本文介绍了一种磷酸化蛋白质组学方法，即基于停止-洗脱提取尖端的磷酸化蛋白质组学技术，可实现高通量且深度覆盖的 拟南芥 磷酸化蛋白质组。该方法阐明了渗透胁迫信号传导的总体概况 拟南芥
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摘要
摘要
在渗透胁迫条件下，蛋白质磷酸化对酶活性和基因表达的调控至关重要。基于质谱（MS）的磷酸化蛋白质组学已彻底改变了植物信号转导的研究方式。然而，由于需要大量起始材料以及长时间的质谱检测才能实现较深的覆盖深度，限制了对植物全磷酸化蛋白质组动态变化进行高通量研究的应用。为了提高植物磷酸化蛋白质组学的灵敏度和通量，我们开发了一种基于停止-洗脱提取（stage tip）技术并结合串联质谱标签（TMT）标记的磷酸化蛋白质组学方法，用于快速、全面地分析植物在渗透胁迫下的磷酸化变化。该方法充分利用了stage tip技术操作简便和高通量的特点，整个流程使用两个tip仅需约一小时即可完成磷酸肽的富集、分级和样品纯化步骤，显示出该方法易于使用且效率高。该方法不仅实现了深度的植物磷酸化蛋白质组分析（> 11,000个磷酸肽鉴定），还表现出优异的分级分离效率（相邻组分间的重叠率 < 5%）。此外，通过TMT标记实现了多重检测，用于定量野生型和snrk2十重突变体植物的磷酸化蛋白质组变化。该方法已成功应用于揭示Raf样激酶在渗透胁迫下的磷酸化事件，为理解陆生植物早期渗透信号通路提供了新的见解。
引言
高盐、低温和干旱会引起渗透胁迫，这是影响植物生产力的主要环境因素1,2。蛋白质磷酸化是植物响应渗透胁迫过程中介导信号感知与转导的最重要翻译后修饰之一3,4,5。SNF1相关蛋白激酶2（SnRK2s）参与渗透胁迫信号通路6。SnRK2家族的十个成员中有九个在渗透胁迫下表现出显著激活7,8。在所有十个SnRK2基因均发生突变的snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10十重（snrk2-dec）突变体中，植物对渗透胁迫表现出超敏感性。在snrk2-dec突变体中，渗透胁迫诱导的肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）积累、脱落酸（ABA）生物合成以及基因表达均显著降低，凸显了SnRK2s在渗透胁迫响应中的关键作用6。然而，SnRK2激酶如何调控这些生物学过程仍不清楚。分析渗透胁迫下磷酸化蛋白质组的动态变化是填补这一空白、阐明植物中渗透胁迫触发的防御机....
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方案
1. 样品制备
- 用铝箔采集对照组和胁迫处理的幼苗（1 g），并用液氮速冻样品。
注意：通常从两周大的幼苗中获得的蛋白浓度高于成熟植株。1 g 幼苗可产生约 10 mg 蛋白裂解液，足以用于质谱分析。步骤 1 中所有离心步骤均在 16,000 x g 条件下进行。 - 使用装有液氮的研钵和研杵将冷冻的幼苗研磨成细粉。
- 向研钵中加入 1 mL 裂解缓冲液（含 6 M 盐酸胍的 100 mM Tris-HCl，pH 8.5），并加入 10 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）、40 mM 2-氯乙酰胺（CAA）、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物），用研杵辅助混匀。
- 将植物裂解液转移至 1.5 mL 离心管中，在 95 °C 加热 5 分钟。
- 将离心管置于冰上 10 分钟。在冰上超声处理 10 秒，暂停 10 秒，重复三次。
- 离心 20 分钟，取 150 µL 植物裂解液分装至 1.5 mL 离心管中。
- 向离心管中加入 600 µL 100% 甲醇。涡旋混匀后离心沉淀。
- 向离心管中加入 150 µL 100% 氯仿。涡旋混匀后离心沉淀。
- 向离心管中加入 450 µL ddH2O。涡旋混匀后离心 3 分钟。
- 弃去上层水相。向离心管中加入 600 µL 100% 甲醇。离心 3 分钟后弃....
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结果
为了展示该工作流程的性能，我们利用IMAC阶段尖端富集结合Hp-RP阶段尖端分级分离，检测了野生型和snrk2-dec突变体幼苗在有或无甘露醇处理30分钟后的磷酸化蛋白质组变化。每个样本均设置三个生物学重复，实验流程如图1所示。每个样本的消化后肽段（400 µg）用一个TMT-6plex通道标记，混合后进行脱盐。使用IMAC阶段尖端进一步富集磷酸化肽段，纯化的磷酸化肽段随后通过Hp-RP阶段尖端分离为八个组分。每个组分均采用90分钟的液相色谱梯度进行分析。原始数据文件通过搜索引擎在Arabidopsis thaliana数据库中进行检索。
共鉴定出 11,077 条独特的磷酸化肽段，对应于 3,630 种磷酸化蛋白，包含 6,852 个定位明确的磷酸化位点（I 类，定位概率 > 0.75）。 > 0.75），表明其覆盖范围广泛 拟南芥 磷酸化蛋白质组。从野生型和 snrk2-dec 突变样本。这说明了该工作流程在提供深入覆盖以阐明信号转导全局视图.......
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讨论
植物蛋白质组和磷酸化蛋白质组的动态范围和复杂性仍然是限制磷酸化蛋白质组学分析深度的因素。尽管单次液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）分析已能够鉴定出超过10,000个磷酸化位点21,22，但对整个植物磷酸化蛋白质组的覆盖仍有限。因此，迫切需要一种具有高灵敏度和优异分离效率的磷酸化蛋白质组学工作流程，以全面描绘植物在响应环境胁迫时的信号转导网络。基于商用高压液相色谱（HPLC）柱的色谱技术是质谱分析前降低肽段复杂性的常用方法23,24。然而，HPLC方法在灵敏度和通量方面面临样品收集步骤繁琐以及洗脱体积较大的主要挑战。StageTip是一种可用于实现肽段预分级或富集的替代方法，适用于高灵敏度和高通量的研究。这种结合了同重标记、磷酸肽富集与分级的新磷酸化蛋白质组学工作流程，相较于其他磷酸化蛋白质组学方法，能够实现更全面的覆盖和更深的检测深度25,<.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到中国科学院战略性先导科技专项（XDB27040106）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind，1.5 mL，PCR 洁净，无色，100 支 |
| 200 µL 吸头 | Gilson | F1739311 | |
| 2-氯乙酰胺 | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| 氢氧化铵 | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| 磷酸二氢铵 | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 平头针头 | Hamilton | 90516 | Kel-F 接头（KF），3 型针尖，16 号规格 |
| C18-AQ 填料 | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore 萃取盘 | 3 M | 2214 | 47 mm |
| 离心机 | eppendorf | 22620444 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| 数据分析软件 | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | ||
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| 筛板 | Agilent | 12131024 | SPE 小柱用筛板 |
| 盐酸胍 | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 三氯化铁 | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| 纳米液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA 离心柱 | Qiagen | 31014 | |
| 月桂酰肌氨酸钠 | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| 推杆 | Hamilton | 1122-01 | 适用于 1702 型（25 μl）的 N、RN、LT、LTN 型推杆组件 |
| 搜索引擎软件 | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK 小柱 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| 真空离心浓缩仪 | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| 三乙基碳酸氢铵缓冲液 | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 三氟乙酸 | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| 三(2-羧乙基)膦盐酸盐 | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris 盐酸盐 | Sigma-Aldrich | T3253 |
参考文献
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperatur....
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重印与许可
