通过河豚毒素微量注射可逆性失活揭示大鼠脑内特定区域在排卵调节中的作用

摘要

本方案描述了一种低成本显微注射系统的构建方法，将其立体定位植入大鼠深部脑结构的操作步骤，以及在清醒且自由活动的大鼠中进行定时四乙基氯化铵微注射的流程。该研究的目的是通过抑制下丘脑结构的神经活动，揭示其在排卵调控中的参与作用。

摘要

已有多种实验方法被用于研究大脑在排卵调控中的作用。例如，通过损毁或去传入特定神经元群，但这些均为侵入性方法，会永久性破坏目标区域的结构完整性。这些方法常伴随间接效应，可能影响对急性及时间依赖性调控机制的分析。通过立体定位技术将导管套管植入特定脑区，经术后恢复期后，可在手术引起的不良效应消失后进行多种药物的微量注射。河豚毒素已被用于确定多个脑区在不同生理过程中的作用，因其可短暂抑制钠离子依赖性动作电位，从而阻断目标区域的所有神经活动。本方案将该方法与动情周期及排卵评估策略相结合，以揭示特定动情周期阶段中离散脑区在排卵调控中的作用。实验采用清醒且自由活动的大鼠（Rattus norvegicus），以避免麻醉剂和应激激素对排卵的抑制作用。该方案可轻松适用于其他物种、脑区靶点及药理学试剂，用于研究不同的生理过程。该方法未来的改进方向包括设计使用小直径玻璃毛细管替代导管套管的微量注射系统，以减少植入过程中对组织的损伤，并降低药物在目标区域外的扩散。

引言

排卵是指每个动情周期/月经周期中，一个或多个成熟卵母细胞从卵巢中释放的过程。由于所有哺乳动物物种都依赖配子的产生来进行繁殖，因此了解调控排卵的机制在生物医学、畜牧业以及濒危物种保护等领域具有重大影响。排卵受下丘脑-垂体-卵巢轴的调控，该调控系统涉及多个下丘脑及下丘脑外区域、腺垂体中的促性腺激素细胞，以及与卵母细胞共同构成卵巢内卵泡的卵泡膜细胞和颗粒细胞¹。

卵巢卵泡的生长、发育及最终排卵，依赖于促卵泡激素和黄体生成素这两种促性腺激素的紧张性与周期性分泌，这些激素由促性腺细胞分泌。促性腺激素的分泌模式对正常的卵泡发育和排卵至关重要，其分泌受促性腺激素释放激素（GnRH）的调控^1,2。该神经肽由分布于间脑基底部的神经元合成，随后分泌至连接下丘脑与腺垂体的垂体门脉系统。GnRH神经元的分泌活动反过来又受到来自不同脑区突触输入的调节。这些脑区传递有关机体内外环境状态的信息，包括食物可获得性、光照周期长度以及血液中激素浓度。因此，它们塑造了每个物种的生殖模式，必须明确这些结构的具体作用，才能充分理解调控排卵的机制。例如，已有研究表明，动情周期中雌二醇水平的波动可调节GnRH的分泌；然而，GnRH神经元本身并不表达检测此类变化所需的雌二醇受体亚型。表达这些受体的两类神经元分别位于第三脑室的前腹侧室周区和弓状核，并与GnRH神经元形成突触连接。有证据表明，这些神经元能够感知雌二醇浓度，并通过释放强效诱导GnRH分泌的酮替肽（kisspeptin），进而刺激GnRH神经元的活动³。

涉及热损伤或化学损伤以及机械性去传入的实验使研究人员能够确定多种脑结构在排卵调节中的作用^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}。然而，这些实验的缺点在于具有侵入性和创伤性，需要在评估处理效应前经历数天的恢复期，从而阻碍了对处理急性效应的分析。此外，这些方法会永久性地影响靶向区域，并在长期干扰其他生理过程。由于上述问题，这些实验的结果通常受到动物体内稳态代偿机制的掩盖，难以准确获取该脑区所参与的时序调控动态信息。

通过导管套管对神经元活动进行短暂干扰的药物微量注射是一种合适的替代方法，可克服上述提到的种种缺点。可通过立体定位手术将套管植入任意脑区，使研究者能够在手术带来的混杂效应消失后，再开始药物处理。定时进行的药物微量注射使研究者能够检验特定脑区在某一过程特定阶段中所起作用的假设，并可在清醒且固定或自由活动的动物中实施。多种药物，包括局部麻醉剂、激动剂、拮抗剂、反向激动剂以及生物毒素（如河豚毒素，TTX），均可在特定时间微量注射至目标脑区。

TTX 是一种由河豚体内以及其他脊椎动物和无脊椎动物体内的细菌合成的生物毒素。TTX 通过选择性且可逆地阻断钠通道来抑制神经活动，从而抑制钠依赖性动作电位的产生。在 TTX 存在的情况下，细胞的去极化过程发生改变，因此细胞不再具有兴奋性，但仍保持存活状态。TTX 的阻断作用可由其分子结构解释：其分子中的胍基能够穿过钠通道的胞外部分，但由于分子其余部分体积较大而无法通过，因此被卡住并阻塞通道^{13,14,15,16,17}。TTX 的作用机制使其成为研究神经系统的重要工具，广泛应用于体外和体内实验。脑内注射该毒素已被用于研究特定脑区在多种生理过程中的作用，包括记忆保持¹⁸、睡眠与觉醒¹⁹、位置识别²⁰、空间导航²¹、药物成瘾²²、体温调节²³、精神分裂症的发生发展²⁴、性行为²⁵以及排卵调控²⁶等。本实验方案描述了在清醒且自由活动的大鼠中，通过微量注射 TTX 短暂失活下丘脑核团对排卵过程的影响。

方案

涉及动物的实验程序已获墨西哥国立自治大学萨拉戈萨高等研究学院伦理委员会批准。本机构严格遵循墨西哥动物饲养管理法规《官方标准：NOM-062-ZOO-1999》，该标准符合国际指导原则。

1. 双侧套管的构建

1. 使用压力镊子从两根23 G皮下注射针的针座中取出不锈钢针管，然后用手术刀片去除残留的胶水。
2. 用细的永久性记号笔在针管钝端起15 mm处画一条线。使用切割镊子切除斜面端部。
3. 用精细止血钳夹住15 mm长的针管段，并用安装在旋转工具上的切割片垂直按压，直至获得14 mm长的管段。此步骤旨在去除针管中堵塞的部分，形成开放且平直的末端。最后，将一根30 G针头穿过管段，以清除任何内部阻塞物。
4. 借助脑图谱²⁷确定大脑左右半球中目标结构之间的距离。使用塑形粘土将两根14 mm长的针管段固定在显微镜载玻片上，并确保两者处于同一水平面。通过目镜测微尺（10倍）观察，并用精细镊子调整针管位置，直至达到所需间距。
5. 将焊锡膏与10%盐酸按2:1比例混合，并在针管段钝端下方2 mm处滴加一滴混合液。使用电烙铁和直径为0.5 mm的焊锡丝将两根针管段在单一点位焊接在一起。确保焊锡不堵塞针管的内腔。
6. 通过截取一段10 mm长、0.3 mm直径的弹性不锈钢丝，制作用于将套管固定在立体定位仪夹持器上的支撑结构。使用塑形粘土使钢丝的2 mm段接触先前的焊点，其余部分则置于套管钝端上方。将钢丝与套管焊接固定。
7. 用70%乙醇清洁套管表面，以去除多余的焊锡膏。用无菌水冲洗套管内部，以清除金属颗粒。重复此过程，直至在10倍显微镜下观察不到任何颗粒为止。

2. 阻塞器和帽的制作

1. 制作阻塞器时，截取两段直径为0.35 mm、长16 mm的圆形不锈钢软丝。用止血钳夹住双侧套管，使其垂直于实验台，将每段金属丝分别插入套管中，直至其末端接触实验台。将露出部分弯成90°角。
2. 制作帽盖时，截取两段内径为0.76 mm、长2 mm的硅胶管，在每段一端滴加一滴硅胶黏合剂，注意避免胶水进入管腔内部。室温下静置至少24小时使其完全干燥。

3. 微注射器的构建

1. 重复步骤 1.1，改用 30 G 的皮下注射针头来制作针体。
2. 从针体的钝端起测量，在 18.5 mm 处画一条线，并用剪切镊子去除斜面端的残余部分。
3. 使用一根 23 G 针头重复步骤 1.1，从钝端开始截取两段 6 mm 长的针段，用于制作连接接头。
4. 将 6 mm 针段的闭塞部分垂直压向切割片，直至获得两段 4 mm 长的接头，并清除任何内部阻塞物。
5. 将 30 G 针段的斜面端插入接头中。通过体视显微镜观察，确保针段与接头的末端处于同一水平面。使用棉签在远端连接处涂抹氰基丙烯酸酯胶水，并静置干燥 15 分钟。
6. 将两个聚四氟乙烯（Teflon）管路连接器浸入 70% 乙醇中 5 分钟，然后通过接头将其连接至显微注射器。等待连接器直径收缩至少 24 小时后，采用低温方法对显微注射器进行灭菌，以避免损坏连接器（推荐使用环氧乙烷灭菌法）。

4. 动物饲养与阴道涂片

1. 使用成年雌性周期性戴帽大鼠（Rattus norvegicus，CIIZ-V品系）雌性大鼠，体重介于230至260克之间。将大鼠每四只一组饲养于标准聚丙烯笼具中，饲养环境保持14小时光照与10小时黑暗的光周期。室温设定为22 ± 2 °C，相对湿度设定为40%。自由供应食物和水 随意摄取.
2. 每天10:00至12:00之间采集阴道涂片。
   1. 使用酒精灯对接种环（内径1 mm）进行灭菌，并用无菌水冷却。牢固握住大鼠，将接种环插入阴道5 mm，接触其内壁。取出接种环，若操作成功，可见环尖附着一滴浑浊液体。将此液滴置于显微镜载玻片上。
   2. 对每只大鼠重复此过程，每次处理不同动物之间需对接种环进行灭菌并冷却。
   3. 滴液干燥后，用苏木精-伊红染色，并在显微镜下以10倍物镜观察样本。
   4. 确定每张涂片中白细胞、上皮有核细胞和角化细胞的比例，并根据文献报道的动情周期阶段标准进行分类 图1，这与以往的文献报道一致^28,29.

5. 立体定位仪植入套管

注意：按照常规无菌立体定位手术操作，并遵守机构规范进行套管植入。

1. 手术前
   1. 使用高压蒸汽灭菌器在手术前24小时对手术器械、套管、手术螺钉、堵头、纱布和木制棉签进行灭菌。连续手术之间，通过10%过氧化氢清洗金属器械尖端，再用水冲洗，然后将其放入热珠灭菌器中进行灭菌。
   2. 在将动物从饲养室取出之前，准备好操作区域和立体定位仪。在距离手术台尽可能远的区域准备动物，以避免手术过程中发生污染。
   3. 用70%乙醇清洁准备区和手术区域，随后使用10%氯溶液处理十分钟。用70%乙醇清洁立体定位仪的底座、框架和操纵臂，并使用热珠灭菌器对耳杆尖端进行灭菌，术前使其空气冷却。
   4. 手术时穿戴专用实验服、口罩、头帽、手术袖套、鞋套和外科手套。请助手准备手术动物，并在手术过程中检查其一般状态。
   5. 将套管固定在立体定位仪的持针器上。请助手将第一只待手术动物带入房间。选择处于动情间期的大鼠进行手术，因为本实验室的观察表明，与在其他动情周期阶段接受手术的大鼠相比，这些动物恢复正常的动情周期更快，这可能是因为机体对压力的反应随动情周期而变化。
   6. 称量动物体重，并在连接异氟烷挥发器的诱导室中，使用100%氧气携带4%异氟烷对大鼠进行麻醉诱导。为避免对动物造成应激，不要预先充满诱导室。在观察到翻正反射消失后，通过检查瞳孔扩张情况以及尾部和耳部夹捏测试无痛反应，确认动物已达到外科麻醉深度。
      1. 若无异氟烷挥发器，可通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物对大鼠进行麻醉。
   7. 将大鼠从诱导室中取出，在准备台上使用鼻罩以100%氧气携带2.5%异氟烷维持麻醉。使用电推剪修剪头皮毛发，并用粘毛滚筒清除松散毛发。术前皮下注射美洛昔康2 mg/kg（作为非甾体抗炎药/镇痛药）和恩诺沙星5 mg/kg（作为抗生素）。
      1. 向每只眼睛滴加羟丙甲纤维素人工泪液，以防止手术期间角膜干燥。
   8. 将动物固定在立体定位仪上，下方放置加热垫，使用非穿刺式耳杆和麻醉面罩。调整鼻夹，确保动物头部保持水平。在剃毛区域进行手术刷洗：先交替使用含皂聚维酮碘和70%乙醇各一次，再单独使用聚维酮碘和70%乙醇各两次。插入直肠温度计以记录手术期间动物体温，随后覆盖无菌手术巾。
2. 手术中
   1. 使用手术刀在剃毛区域中央的皮肤和肌肉上做一条长约2 cm的切口。用蘸有2%过氧化氢的棉签去除颅骨上的骨膜，暴露前囟或后囟，这些解剖标志将用于计算目标坐标的参考点。用气流吹干颅骨，以便更清晰地观察标志点。
   2. 使用立体定位仪的操纵臂将套管移至所选标志点正上方位置。记录立体定位仪上的前后（anterior-posterior）和内外（medial-lateral）坐标，并根据脑图谱²⁷计算目标区域的坐标。
   3. 在立体定位仪上设定计算出的坐标，将套管尖端置于颅骨表面。记录背腹（dorsal-ventral）坐标，并据此计算到达目标区域的深度。
   4. 松开操纵臂与框架的连接螺丝，取下操纵臂。将牙科钻头连接至旋转工具，以15,000 rpm的速度在即将开颅的位置打一个标记点。然后围绕该标记点钻出三个孔，形成一个等边三角形。这些孔不得穿透颅骨。将手术螺钉插入孔中，确保其牢固固定。
   5. 开颅范围应足够宽，以容纳双侧目标区域之间的距离。直径应尽可能小，但必须足够大，以确保套管下降时不接触颅骨边缘，否则会影响进针轨迹。逐步进行开颅操作，施加尽可能低的压力。啮齿类动物的颅骨仅数毫米厚，保持其下方组织的完整性至关重要。
   6. 当硬脑膜可见后，使用尖端弯曲90°的无菌21 G针头清除骨碎片，并在脑膜上做前后方向的切口。如果目标区域靠近中线，应采用Wirtshafter及其同事³⁰描述的技术，以避免损伤上矢状窦。
      1. 将装有套管的持针器重新安装至框架上，使用背腹方向操纵臂到达预定腹侧坐标。下降过程中检查针头是否接触颅骨边缘，必要时扩大开颅直径。
         注：引导套管尖端应定位在目标区域上方0.5至2.0 mm范围内。这是由于脑组织对外来物体植入会产生炎症反应并导致组织破坏。若目标区域较小，工作距离需提前通过经验确定，这一点尤为重要。
   7. 使用牙科水泥将套管固定于颅骨上，并使其完全干燥。确保牙科水泥不覆盖套管的钝端，以免造成不可逆堵塞。等待水泥完全固化。
   8. 插入堵头以防止进一步堵塞，并确保研究期间通道通畅。戴上硅胶帽以防止污染。
3. 手术后
   1. 通过腹腔注射1.0 mL生理温度的无菌生理盐水，补充丢失的体液。将动物置于带有保温支持的恢复笼中，直至其从麻醉中苏醒。定期检查动物体温及心率/呼吸频率。异氟烷的作用在停止供气后数分钟内消失，而氯胺酮/赛拉嗪的作用可持续40–50分钟。
   2. 术后继续给予抗生素、镇痛药和抗炎药注射（剂量和给药途径同前），持续48–72小时，并在整个实验期间每日密切观察动物状况。如发现任何疼痛、应激或体重下降迹象，应及时报告给兽医服务部门或实验室受过培训的人员。在此期间不得对大鼠进行其他操作。
   3. 术后治疗结束后开始采集阴道涂片，并持续进行，直至动物连续出现三个四天周期的动情周期。
      注：可外科植入颈静脉慢性导管，使研究人员能够连续采集血液样本，用于分析雌二醇、孕酮、睾酮、黄体生成素、卵泡刺激素和皮质酮等激素的分泌情况。我们建议在动物从脑部手术恢复后再植入此类导管，因为这有助于提高存活率，同时避免因恢复时间延长而导致导管堵塞。

6. 河豚毒素的处理与溶液配制

警告：TTX 是已知毒性最强的物质之一，作用于骨骼肌和神经组织。通过接触中毒的可能性较低，但任何开放性伤口都可能成为毒素进入体内的途径。使用 TTX 时的主要风险包括被接触过毒素的锐器刺伤皮肤，以及产生可进入口腔、眼睛和黏膜的气溶胶。根据剂量不同，TTX 若被吸入、吞咽或经皮肤接种，可能致命。该物质会引起眼睛强烈刺激。在小鼠中通过口服和静脉注射途径测得的 LD50 分别为 334 µg/kg 和 7.3 µg/kg。目前尚无可用的抗毒素。

注意：失活剂为含或不含0.25 N NaOH的1.0% NaOCl溶液，或10%次氯酸钠溶液。暴露30分钟后可实现完全失活。河豚毒素（TTX）无法通过浓度低于10%的任何氯化物衍生物、高压灭菌或低于500 °F的干热灭菌完全失活。所有涉及TTX的操作必须由两名具备相关知识的人员共同执行，操作时需佩戴内、外层腈类手套、专用实验服、护目镜、一次性口罩、封闭式鞋履和全长裤装。

1. 储备液的制备
   1. 在通风橱内放置浸有灭活物质的垫子，以防止发生泄漏时造成污染。开始操作前，确保通风橱正常工作。准备一个装有灭活溶液的容器，用于丢弃移液枪头。
   2. 根据制造商说明书，使用无菌人工脑脊液极其小心且缓慢地滴加，将无菌的TTX柠檬酸盐冻干粉重新溶解，过程中冲洗瓶壁。避免产生泡沫和气溶胶。操作时应遵循无菌技术，防止TTX溶液被污染，因为该溶液将被注射到活体动物脑内。 如果TTX小瓶具有外膜，建议使用带针头的注射器而非微量移液器，以防止气溶胶形成。
   3. 将储备液分装至无菌微量离心管中。分装体积应尽可能小，因为冻融循环可能影响分子的稳定性。装液时不要超过管体积的一半，因为水结冰时体积会增大，可能导致管盖松动，进而造成管内样品及其他存放在容器中的样品污染。
   4. 使用灭活物质对管子外表面以及使用过TTX的台面进行去污处理。将分装管储存于-20 °C，置于冻存管盒内，并放入次级容器中。
2. 将储备液稀释至工作浓度
   1. 稀释液应在使用当天新鲜配制，因为稀释后的溶液稳定性较差。在通风橱内放置浸有灭活物质的垫子，并在其上方放置微量离心管架。准备一个装有灭活溶液的容器，用于丢弃移液枪头。
   2. 将储备液移取至无菌微量离心管底部，然后加入计算好体积的人工脑脊液，使终浓度达到10 ng/µL。如同重新溶解TTX粉末的操作，需极其小心且缓慢地进行滴加，冲洗管壁，并避免产生泡沫和气溶胶。
   3. 若将从冷冻保存中取出的样品用于微量注射，必须在实验前于室温下平衡至少一小时。

7. 向自由活动的大鼠微注射河豚毒素（TTX）或载体溶液

1. 根据实验要求，设置微量注射泵的输注速率和总注射时间。预先计算这些参数，需考虑目标结构所占体积以及待注射溶液的量。本实验中，以每分钟 50 nL 的速率注射 200 nL 溶液，总输注时间为 4 分钟。
2. 取两支 10 μL Hamilton 注射器，装入无菌蒸馏水，将一段无菌特氟龙管插入每台微量注射器的管路连接器中，确保管路长度不会限制大鼠的活动（可使用环氧乙烷对管路进行灭菌）。
3. 准备一块浸有灭活物质的垫片，并在其上方放置一块 2 cm × 2 cm 的石蜡膜。用移液器吸取足量 TTX，使其充满注射针头及膜上方约 1 cm 长的管路。通过缓慢回抽活塞将 TTX 液滴吸入。将注射器安装至微量注射泵上，使用其控制装置调节活塞，直至每个微量注射器尖端可见一滴 TTX。将液滴滴入浸有灭活物质的垫片中弃去。
4. 选择接受微量注射的大鼠。仅使用术后表现出至少三个连续动情周期的大鼠。根据其动情周期阶段和一天中的时间进行选择。具体时间和阶段取决于待验证的假设；本实验选择动情前期下午 14:00 进行注射，因为此时正发生调控脉冲式 GnRH 分泌的神经排卵前信号。将大鼠连同其饲养笼一起转移至注射室，以避免造成应激。
5. 牢固抓握大鼠，取下套管帽和堵塞栓，将微量注射器插入导向套管中，然后将动物放回笼内。
6. 启动注射泵，等待微量注射完成。在此期间观察动物，以检测微量注射器是否可能脱落，并防止特氟龙管发生缠绕。
7. 注射完成后保持微量注射器原位停留额外 2 分钟，以防溶液反流。随后拔出注射器，用碘伏消毒液清洁植入物表面，注意避免消毒液流入导向套管内部。插入无菌堵塞栓，盖上套管帽，将动物送回饲养室。定期观察动物，以监测药物可能引起的任何不良反应。
8. 使用与微量注射相同的参数启动注射泵，检查液体流动是否正常，以确认整个系统在操作过程中保持通畅。
9. 按压活塞，将 TTX/载体溶液从微量注射器中排出，直至气泡到达针尖。将 TTX 回收至其微量离心管中。用蒸馏水充满注射器，冲洗管路内部。将冲洗液排入灭活物质中，并重复此过程至少三次。用浸有灭活物质的布擦拭注射器、管路和微量注射器的外表面。

8. 安乐死与组织处理

1. 在预测或经阴道涂片确认发情期的当天，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（75 mg/kg）对大鼠实施麻醉。检查意识丧失情况后，按照步骤7.1至7.9所述方法，经引导套管注入200 nL的0.5%亚甲蓝溶液。采用脚趾夹捏或尾部夹捏试验检测疼痛反应，若未检测到任何疼痛反应，使用啮齿类动物断头器将大鼠断头处死。
2. 使用剪刀打开腹腔并找到卵巢。在放大镜辅助下，用精细虹膜剪分离每个卵巢，在子宫-输卵管连接处进行剪切。注意避免损伤输卵管，以免导致卵母细胞丢失。
3. 将卵巢置于体视显微镜下，用剃刀片去除所有脂肪组织，注意不要损伤器官。用剃刀片从每个卵巢上切除输卵管，切口位置应尽可能远离壶腹部。将每条输卵管分别置于不同的载玻片上，并滴加一滴水覆盖。将卵巢保存在含有Bouin´s溶液的小瓶中。
4. 用吸水纸轻轻擦干输卵管，并在体视显微镜下寻找壶腹部。用非惯用手持23 G针头夹住远离壶腹部的输卵管以固定位置，然后用惯用手持另一支23 G针头在壶腹部中段做一长约1 mm的切口。卵丘-卵母细胞复合体会随黏稠液体从切口处溢出图 2D）。用惯用手持针头，轻柔缓慢地将液滴从输卵管远处拉出。按压壶腹部残余部分，确保无卵母细胞残留其中。应尽快从输卵管中取出卵母细胞，因为输卵管干燥会导致卵母细胞不可逆地滞留在内部。
5. 将输卵管从载玻片上取下，等待含有卵母细胞的液滴干燥。用苏木精-伊红染色样本。使用封片剂封片。在显微镜下（10倍）观察，以确定每侧卵巢排出的卵母细胞数量。
   注意：本方案中不采用心脏灌注法处死动物，因为卵母细胞会滞留在输卵管中，因此需要组织学方法来评估排卵情况。如果用户必须进行灌注以分析其他组织，可先取出卵巢，然后用较大型止血钳在肝脏下方夹闭降主动脉，以防止固定液泄漏。
6. 去除头部皮肤，将颅骨浸入盛有10%甲醛溶液的玻璃容器中。头部固定至少十天后，方可移除套管，以避免组织变形。移除套管时，使用剪刀分离环绕套管区域颅骨周围的全部肌肉。用骨剪在鼻骨与额骨之间剪开，随后去除枕骨。将骨剪尖端插入枕骨大孔，沿矢状嵴剪开，直至鼻骨残余部分。
7. 颅骨顶部分离出的区域必须包含额骨和顶骨。将固定在颅骨顶部的植入式套管缓慢垂直向上拔出。使用精细虹膜剪刀剪除任何与脑膜相连的部分，以避免脑组织变形。
8. 在脑膜上做一前后的切口，将其移开，以便从颅底取出脑组织。将钝头镊子插入嗅球下方，轻轻上提脑组织，直至视神经可见。用精细虹膜剪剪断视神经，然后取出脑组织。将脑组织保存在固定液中。
9. 使用振动切片机获取脑组织50 µm厚的切片，将切片贴附于多聚赖氨酸包被的载玻片（溶于蒸馏水的0.1%溶液）上，并采用尼氏染色法进行染色。在显微镜下（10倍物镜）观察切片，以确定套管的最终位置。图2A-2C以及借助大鼠脑图谱观察染料的扩散情况²⁷.

结果

上述方案通过评估单次向大鼠中已知参与排卵调节的两个不同核团——视交叉上核和弓状核——之一注射河豚毒素（TTX）或对照溶剂（人工脑脊液；ACSF）的作用而进行验证。选择视交叉上核是因为其包含哺乳动物的中枢昼夜节律起搏器，参与调节诸如促性腺激素分泌等周期性事件。选择弓状核是因为其含有一群表达雌二醇受体的神经元，可在大部分动情周期中促进促性腺激素释放激素（GnRH）的分泌。微注射在动情前期14:00进行，该时段被称为“关键窗口期”，因许多调控促排卵前促性腺激素释放的中枢机制在此期间发生。处理后每日采集阴道涂片，并在预测的动情期当天09:00处死大鼠，此时阴道涂片显示为典型的动情期特征。另设一个对照组，包括五只在动情期阶段处死的完整（未手术）大鼠。通过Fisher精确概率检验，计算并分析手术后各组中维持动情周期的大鼠比例以及排卵大鼠的比例（排卵大鼠数/n）。采用Kruskal-Wallis检验对双侧卵巢排出的卵母细胞数量进行分析，随后进行Dunn检验。采用适当的统计学方法确保样本量充足。

共对30只雌性大鼠进行了导向套管植入手术，目标为两个靶区之一。如

讨论

本文介绍了一种可在任意给定时间瞬时失活清醒且未束缚大鼠脑内特定区域的方法。同时提供了一种简单的方法用于追踪其动情周期并评估排卵情况。通过比较经河豚毒素（TTX）处理动物与经载体处理动物的排卵结果，该实验方案可直接分析特定脑区在驱动排卵机制中的作用。除立体定位仪和微量注射泵（神经科学研究实验室常见设备）外，该方法无需昂贵材料。此类实验通常使用商用套管和微量注射器，但本文所述易于构建的系统可显著降低成本，且实验结果与商用产品无差异。使用本方案及随文附表所列材料，花费与一套供十只动物使用的商用试剂盒相同的费用，可制造出十倍数量的套管。无论研究所需的具体定制要求如何，制作十个双侧套管仅需数小时即可完成。此外，所有组件均可重复使用，进一步提高了成本效益。

除了具有较高的效益成本比外，该方案适用于任何实验室环境，任何具备啮齿类动物操作、立体定位手术以及生物毒素及其相关废弃物处理知识的人员（包括学生）均可开展。此外，该方案可进行调整，适用于各种啮齿类动物及其他小型哺乳动物（如兔子、雪貂、狨猴），甚至可用于鸟类和爬行动物等非哺乳类物种。除上述特性外，本方案的主要优势在于，可轻松调整用于研究受大脑调...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 μL 汉密尔顿注射器	Hamilton	80314
21 G × 1" 不锈钢穿刺针	BD	305165
23 G × 1" 不锈钢穿刺针	BD	305145
30 G × 1/2" 不锈钢穿刺针	BD	305106
人工脑脊液	BASi	MD-2400
骨修剪器	精细科学工具公司	16152-12
微型钻头用钻头	精细科学工具公司	19007-05
电推剪	Wahl
切割片	Dremel	SM5010
剪切镊子	Truper	17367
氰基丙烯酸酯胶水	Kola loka	K-1
牙科水泥	Nic Tone
恩诺沙星	Senosiain
伊红	Sigma	E4009
体视显微镜	Zeiss
超精细波恩剪刀	精细科学工具公司	14084-08
面部口罩	Lanceta HG	60036
格拉费镊子	精细科学工具公司	11050-10
苏木精	Sigma	H3136
止血钳	精细科学工具公司	13008-12
热珠灭菌器	精细科学工具公司	18000-45
盐酸	Sigma	320331
羟丙甲纤维素人工泪液	Sophia Labs	8950015
异氟烷	Pisa Agropecuaria
美洛昔康	Aranda	1183
微量注射泵	KD Scientific	788380
单体	Nic Tone
微型电动工具	Dremel	3000
丁腈手套	Lanceta HG	69028
非穿刺式耳杆	David Kopf Instruments	855
多聚-L-赖氨酸	Sigma	P4707
聚维酮碘	Dermo Dine
含皂聚维酮碘	Germisin espuma
压力镊子	Truper	17371
大鼠麻醉面罩	David Kopf Instruments	Model 906
生理盐水溶液	PISA
手术刀	精细科学工具公司	10004-13
手术刀片	精细科学工具公司	10015-00
戊巴比妥钠	Pisa Agropecuaria
标准电极夹持器	David Kopf Instruments	1770
不锈钢丝	American Orthodontic	856-612
立体定位仪	David Kopf Instruments	Model 900LS
手术剪	精细科学工具公司	14001-12
特氟龙连接器	Basi	MD-1510
特氟龙管	Basi	MF-5164
河豚毒素	Alomone labs	T-500
麻醉蒸发器	Kent scientific	VetFlo