7633-01用于玻璃体内注射
HRA2 视网膜血管造影仪（FA）Heidelberg Engineering GmbHSpec-KT-05488用于 in vivo 成像
凝集素 GS-IB4，Alexa Fluor 488 标记物Thermo Fisher ScientificI21411用于平铺标本上视网膜血管的标记
Ketaminol Vet 50 mg/mLIntervet International B.V.vnr 51 14 85用于麻醉
医用氧气气体用于疾病模型诱导
小鼠 C57BL/6JRjJanvier Labs也可使用其他品系
显微镜载玻片Thermo Fisher ScientificJ1800AMNZ用于制备平铺标本
聚维酮碘 5% 单剂量制剂（单位）Bausch & Lomb U.K Limitedvnr 24 11 304用于玻璃体内注射
氮气用于疾病模型诱导（大鼠）
Oftan Chlora 10 mg/gSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 01 11用于玻璃体内注射
Oftan Metaoksedrin 100 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 43用于 in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 50用于玻璃体内注射
Oftan Tropicamid 5 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 04 12 36用于 in vivo 成像
ProOx Model 110 氧气控制器及动物舱BioSphenix, Ltd.803用于疾病模型诱导，适用于半封闭系统，可选用于封闭系统
ProOx Model P360 氧气控制器及动物舱BioSphenix, Ltd.538用于疾病模型诱导，适用于半封闭系统，可选用于封闭系统
大鼠 CD(SD)Charles River Laboratories也可使用其他品系
Revertor 5 mg/mLVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 13 04 97用于麻醉逆转
硅胶用于模型诱导期间的湿度控制
Systane Ultra 10mlAlconTamro 2050250用于眼部保湿
Systane Ultra 单剂量制剂 0.7mlAlconTamro 2064871用于眼部保湿
移液管Thermo Fisher Scientific1343-9108用于制备平铺标本
VENTI-Line VL 180 PRIME 干燥箱VWRVL180S 170301用于干燥硅胶
VisiScope SZT350 体视显微镜VWR481067用于玻璃体内注射或组织采集

参考文献

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用于啮齿类动物缺血性视网膜疾病的氧诱导视网膜病变模型
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