氧诱导的视网膜病变（OIR）可用于模拟缺血性视网膜疾病，如早产儿视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变，并可作为评估抗血管生成药物治疗新生血管疾病的概念验证研究模型。OIR 可在视网膜中诱导出显著且可重复的新生血管形成，且该过程可被定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
缺血性视网膜病变的常用模型之一是氧诱导视网膜病变（OIR）模型。本文详细描述了小鼠和大鼠OIR模型的建立方法及其检测指标。在OIR模型中，通过将新生啮齿类动物暴露于高氧环境（小鼠）或交替的高氧与低氧环境（大鼠）来诱导视网膜新生血管形成。该模型的主要检测指标是视网膜新生血管（NV）区域和无血管（AVA）区域的大小。这一临床前体内模型可用于评估潜在抗血管生成药物的疗效，或利用基因修饰动物研究特定基因在视网膜血管生成中的作用。该模型在不同品系和供应商之间存在一定的OIR诱导差异，在实验设计时应予以考虑。
引言
为了研究血管生成性眼病的病理机制并开发针对这些严重疾病的新型治疗方法，需要可靠且可重复的实验模型。病理性血管生成是湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）以及多种缺血性视网膜疾病（包括早产儿视网膜病变（ROP）、增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）和视网膜静脉阻塞（RVO））的典型特征1,2,3,4。人类和啮齿类动物的视网膜发育模式相似，两者均属于最后完成血管化的组织之一。在视网膜血管系统完全发育之前，视网膜的营养供应来自玻璃体血管系统，而当视网膜血管开始发育时，玻璃体血管系统则随之退化1,2。在人类中，视网膜血管发育在出生前即已完成，而在啮齿类动物中，视网膜血管的生长则发生在出生后。由于啮齿类动物的视网膜血管发育发生在出生后，因此为研究血管生成提供了理想的模型系统2,3。新生啮齿类动物具有无血管的视网膜，该结构逐渐发育，直至出生后第三周结束时完成完整的视网膜血管化4。新生小鼠的生长中血管具有可塑性，在高氧刺激....
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方案
本方案已获得芬兰国家动物伦理委员会批准（方案编号：ESAVI/9520/2020 和 ESAVI/6421/04.10.07/2017）。
1. 实验动物与小鼠氧诱导视网膜病变模型的建立
注意：使用配型时间一致的动物，例如常用的 C57BL/6J 小鼠，以获得同一天出生的仔鼠。使用代乳母鼠，例如 129 品系（129S1/SvImJ 或 129S3/SvIM）的哺乳期母鼠，在高氧暴露诱导期间及之后哺育仔鼠。或者，确保有额外的哺乳期母鼠备用，以防因母鼠疲劳需要更换。当使用 C57BL/6J 小鼠/母鼠时，每只母鼠哺育的仔鼠数量应限制在 6–7 只（若窝仔数超过此范围，仔鼠体重增长通常会受限）16。
- 记录动物在高氧暴露前、高氧暴露后以及处死时的体重。
- 确保笼底有足够的食物，以便母鼠能方便地取食。
- 在腔室底部加入含指示剂的钠石灰，以吸收多余的 CO2 当未使用过滤系统时。
- 监测培养室内的湿度和温度，将湿度维持在40%至65%之间。必要时，可通过在培养室底部放置盛水的培养皿（如Petri培养皿）来提高湿度。
- 校准 O2 传感器，含100% O2 和正常室温空气。
- 将P7小鼠放入密闭室并设置O
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结果
该模型的主要结果是血管表型：即动静脉吻合支（AVA）的大小和新生血管（NV）的数量。在小鼠氧诱导视网膜病变（OIR）模型中，血管闭塞发生在视网膜中央区域（图2A），而在大鼠模型中则发生在视网膜周边区域，即类似于人类早产儿视网膜病变（ROP）22（图3A）。这是因为小鼠在暴露于高氧环境时，其视网膜浅层血管丛已经发育；而在大鼠模型中，视网膜在OIR诱导时（P0）仍处于无血管状态。视网膜前新生血管形成于无血管区域附近，即小鼠位于视网膜中央，大鼠则位于周边区域（图2A 和 图3A）。
可利用视网膜的横切面或平铺片进行组织学分析，以评估氧诱导视网膜病变（OIR）模型中视网膜的形态学改变，或检测特定细胞类型（例如炎性细胞）的存在情况（图2B）。除视网膜.......
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讨论
在小鼠和大鼠的氧诱导视网膜病变（OIR）模型中，疾病表型的严重程度不仅取决于品系，甚至受供应商影响23。这表明在病理发展过程中存在广泛的基因型变异。通常情况下，有色大鼠比白化大鼠表现出更严重的表型。例如，白化BALB/c小鼠的视网膜血管在高氧暴露后能迅速再血管化，且完全不发生新生血管（NV）24。同样，在大鼠中，有色的Brown Norway大鼠比白化的Sprague Dawley（SD）大鼠表现出更严重的病理变化25。SD大鼠是常用的品系，但在该品系中也已报道存在供应商相关的OIR表型差异。例如，来自Charles River的SD大鼠产生的新生血管显著多于来自Harlan或Zivic-Miller的SD大鼠23。而C3H/HeJ小鼠由于携带视网膜变性1（Rd1）基因的突变 ，其视网膜较薄，且不发生新生血管26。由于上述原因以及转基因小鼠品系的可获得性，近交系C57BL/.......
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披露
作者 Maria Vähätupa（博士）、Niina Jääskeläinen、Marc Cerrada-Gimenez（博士）和 Rubina Thapa 是 Experimentica Ltd. 的员工。
作者 Giedrius Kalesnykas 博士是 Experimentica Ltd. 的雇员（总裁兼首席执行官）及股东，该公司提供利用本文章中所用的临床前 OIR 模型的合同研究服务。
Tero Järvinen，医学博士，哲学博士，以及 Hannele Uusitalo-Järvinen，医学博士，哲学博士，无任何利益冲突披露。
致谢
感谢Marianne Karlsberg、Anne Mari Haapaniemi、Päivi Partanen和Anne Kankkunen提供的出色技术支持。本工作由芬兰科学院、Päivikki和Sakari Sohlberg基金会、坦佩雷结核病基金会、芬兰医学基金会、皮尔坎马医院区研究基金会以及坦佩雷大学医院研究基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 33 号小柄 RN 针头 | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | 用于玻璃体内注射 |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | 用于图像分析 | |
| 气泵 air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | 用于吸入麻醉 |
| 麻醉仪 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | 用于吸入麻醉 |
| AnalaR NORMAPUR 钠石灰 | VWR International Ltd | 22666.362 | 用于模型诱导期间的 CO₂ 控制 |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | 用于吸入麻醉 |
| 刷子 | 用于制备平铺标本 | ||
| 二氧化碳气体 | 用于安乐死 | ||
| Celeris D430 ERG 系统 | Diagnosys LLC | 121 | 用于 in vivo ERG |
| 细胞培养皿 | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | 用于制备平铺标本 |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | 用于麻醉 |
| 盖玻片 | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | 用于制备平铺标本 |
| O₂ 控制 InVivo 柜、动物过滤系统和除湿机 | Coy Laboratory Products | 用于疾病模型诱导的封闭系统，可选用于半封闭系统 | |
| E702 O₂ 传感器 | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | 用于氧浓度测量 |
| Envisu R2200 谱域光学相干断层扫描仪（SD-OCT） | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | 用于 in vivo 成像 |
| 眼球穿刺针 | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | 用于玻璃体内注射和 in vivo 成像 |
| Flexilux 600LL 冷光源 | Mikron | 11140 | 用于玻璃体内注射或组织采集 |
| 荧光素钠盐 | Merck KGaA | F6377-100G | 用于 in vivo 成像 |
| 废气排放装置（含双三通阀、小鼠和大鼠面罩、UNOsorb 滤芯） | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | 用于吸入麻醉 |
| 玻璃注射器，型号 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | 用于玻璃体内注射 |
| HRA2 视网膜血管造影仪（FA） | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | 用于 in vivo 成像 |
| 凝集素 GS-IB4，Alexa Fluor 488 标记物 | Thermo Fisher Scientific | I21411 | 用于平铺标本上视网膜血管的标记 |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | 用于麻醉 |
| 医用氧气气体 | 用于疾病模型诱导 | ||
| 小鼠 C57BL/6JRj | Janvier Labs | 也可使用其他品系 | |
| 显微镜载玻片 | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | 用于制备平铺标本 |
| 聚维酮碘 5% 单剂量制剂（单位） | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | 用于玻璃体内注射 |
| 氮气 | 用于疾病模型诱导（大鼠） | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | 用于玻璃体内注射 |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | 用于 in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | 用于玻璃体内注射 |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | 用于 in vivo 成像 |
| ProOx Model 110 氧气控制器及动物舱 | BioSphenix, Ltd. | 803 | 用于疾病模型诱导，适用于半封闭系统，可选用于封闭系统 |
| ProOx Model P360 氧气控制器及动物舱 | BioSphenix, Ltd. | 538 | 用于疾病模型诱导，适用于半封闭系统，可选用于封闭系统 |
| 大鼠 CD(SD) | Charles River Laboratories | 也可使用其他品系 | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | 用于麻醉逆转 |
| 硅胶 | 用于模型诱导期间的湿度控制 | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | 用于眼部保湿 |
| Systane Ultra 单剂量制剂 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | 用于眼部保湿 |
| 移液管 | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | 用于制备平铺标本 |
| VENTI-Line VL 180 PRIME 干燥箱 | VWR | VL180S 170301 | 用于干燥硅胶 |
| VisiScope SZT350 体视显微镜 | VWR | 481067 | 用于玻璃体内注射或组织采集 |
参考文献
- Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
- Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of....
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