直接耦合视网膜电图（DC-ERG）记录小鼠视网膜色素上皮光诱发的电反应

摘要

本文介绍了一种利用直流视网膜电图（DC-ERG）技术记录小鼠视网膜色素上皮（RPE）光诱发电反应的方法，该技术由 Marmorstein、Peachey 及其同事于21世纪初首次描述。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）是一种特化的单层细胞，位于视网膜与脉络膜毛细血管之间，在维持光感受器的整体健康和结构完整性方面具有关键作用。RPE具有极性，其顶端和基底端分别分布有受体或通道，能够进行水、离子、代谢物的定向转运，并分泌多种细胞因子。

可以使用直接耦合的视网膜电图（DC-ERG）对体内视网膜色素上皮（RPE）功能进行无创测量。DC-ERG 的方法最初由 Marmorstein、Peachey 及其同事采用定制的刺激记录系统开发，随后在商用系统上得以实现。该技术使用充满 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）的玻璃毛细管，测量由光感受器活动引起的视网膜下腔浓度变化所诱发的 RPE 较慢的电生理反应。由于 DC-ERG 采用长时间光刺激且记录周期较长，容易受到漂移和噪声干扰，导致可用记录的数据产出率较低。本文介绍一种快速、可靠的方法，通过施加真空压力减少或消除 HBSS 和电极支架中因脱气产生的气泡，从而提高记录的稳定性并降低噪声。此外，通过使用电压调节器/电源净化器来衰减电源线干扰。我们提供了商用 ERG 系统所需的光刺激方案，以及用于分析 DC-ERG 各组分（包括 c 波、快速振荡、光峰和关反应）的分析脚本。由于记录操作更简便且分析流程快速，该简化方案特别适用于测量 RPE 功能的年龄相关变化、疾病进展以及药理学干预效果的评估。

引言

视网膜色素上皮（RPE）是一层特化的单层细胞，排列在眼球后段，对维持视网膜稳态具有关键作用¹。RPE通过视觉循环过程再生光感受器捕获光子的视觉色素²，参与吞噬脱落的外节顶端的昼夜节律性过程³，以及在光感受器与脉络膜毛细血管之间转运营养物质和代谢产物^4,5，从而支持光感受器功能。RPE功能异常是多种人类视网膜疾病的基础，例如年龄相关性黄斑变性⁶、Leber先天性黑蒙^7,8和Best卵黄样黄斑营养不良⁹。由于供体眼组织通常难以仅用于研究目的而获得，因此具有基因修饰的动物模型可为研究视网膜疾病的发生提供替代途径^10,11。此外，CRISPR cas9技术的发展与应用现在能够在一步简单流程中实现基因组的插入（knock-in）或删除（knock-out），突破了先前基因靶向技术的局限性¹²。新型小鼠模型数量的....

方案

本方案遵循由国家眼科研究所动物护理与使用委员会批准的动物研究方案中规定的动物护理指南。

1. 导入用于直流视网膜电图（DC-ERG）的光刺激方案

注意：请按照以下说明将直流视网膜电图（DC-ERG）的光刺激方案导入视网膜电图系统软件（材料表）。该方案包括0.5分钟的刺激前间隔，随后施加7分钟的光照（10 cd/m²），最后为1.5分钟的刺激后间隔。选择10 cd/m²（1 log₁₀ cd/m²）的光照强度，是因为该强度可在野生型小鼠DC-ERG的所有组分中诱发约最大反应的一半^18,21。其中c波和快速振荡尤为值得关注，因为这些电反应的起源已被充分表征，且可在体外RPE模型（例如iPSC-RPE）中进一步分离和研究。应用其他光照强度可获取额外信息，例如，在较强光刺激下，关闭反应会出现极性反转，并可能在发生该反转的特定强度上表现出差异。用户可根据需要自行调整光照强度设置。

1. 打开ERG系统软件。
2. 点击数据库中心。
3. 点击新建（输入一个新的数据库文件名），然后点击....

结果

图2 是来自 miR-204 ko/ko cre/+（条件性基因敲除）和野生型（WT）小鼠的示例数据集。miR-204 ko/ko cre/+ 小鼠是在视网膜色素上皮中条件性敲除 microRNA 204 的小鼠模型。这些小鼠通过将带有 loxP 位点侧翼的 miR-204 小鼠（由 NEIGEF 构建）²² 与 VMD2-CRE 小鼠²³ 杂交获得。miR-204 在视网膜色素上皮（RPE）中高表达，可调控多种对上皮功能至关重要的蛋白表达，这些蛋白参与维持紧密连接的完整性（例如，claudins）、通过 Kir 7.1 钾通道的表达维持钾离子稳态，以及调控多个视觉循环相关基因（例如，LRAT、RPE65）的表达²⁴。

由于在多个表达RPE特异性Cre的转基因小鼠品系中已报道存在异常的RPE形态²⁵.......

讨论

关键步骤

良好的直流视网膜电图（DC-ERG）记录需要稳定的电极，且电极中不得含有气泡，因为气泡会产生伪迹和不必要的漂移，而电极对脱气和温度变化极为敏感。在将电极置入HBSS浴液后，必须获得稳定的基线，方可继续进行小鼠记录。微小气泡容易聚集在毛细管电极底部或硅胶垫圈周围，一旦电极支架完全组装后便难以观察。当存在少量气泡时，可轻轻敲击支架以释放气泡并将其去除。如果气泡过多，或漂移与噪声无法消除，通常最好拆开电极并重新开始，同时在操作的每一步都仔细检查是否存在气泡。

修改与故障排除

为了提高直流视网膜电图（DC-ERG）记录的保真度，可对实验装置（材料列表）进行以下定制化改进。可使用低噪声电缆连接微电极夹持器，以延长从32位放大器到记录台的现有电缆。增加的长度可在全视野半球刺激器关闭后，仍能精确放置和调节电极夹持器的位置，而不干扰其定位。可使用电压调节器或电源净化器，以消除因.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ag/AgCl（口腔）电极	WPI 公司	EP1	用于小鼠的口腔参考电极
陶瓷砖	Sutter Instrument	CTS	用于将玻璃毛细管切割至合适尺寸
棉签清洁棒	Puritan Medical Products	867-WC 无胶	用作间隔件，以改善电极夹持组件的适配性
视网膜电图（ERG）系统	Diagnosys LLC	E3 系统	用于视觉研究和药物试验中诊断眼科疾病的视觉电生理系统
本生灯	Argos Technologies	BW20002460	或在火焰下塑形玻璃的等效方法
玻璃毛细管（1.5 mm）	Sutter Instruments	BF150-75	用于填充 HBSS 并与角膜接触
汉克’s 缓冲盐溶液（HBSS）	赛默飞世尔科技公司	14175-095	商品化供应。室温保存
在线过滤器	Whatman	6722-5001	防止气溶胶污染真空泵
用于微电极架的低噪声电缆	WPI 公司	5372	建议用于改进电缆长度及电极夹具组件的布局
磁性球形关节	WPI 公司	500871	用于在载物台上通过磁力定位电极夹持装置组件
MatLab	Mathworks		MatLab：用于编辑分析软件
MatLab 曲线拟合工具箱	Mathworks		MatLab工具箱（仅在编辑分析软件时需要）
MatLab 编译器	Mathworks		MatLab 工具箱（仅在编辑和重新发布分析软件时需要）
MatLab Runtime 版本 9.5	Mathworks	R2018b (9.5)	运行分析软件所需：https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
微电极夹持器（45度）	WPI 公司	MEH345-15	用于固定毛细管
针头（25 号）	Covidien	8881250313	用HBSS填充毛细管
针状（接地）电极	Rhythmlink	13 mm — 一个电极	皮下针电极（接地用），适用于小鼠（针长13 mm，直径0.4 mm，导线长1.5 m）
稳压器/电源净化器	弗尔曼	P-1800	或等效方法，用于消除因电源线引入噪声而产生的直流偏移
注射器（12 mL）	Monoject	1181200777	用于用HBSS填充毛细管
T形夹	Cole-Parmer	06852-20	电极夹具组装
真空干燥器	Bel-Art	420120000	透明聚碳酸酯底部 &和盖子
<强>药物治疗
润滑性眼用凝胶	爱尔康	0078-0429-47	有助于润滑角膜表面，并维持与毛细管电极的电接触
盐酸去氧肾上腺素 2.5%	Akorn	17478-201-15	短效散瞳眼药水（用于瞳孔扩张）
盐酸丙帕卡因 0.5%	阿克恩	17478-263-12	用于眼科滴注的局部麻醉剂
0.5% 托吡卡胺	阿克恩	17478-101-12	短效散瞳眼药水（用于瞳孔扩张）
赛拉嗪	AnaSed	sc-362949Rx	镇痛药和肌肉松弛剂
氯胺酮（盐酸氯胺酮）	VetOne	501072	用于肌肉注射的麻醉剂