直接耦合视网膜电图（DC-ERG）记录小鼠视网膜色素上皮光诱发的电反应

摘要

本文介绍了一种利用直流视网膜电图（DC-ERG）技术记录小鼠视网膜色素上皮（RPE）光诱发电反应的方法，该技术由 Marmorstein、Peachey 及其同事于21世纪初首次描述。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）是一种特化的单层细胞，位于视网膜与脉络膜毛细血管之间，在维持光感受器的整体健康和结构完整性方面具有关键作用。RPE具有极性，其顶端和基底端分别分布有受体或通道，能够进行水、离子、代谢物的定向转运，并分泌多种细胞因子。

可以使用直接耦合的视网膜电图（DC-ERG）对体内视网膜色素上皮（RPE）功能进行无创测量。DC-ERG 的方法最初由 Marmorstein、Peachey 及其同事采用定制的刺激记录系统开发，随后在商用系统上得以实现。该技术使用充满 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）的玻璃毛细管，测量由光感受器活动引起的视网膜下腔浓度变化所诱发的 RPE 较慢的电生理反应。由于 DC-ERG 采用长时间光刺激且记录周期较长，容易受到漂移和噪声干扰，导致可用记录的数据产出率较低。本文介绍一种快速、可靠的方法，通过施加真空压力减少或消除 HBSS 和电极支架中因脱气产生的气泡，从而提高记录的稳定性并降低噪声。此外，通过使用电压调节器/电源净化器来衰减电源线干扰。我们提供了商用 ERG 系统所需的光刺激方案，以及用于分析 DC-ERG 各组分（包括 c 波、快速振荡、光峰和关反应）的分析脚本。由于记录操作更简便且分析流程快速，该简化方案特别适用于测量 RPE 功能的年龄相关变化、疾病进展以及药理学干预效果的评估。

引言

视网膜色素上皮（RPE）是一层特化的单层细胞，排列在眼球后段，对维持视网膜稳态具有关键作用¹。RPE通过视觉循环过程再生光感受器捕获光子的视觉色素²，参与吞噬脱落的外节顶端的昼夜节律性过程³，以及在光感受器与脉络膜毛细血管之间转运营养物质和代谢产物^4,5，从而支持光感受器功能。RPE功能异常是多种人类视网膜疾病的基础，例如年龄相关性黄斑变性⁶、Leber先天性黑蒙^7,8和Best卵黄样黄斑营养不良⁹。由于供体眼组织通常难以仅用于研究目的而获得，因此具有基因修饰的动物模型可为研究视网膜疾病的发生提供替代途径^10,11。此外，CRISPR cas9技术的发展与应用现在能够在一步简单流程中实现基因组的插入（knock-in）或删除（knock-out），突破了先前基因靶向技术的局限性¹²。新型小鼠模型数量的迅速增加¹³迫切需要一种更高效的记录方案，以无创方式评估RPE功能。

通过使用直接耦合视网膜电图（DC-ERG）技术，可测量视网膜色素上皮（RPE）对光刺激产生的电生理反应。当该技术与常规视网膜电图（ERG）记录联合使用时，后者用于检测光感受器细胞（a波）和双极细胞（b波）的反应¹⁴，DC-ERG能够明确RPE在视网膜变性过程中反应特性的变化^15,16,17，或判断RPE功能障碍是否先于光感受器细胞的丢失。本实验方案改编自Marmorstein、Peachey及其同事首次建立DC-ERG技术的研究工作^16,18,19,20，并在可重复性和操作便捷性方面进行了优化。

由于记录过程需要较长的采集时间（9 分钟），在此期间任何中断或噪声引入都可能使数据解读变得复杂，因此直流视网膜电图（DC-ERG）记录难以实施。这种新方法的优势在于基线能在更短的时间内达到稳态，降低了动物在麻醉过程中过早苏醒的可能性，同时也减少了毛细管电极中气泡形成的风险。

方案

本方案遵循由国家眼科研究所动物护理与使用委员会批准的动物研究方案中规定的动物护理指南。

1. 导入用于直流视网膜电图（DC-ERG）的光刺激方案

注意：请按照以下说明将直流视网膜电图（DC-ERG）的光刺激方案导入视网膜电图系统软件（材料表）。该方案包括0.5分钟的刺激前间隔，随后施加7分钟的光照（10 cd/m²），最后为1.5分钟的刺激后间隔。选择10 cd/m²（1 log₁₀ cd/m²）的光照强度，是因为该强度可在野生型小鼠DC-ERG的所有组分中诱发约最大反应的一半^18,21。其中c波和快速振荡尤为值得关注，因为这些电反应的起源已被充分表征，且可在体外RPE模型（例如iPSC-RPE）中进一步分离和研究。应用其他光照强度可获取额外信息，例如，在较强光刺激下，关闭反应会出现极性反转，并可能在发生该反转的特定强度上表现出差异。用户可根据需要自行调整光照强度设置。

1. 打开ERG系统软件。
2. 点击数据库中心。
3. 点击新建（输入一个新的数据库文件名），然后点击保存。弹出窗口将显示：“数据库已创建，是否要连接到新数据库文件？”点击是。当前数据库名称现在应显示为新的文件名。
4. 在数据库控制中心窗口中，点击导入。
5. 选择补充文件1：LightProtocols - TRANSFER.EXP，然后点击打开。
6. 进度条完成后，点击关闭（数据库控制中心）。
7. 点击绿色的开始按钮。
8. 在选择患者窗口中点击新建。创建一个描述小鼠模型的新患者姓氏，输入出生日期（DOB，mm/dd/yyyy），将性别（M/F）按钮切换至相应选项。点击关闭以保存实验信息。
9. 点击方案。此时应可见暗适应ERG和DC-ERG方案。
10. 最后，将Long Flash.col文件复制到以下文件夹：C:\ERG User Files\Long Flash.col。

2. 毛细管电极制备

1. 使用陶瓷片（材料表）在1.5 mm玻璃毛细管的中部划痕，并借助桌面提供反向作用力，用手将毛细管整齐折断。
   注意：如有需要，可将切割后的端口磨钝。
2. 用镊子夹住毛细管置于本生灯（材料表）火焰上方，利用火焰加热使毛细管产生轻微弯曲。

3. 填充毛细管电极

1. 通过管路过滤器（材料表）将真空干燥器连接至实验室的真空管线。
2. 将 30 mL 的 Hank 平衡盐溶液（HBSS）（材料表）倒入一个敞口的 50 mL 锥形管中，并将其（去掉管盖）放入真空室。
3. 开启真空泵，对 HBSS 进行脱气，同时打开计算机和记录设备。
4. 5–10 分钟后关闭真空泵，使用已脱气的 HBSS 通过连接的 25 G 针头填充一支 12 mL 注射器。用其填充电极夹的基部，操作时需格外小心，避免引入气泡。
   1. 操作时，先取下螺纹螺帽，小心地将注射器针头穿过硅橡胶垫圈，直至到达夹持器的后壁（银/氯化银小球）。
      注意：与使用银丝的夹持器相比，银/氯化银小球具有更大的表面积，可提供稳定的低噪声基线。然而，银/氯化银小球需要无气泡的液体界面以实现良好连接。因此，操作过程中必须特别注意避免引入气泡。
   2. 缓慢注入 HBSS，同时缓慢撤出注射器针头，以充满整个微电极。重新装上螺纹帽，但不要拧紧。再次插入注射器针头，用 HBSS 填充螺帽内的空隙。然后在水平持握玻璃毛细管的情况下填充，以防止溶液从另一端溢出。
   3. 从弯曲端握住玻璃毛细管，缓慢将另一端穿过已松开的螺帽，然后拧紧螺帽。
      注意：用 HBSS 填充的玻璃电极可润滑小鼠眼球，防止使用标准金环电极时可能发生的角膜脱水。
5. 将电极夹持器放置成毛细电极略微向上倾斜，以便气泡排出。运行真空泵 5–10 分钟进行脱气。从玻璃和塑料表面释放的气体将推动 HBSS 从电极夹持器中排出。
6. 停止真空泵，然后缓慢释放真空。按照前述方法重新填充电极夹持器和玻璃毛细管。
   注意：气泡容易聚集在硅橡胶垫圈表面或附近，也可能隐藏在螺纹帽的螺纹槽内，因此必须特别注意确保这些区域无气泡。
7. 将微电极夹持器安装并固定到定制的 T 形夹/磁性球关节支架上（图 1A，插图）。为制作该微电极夹持器专用支架，可对一个 T 形夹（5/16”–11/32” 外径管）#8（材料表）进行改造，移除一侧的黑色聚乙缩醛夹片。将磁性球关节的圆柱底座加工成可调节高度的结构（材料表）。使用 M3 规格螺母将改造后的 T 形夹固定在磁性球关节的安装螺钉上。
8. 将微电极夹持器插入改造后的 T 形夹中，并通过插入一段长约 1 英寸、由棉签柄斜向折断制成的锥形木柄（材料表）将其牢固固定。利用稀土磁铁圆柱底座，将定制的电极夹持器支架稳固地安装在显微镜载物台的金属板上，实现围绕 180° 轴的 360° 旋转。

4. 测试电极

1. 将HBSS倒入一个小容器中（例如50 mL锥形管的管帽）。
2. 轻轻将组装完毕且已充满HBSS的毛细管微电极放入盛有HBSS的管帽中，以预先平衡电极，并将针状接地电极（尾部/后肢）和Ag/AgCl烧结 pellet 参比电极（口腔）也置于同一HBSS中，以完成电路（图1A）。
   注意：所有后续操作均应在暗红光下进行。使用红光手电筒定位小鼠和毛细管电极。开始记录前，请务必完全关闭所有光源。
3. 选择或创建一个合适的标识符（姓氏）以描述待测小鼠，并按照以下顺序完成注册，选择要执行的DC-ERG实验方案。
   1. 点击方案，选择DC-ERG，然后点击运行。此时将弹出一个对话框：“当前受试者为XXX [出生日期：XX/XX/XX]，是否正确？”点击是，然后进入“第1/6步”。
4. 关闭法拉第笼的门。
5. 点击阻抗以显示阻抗模式，并确认口腔参考电极、尾部接地电极和记录电极的阻抗值在可接受范围内（见图1B）。
6. 点击下一步（前进箭头）进入第4/6步“长闪光无光照”，以测试基线稳定性（噪声和漂移）。
   注意：当电极置于HBSS浴液中并达到稳定后，通常每80秒的漂移量小于500 µV，这与电极连接至小鼠时观察到的漂移水平相当。因此，电极在HBSS浴液中的电信号读数是评估电极状态的重要指标。噪声以峰峰值衡量，在小鼠体内通常比在HBSS浴液中高约10‒15%，这可能是由于呼吸引起的运动伪影所致。
7. 点击预览开始查看波形。波形应为低噪声，峰峰值幅度<200 µV。轻微漂移（<500 µV/80 s）并逐渐恢复至基线水平是可以接受的（图1C）。

5. 小鼠和电极的定位

1. 将小鼠置于通风良好且避光的盒子中过夜，以进行暗适应。
2. 通过腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）对动物进行麻醉。
3. 在角膜表面滴加一滴0.5%盐酸丙帕卡因以局部麻醉，同时滴加一滴2.5%盐酸去氧肾上腺素和0.5%托吡卡胺以扩大瞳孔。
4. 使用剪刀修剪小鼠胡须，防止其意外抽动干扰记录过程中玻璃毛细管电极的稳定性。
   注意：ERG系统内的DC-ERG刺激程序包含多个内置刺激方案，可通过点击Step（向前箭头）或Step（向后箭头）进行选择。软件中仅需使用步骤1、4和5即可完成DC-ERG记录的准备与执行。
5. 在ERG系统软件中确认已选择正确的受试动物，点击绿色的Protocols按钮。在Protocol Description下选择DC-ERG，然后点击Run。通过点击Yes确认正在进行的测试项目正确无误。
6. 使用第1/6步指定的红光刺激，开启圆顶内的红光，以便在观察阻抗变化的同时调整小鼠和电极的位置。
7. 将小鼠放置于加热的记录台上，用镊子轻轻提起后肢皮肤，一手牢固握住针电极，将其皮下插入后肢并固定到位。
8. 将参考Ag/AgCl电极（材料表）置于口腔内，使烧结小球沿后侧颊部放置，并固定于牙齿后方。
   注意：不应使用金丝电极作为口腔参考电极，因其具有不同的阻抗特性，会增加峰峰值噪声。
9. 在将毛细管电极放置到小鼠眼睛之前，手持电极架使玻璃毛细管保持垂直，用食指轻弹电极架以去除可能引入的气泡。使用连接在注射器上的25 G针头将HBSS填充至尖端，并检查确保尖端无气泡残留。调整电极架支架位置，使装有HBSS的毛细管开口端轻轻接触角膜。
10. 操作时需特别小心，避免产生气泡：应将润滑眼用凝胶的分配器倒置持握，并弃去最初几滴。在每只眼睛上各滴一滴润滑眼用凝胶，以维持导电性并防止记录期间角膜干燥。

6. 直流眼电图（DC-ERG）记录

1. 点击 下一步（前进箭头）以选择第 4/6 步“长闪光无锂”。
2. 点击 阻抗。使用 阻抗检测 界面检查左右眼的电阻。预期每只眼记录电极的阻抗值相近（约 39 kΩ）。接地电极和参考电极的阻抗值均应低于 10 kΩ。
3. 点击 预览 以查看左右眼的记录轨迹。等待获得稳定的基线（<10 分钟）。点击 停止 退出轨迹预览。
   注意：若记录中出现漂移方向的突然变化或异常噪声，此类问题不会随时间改善，需识别出需要处理的毛细管电极。最常见的原因是电极尖端引入了气泡。请用 HBSS 重新填充电极尖端。再次点击 预览 检查基线。
4. 点击 下一步（前进箭头）以选择第 5/6 步“长闪光 10 cd 7 分钟"。
5. 点击 运行 以开始记录（图 1D）。

7. 数据导出

1. 选择要导出的鼠标记录所对应的“患者”（姓氏）。
2. 点击 旧测试。
3. 在 方案描述 下选择 DC-ERG，然后点击绿色的 加载 按钮以载入先前采集的数据。
4. 点击 下一步（前进箭头），进入第 5/6 步“长闪光 10 cd 7 分钟”。
5. 点击 导出。
6. 输入文件名（例如，filename.csv）。有效的文件名必须以字母开头，后跟字母、数字或下划线，不得使用特殊字符或连字符。数据分析程序（DCERG_Analysis.exe）要求表格条目符合变量命名规则。
7. 在 数据表 旁打勾；在分隔符选项旁选择 制表符；在选项中勾选 标题 和 垂直，在包含全部中勾选 步骤、通道 和 结果，在数据列中勾选 内容、结果 和 扫描，在格式中勾选 文件。
8. 然后点击 导出（图 1E），这会将 *.csv 文件保存至 C:\Multifocal 文件夹。

8. 数据分析

1. 下载并安装适当的运行时安装程序（材料表)
2. 下载并安装 DCERG_Analysis.exe 安装程序。
   注意：此操作将安装用于分析直流视网膜电图（DC-ERG）成分的脚本，并在“开始”菜单文件夹中创建运行该程序的快捷方式。
3. 单击创建的快捷方式 开始菜单 > 项目 文件夹
4. 选择要用于分析的导出数据文件（*.csv）。使用 Ctrl + 左侧 单击鼠标以选择多个文件。
   注意：可执行文件会生成两种类型的图表：1）绘制原始数据，并添加最佳拟合线以显示测量到的漂移；2）对漂移校正后的响应数据进行移动平均平滑处理（时间跨度约5秒）后绘制曲线图。从该图中可识别直流视网膜电图（DC-ERG）各成分的振幅和达峰时间，包括c波、快速振荡、光峰以及关反应。随后，数据以表格形式导出至Excel文件，其中每个工作表对应一只小鼠的记录。这些记录工作表之后是两个汇总工作表：（i）汇总的DC-ERG振幅（mV）；（ii）汇总的DC-ERG达峰时间（以光照开始为时间零点，t = 0 min）。

结果

图2 是来自miR-204 ko/ko cre/+（条件性敲除）和野生型（WT）小鼠的示例数据集。miR-204 ko/ko cre/+ 小鼠是在视网膜色素上皮中条件性敲除microRNA 204的小鼠模型。这些小鼠通过将带有loxP位点侧翼的miR-204小鼠（由NEIGEF构建）²² 与VMD2-CRE小鼠²³ 杂交获得。miR-204在RPE中高表达，可调控多种对上皮功能至关重要的蛋白表达，这些蛋白参与维持紧密连接的完整性（例如claudins）、通过Kir 7.1钾通道的表达维持钾离子稳态，以及调控多个视觉循环相关基因（例如 LRAT、RPE65）的表达²⁴。

由于在多个RPE特异性表达Cre的转基因小鼠品系中已报道存在异常的RPE形态²⁵，我们对具有野生型表型且表达Cre的小鼠进行了正常R...

讨论

关键步骤

良好的直流视网膜电图（DC-ERG）记录需要稳定的电极，且电极中不得含有气泡，因为气泡会产生伪迹和不必要的漂移，而电极对脱气和温度变化极为敏感。在将电极置入HBSS浴液后，必须获得稳定的基线，方可继续进行小鼠记录。微小气泡容易聚集在毛细管电极底部或硅胶垫圈周围，一旦电极支架完全组装后便难以观察。当存在少量气泡时，可轻轻敲击支架以释放气泡并将其去除。如果气泡过多，或漂移与噪声无法消除，通常最好拆开电极并重新开始，同时在操作的每一步都仔细检查是否存在气泡。

修改与故障排除

为了提高直流视网膜电图（DC-ERG）记录的保真度，可对实验装置（材料列表）进行以下定制化改进。可使用低噪声电缆连接微电极夹持器，以延长从32位放大器到记录台的现有电缆。增加的长度可在全视野半球刺激器关闭后，仍能精确放置和调节电极夹持器的位置，而不干扰其定位。可使用电压调节器或电源净化器，以消除因...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ag/AgCl（口腔）电极	WPI 公司	EP1	用于小鼠的口腔参考电极
陶瓷砖	Sutter Instrument	CTS	用于将玻璃毛细管切割至合适尺寸
棉签清洁棒	Puritan Medical Products	867-WC 无胶	用作间隔件，以改善电极夹持组件的适配性
视网膜电图（ERG）系统	Diagnosys LLC	E3 系统	用于视觉研究和药物试验中诊断眼科疾病的视觉电生理系统
本生灯	Argos Technologies	BW20002460	或在火焰下塑形玻璃的等效方法
玻璃毛细管（1.5 mm）	Sutter Instruments	BF150-75	用于填充 HBSS 并与角膜接触
汉克’s 缓冲盐溶液（HBSS）	赛默飞世尔科技公司	14175-095	商品化供应。室温保存
在线过滤器	Whatman	6722-5001	防止气溶胶污染真空泵
用于微电极架的低噪声电缆	WPI 公司	5372	建议用于改进电缆长度及电极夹具组件的布局
磁性球形关节	WPI 公司	500871	用于在载物台上通过磁力定位电极夹持装置组件
MatLab	Mathworks		MatLab：用于编辑分析软件
MatLab 曲线拟合工具箱	Mathworks		MatLab工具箱（仅在编辑分析软件时需要）
MatLab 编译器	Mathworks		MatLab 工具箱（仅在编辑和重新发布分析软件时需要）
MatLab Runtime 版本 9.5	Mathworks	R2018b (9.5)	运行分析软件所需：https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
微电极夹持器（45度）	WPI 公司	MEH345-15	用于固定毛细管
针头（25 号）	Covidien	8881250313	用HBSS填充毛细管
针状（接地）电极	Rhythmlink	13 mm — 一个电极	皮下针电极（接地用），适用于小鼠（针长13 mm，直径0.4 mm，导线长1.5 m）
稳压器/电源净化器	弗尔曼	P-1800	或等效方法，用于消除因电源线引入噪声而产生的直流偏移
注射器（12 mL）	Monoject	1181200777	用于用HBSS填充毛细管
T形夹	Cole-Parmer	06852-20	电极夹具组装
真空干燥器	Bel-Art	420120000	透明聚碳酸酯底部 &和盖子
<强>药物治疗
润滑性眼用凝胶	爱尔康	0078-0429-47	有助于润滑角膜表面，并维持与毛细管电极的电接触
盐酸去氧肾上腺素 2.5%	Akorn	17478-201-15	短效散瞳眼药水（用于瞳孔扩张）
盐酸丙帕卡因 0.5%	阿克恩	17478-263-12	用于眼科滴注的局部麻醉剂
0.5% 托吡卡胺	阿克恩	17478-101-12	短效散瞳眼药水（用于瞳孔扩张）
赛拉嗪	AnaSed	sc-362949Rx	镇痛药和肌肉松弛剂
氯胺酮（盐酸氯胺酮）	VetOne	501072	用于肌肉注射的麻醉剂