方法文章

利用SAX-HPLC从不同植物物种中提取和定量可溶性放射性标记的肌醇多磷酸盐

DOI：

10.3791/61495

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2020年6月26日

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1Department of Plant Nutrition, Institute of Crop Science and Resource Conservation, University of Bonn

本文内容

摘要

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本文介绍了一种高灵敏度的方法——强阴离子交换高效液相色谱法，用于检测和定量植物中 [3H]-myo-肌醇标记的幼苗中的肌醇多磷酸盐。

摘要

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肌醇磷酸酯（myo-inositol 的磷酸酯），也称为肌醇磷酸盐（InsPs），是一类在植物生理学中发挥重要作用的细胞调节分子。由于其带有负电荷、含量较低且易受水解活性影响，这些分子的检测与定量具有较大挑战性，尤其是含有“高能”焦磷酸键的高度磷酸化形式，即肌醇焦磷酸盐（PP-InsPs）。目前，利用[3H]-myo-肌醇标记植物后进行强阴离子交换高效液相色谱（SAX-HPLC）分析，因其高灵敏度而成为检测这些分子的首选方法。通过使用[3H]-myo-肌醇对植物幼苗进行放射性标记，可高灵敏度地检测并区分多种InsP种类，包括若干非对映异构体。本文描述了合适的SAX-HPLC系统的构建，以及从植物培养、放射性标记、InsP提取到SAX-HPLC运行及后续数据分析的完整实验流程。本方案可实现对多种InsP种类的区分与定量，包括若干非对映异构体以及PP-InsPs中的InsP7和InsP8，并可轻松适用于其他植物物种。作为示例，本文对拟南芥（Arabidopsis thaliana）和百脉根（Lotus japonicus）幼苗进行了SAX-HPLC分析，展示了完整的InsP谱型并进行讨论。该方法为深入理解InsP在植物中的生物学功能提供了有力工具。

引言

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近四十年前，当三磷酸肌醇（Ins(1,4,5)P3，简称InsP3）被确认为可激活动物细胞中受体介导的Ca2+释放的第二信使后，肌醇磷酸盐（InsPs）便作为信号分子被发现1,2。迄今为止，植物中尚未鉴定出任何InsP3受体（IP3-R），这使得InsP3在植物细胞中是否具有直接的信号传导功能受到质疑3。然而，InsP3可作为其他参与多种植物发育过程的肌醇磷酸盐的前体，包括调控特定信号通路3,4,5,6,7,8。例如，InsP3可进一步磷酸化生成六磷酸肌醇（InsP6），即所谓的“植酸”，它是磷酸盐、myo-肌醇和阳离子的主要储存形式，并已被证明在植物抵御病原体、mRNA输出以及磷酸盐稳态中发挥关键作用5,9,10,11,12。

肌醇焦磷酸盐（PP-InsPs）是一类含有至少一个高能二磷酸键的InsPs，最初在动物细胞、阿米巴原虫和酵母中被发现，它们在多种细胞过程中发挥关键作用13,14,15。尽管在植物中关于PP-InsPs的研究已有重要进展16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26，但这些分子的生物学功能及其异构体身份仍 largely 未明。在模式植物Arabidopsis thaliana中，细胞内的InsP8被认为通过ASK1-COI1-JAZ受体复合物对InsP8和活性茉莉酸的共识别机制来调控对昆虫食草动物和坏死性真菌的防御反应17。此外，InsP8及其他PP-InsPs在能量稳态与营养感知以及磷酸盐稳态中的作用也已被提出17,23,24,25,26。

无论采用何种生物系统，研究肌醇多磷酸盐（InsPs）时面临的一个主要方法学挑战是这些分子的可靠检测与精确定量。基于质谱的方法已被用于从细胞提取物中检测InsPs，包括焦磷酸肌醇多磷酸盐（PP-InsPs）。 然而， 这些研究未能区分不同的异构体26,27另一种分析InsPs的方法是利用TiO从细胞裂解液中进行InsPs的下拉分析2 珠子，随后对洗脱的InsPs进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。InsPs可通过亚甲蓝或DAPI染色进行检测24,28,29然而，迄今为止仍无法可靠地检测低于 InsP 的肌醇多磷酸（InsPs）5 从植物提取物中使用此方法。最近，一种使用[13C]-myo-肌醇用于肌醇磷酸盐（InsPs）的核磁共振（NMR）分析，已作为强阴离子交换高效液相色谱（SAX-HPLC）的一种替代方法被发表30该技术据报道可达到与SAX-HPLC相似的灵敏度，并能够检测5-InsP7以及对不同非对映异构体InsP的区分5 从细胞提取物中分离异构体。然而，基于核磁共振（NMR）方法的实施 需要化学合成且商品化不可获得的[13C]-myo-肌醇。因此，大多数情况下采用的方法是使用[3H]-myo-肌醇，随后进行SAX-HPLC31,32,33. 该技术基于放射性物质的摄取 myo-肌醇进入植物后，在特异性细胞激酶和磷酸酶的共同作用下转化为不同的肌醇多磷酸。

随后通过酸提取并使用SAX-HPLC对[3H]标记的InsPs进行分离。由于InsPs带有负电荷，它们会与SAX-HPLC柱中带正电荷的固定相发生强烈相互作用，并可通过含有逐渐增加磷酸盐浓度的缓冲液梯度洗脱，使磷酸盐竞争性地将InsPs从柱上置换下来。因此，洗脱时间取决于待分离InsP分子的电荷和空间构型。在缺乏手性柱的情况下，该方法仅能分离非对映异构体。然而，可通过使用放射性标记的标准品来确定特定InsP峰的异构体性质。过去多个实验室通过（生物）化学方法合成标记或非标记标准品，或从不同细胞和生物体中纯化标准品，这些努力已帮助将色谱峰指认至特定的InsP种类，并进一步缩小了各个InsP种类的异构体身份范围5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43。此外，近年来对植物中生成PP-InsPs的酶促途径的阐明，以及一种具有特异性1-植酸酶活性的细菌III型效应因子的发现，为如何制备适用于此类分析的标准品提供了重要信息10,17,18,22,23。

由于氚（3H）的β衰变，所得组分可在液体闪烁计数器中进行测定。随着标记时间的延长，体系将达到同位素稳态平衡，此后获得的InsP谱图应能代表植物体内的InsP状态31。与现有其他技术相比，本实验方案的主要优势在于采用了InsPs的直接前体物质，并通过检测放射性信号实现了高灵敏度。

SAX-HPLC 分析从[中提取的样品3H]-myo-肌醇标记的植物或其他生物体常用于检测和定量从六磷酸肌醇到多种肌醇磷酸盐（InsPs） 较低的InsP种类至 PP-InsPs，作为深入了解肌醇多磷酸（InsPs）的代谢、功能及作用机制的有力工具。迄今为止，该方法仍是对于特别关注低级肌醇磷酸盐（lower InsP species）的研究人员而言最合适的选择。尽管本方案所基于的该技术基本原理此前已有描述7,21,31,34，目前仍缺乏针对植物来源的InsPs尤其是PP-InsPs分析的详细实验方案。先前的研究报道在可靠检测丰度较低的PP-InsPs（尤其是InsP）时存在困难。8，原因可能包括以下一项或多项：植物材料相对较少，[3H]-myo-肌醇，具有低特异性活性（> 20 Ci/mmol），使用 非高氯酸体系或浓度低于1 M的提取缓冲液、不同的中和缓冲液，以及次优梯度或[的检测3H] 结合在线检测器。与这些研究相比，本文所述方案旨在实现对 PP-InsPs 的可靠检测7,21,34.

本文介绍了一个详细的工作流程，从仪器设备的准备、植物培养与标记，到肌醇磷酸（InsP）的提取以及SAX-HPLC分析的全过程。尽管该方法最初是针对模式植物A. thaliana进行优化的，但也可轻松修改后用于研究其他植物物种，例如本文中首次报道的模式豆科植物Lotus japonicus的InsP谱型。尽管使用不同植物物种可能需要进行一些优化，但我们预计这些调整幅度较小，因此本实验方案可作为植物InsP研究的良好起点。为了便于可能的优化，我们在方案中明确指出了所有可以进行修改的步骤，以及在初次建立该方法时可能具有挑战性的关键步骤。此外，我们还介绍了如何利用本方法获得的数据对特定InsP进行定量分析，以及如何对不同样品进行分析与比较。

方案

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1. 建立高效液相色谱系统

  1. 建立一个由两台独立的高效液相色谱泵（二元泵）组成的系统，每种缓冲液各使用一台泵。两台泵需通过计算机上的相应软件或通过主泵进行同步控制。为两台泵均配备活塞密封清洗装置，可通过重力或第三台低压泵实现。指定一台泵用于缓冲液A（称为泵A），另一台用于缓冲液B（称为泵B）。
    注意：两台泵均需能够产生高达60 bar（6 MPa）的压力，并提供至少0.5 mL/min的流速。
  2. 将两台泵连接至动态混合器。
  3. 将混合器连接至带有至少1 mL容量样品环的进样阀。
  4. 通过相应的端部接头，将进样阀用毛细管连接至色谱柱。
  5. 使用适当长度的毛细管将色谱柱连接至组分收集器。
    注意：本描述基于我们的高效液相色谱系统（见材料表），该系统相比更新、更复杂的系统需要更多手动操作步骤。我们的系统允许对所有组件进行便捷的访问和修改。四元泵（采用此处描述的二元梯度模式）也可使用，并将产生与二元泵相似的洗脱曲线及整体分析质量。

2. 缓冲液、色谱柱和高效液相色谱系统的准备

  1. 制备用于提取可溶性肌醇多磷酸（InsPs）的缓冲液：提取缓冲液（1 M HClO₄）4）和中和缓冲液（1 M K2一氧化碳3）。使用超纯去离子水配制两种缓冲液，室温下可稳定保存数月。在提取前立即向两种溶液中加入EDTA，使其终浓度达到3 mM（例如，从过滤除菌的250 mM EDTA储备液中加入）。
    警告：HClO4 高氯酸具有强腐蚀性。
  2. 准备SAX-HPLC运行所需的缓冲液：缓冲液A（1 mM EDTA）和缓冲液B（1 mM EDTA，1.3 M (NH₄)₂SO₄）4)2HPO4；用 H 调至 pH 3.83PO4）。使用超纯去离子水配制，并用孔径0.2 µm的膜滤器进行真空过滤。这两种溶液在室温下可稳定保存数月。
    注意：所有缓冲液中均应包含EDTA，以防止阳离子与InsPs发生相互作用，否则可能导致InsPs电荷改变，甚至形成不溶性InsP盐复合物。
  3. 程序设置如下：0‒2 分钟，0% 缓冲液 B；2‒7 分钟，升至 10% 缓冲液 B；7‒68 分钟，升至 84% 缓冲液 B；68‒82 分钟，升至 100% 缓冲液 B；82‒100 分钟，100% 缓冲液 B；100‒101 分钟，降至 0% 缓冲液 B；101‒125 分钟，0% 缓冲液 B。该梯度的最优流速为 0.5 mL/min。
    1. 运行过程中，从第1分钟到第96分钟，每分钟收集一次组分。梯度洗脱剩余的30分钟用于清洗色谱柱和系统，无需收集用于闪烁计数。
  4. 若可能，在高效液相色谱泵紧急停机前，将可达到的最高压力设置为80 bar（8 MPa）。这可以防止 严重损伤 到柱子的树脂。
  5. 当使用新的SAX HPLC柱时 洗涤 它 彻底地 (>首次使用前，用过滤的超纯去离子水冲洗50 mL容器。
    注意：这将确保去除其中含有的甲醇，从而防止后续步骤中盐类析出。如果可能，使用单独的高效液相色谱泵。若无法实现，务必确保高效液相色谱仪在清洗色谱柱前已用清水冲洗。流速不应超过 2 mL/min。清洗后，色谱柱即可用于分析，若操作得当，可重复使用 用于20‒40次运行随后，分辨率将依次降低。用缓冲液A长时间洗涤（>1 小时）并执行步骤 2.6 可有助于延长色谱柱的使用寿命。如果分辨率下降的情况持续存在，则需要更换色谱柱。可调整梯度以增加特定肌醇多磷酸物种之间的分离度，或缩短整体运行时间。使用不同的高效液相色谱系统（具有不同的死体积或毛细管体积）会显著影响保留时间。此外，更换色谱柱也会对保留时间产生轻微影响。
  6. 执行 "模拟运行"不使用提取样品，而是向高效液相色谱系统中注入过滤后的超纯去离子水，并运行标准梯度洗脱程序。无需收集馏分。
    注意：步骤 2.6 为可选操作。但在出现以下任一情况时应执行该步骤：新安装了色谱柱；高效液相色谱系统此前用于其他方法；高效液相色谱系统已超过 3 天未使用；前一次运行出现问题。

3. 植物培养及用[3H]-myo-肌醇进行标记

注意：以下步骤应使用无菌组件并在无菌条件下进行，操作时需佩戴手套，以防止放射性标记物污染双手。植物培养基尤其是含有蔗糖时，容易发生微生物污染。

  1. 用1 mL 1.2%次氯酸钠对A. thaliana种子进行3分钟的灭菌处理，随后用1 mL 70%乙醇再处理3分钟。然后加入1 mL 100%乙醇，用移液器将种子连同乙醇转移至圆形滤纸上，并在洁净台的层流条件下晾干。
    1. 若使用L. japonicus种子，在灭菌前应将其置于研钵中，并用砂纸轻轻研磨种子表面，以确保足够的发芽率。
  2. 将Arabidopsis种子播种于装有固体培养基的方形培养皿中，每皿播1–2行。培养基成分为：半强度Murashige和Skoog（MS）盐溶液、1%蔗糖、0.7%凝胶多糖（gellan gum），用KOH调节去离子水溶液pH至5.7。播种后于4 °C黑暗条件下层积处理至少1天。
    1. 对于Lotus种子，将其播种于装有固体培养基的方形培养皿中，每皿1行。培养基成分为：0.8%细菌学琼脂溶于去离子水中。播种后于4 °C黑暗条件下层积处理至少3天。
  3. 将培养皿垂直放置于生长培养箱或气候室中，在短日照条件下（22 °C光照8小时，20 °C黑暗16小时）培养10–12天。
  4. 将10–20株幼苗转移至一个12孔透明平底细胞培养板的单孔中，每孔含2 mL半强度MS盐溶液，并添加1%蔗糖，调节pH至5.7。
  5. 加入45 µCi的[3H]-myo-肌醇（30–80 Ci/mmol，溶于90%乙醇中），轻轻旋转混匀。用配套盖子盖好培养板，并用微孔外科胶带（例如Micropore或Leucopore胶带）密封，然后放回培养箱中继续培养。
    警告：[3H]为低能量β射线发射体，若被吸入、摄入或通过裸露皮肤吸收，可能造成辐射危害。操作放射性物质或与放射性物质直接或间接接触的设备时，必须始终佩戴手套。同时应遵守当地关于放射性化学品安全操作的规定（例如穿戴额外防护服、使用剂量计，并定期检测表面污染情况）。
  6. 标记5天后，将幼苗从培养基中取出，用去离子水短暂冲洗，用纸巾吸干水分，转移至1.5 mL微量离心管中。切勿过度填充离心管，每管所加鲜重不得超过100 mg，相当于约10–20株17天龄的幼苗。
    注意：植物材料过多会在提取过程中稀释酸液，显著降低提取效率。
    1. 将离心管在液氮中迅速冷冻，并于-80 °C保存直至进行提取。
      注意：样品可在-80 °C保存数周而不影响样品质量。可根据特定实验或植物种类的需求调整生长条件（如培养基、光照、温度和时间）。然而，在稀释[3H]-myo-肌醇时需格外注意，以确保获得可定量且高质量的SAX-HPLC检测结果。因此，建议初始使用本方案所述的[3H]-myo-肌醇浓度，并根据需要逐步降低。在标记期间，可对植物施加不同处理（如环境胁迫或化学试剂），以评估这些条件对总肌醇磷酸（InsPs）的影响。为达到稳态标记，建议标记时间不少于5天。

4. 可溶性肌醇多磷酸的提取

注意：整个提取过程中，样品和试剂均需置于冰上。由于接触放射性物质的风险较高，尤其是在研磨过程中，务必佩戴手套和防护眼镜。所有接触过样品的物品均被视为放射性废物，应根据当地关于放射性物质安全处置的规定进行处理。

  1. 按照步骤 2.1 配制提取缓冲液和中和缓冲液的工作液。每个样品需要 600 µL 提取缓冲液和 400 µL 中和缓冲液。将缓冲液置于冰上保存。
  2. 从 -80 °C 冰箱中取出样品，并在进一步处理前保持在液氮中。使用微型离心管研磨杵研磨样品，直至样品开始解冻，然后加入 500 µL 冰冷的提取缓冲液。继续研磨，直到样品完全均质化，溶液呈现深绿色（如果样品中含有 叶片）。
  3. 在 4 °C 条件下，以 ≥ 18000 x g 离心 10 分钟。将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。请注意，用于提取的离心管被视为固体放射性废物，需按规定妥善处理。
  4. 小心地向提取物中加入 300 µL 中和缓冲液。蛋白质沉淀和气泡会立即开始产生。一分钟后，用移液器枪头轻轻涡旋混合，静置数秒后，吸取少量（5 µL）溶液滴在 pH 试纸上（理想范围为 pH 6–9）。最终 pH 值应在 pH 7 至 8 之间。
    1. 如有必要，逐次加入少量（通常为 10–20 µL）中和缓冲液或提取缓冲液，直至达到目标 pH 值。将样品敞口置于冰上静置至少 1 小时。
  5. 在 4 °C 条件下，以 ≥ 18,000 x g 离心 10 分钟。将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。
    注意：样品可直接用于 SAX-HPLC 分析，或在同一天内稍后使用时置于冰上保存，也可在液氮中速冻后于 -80 °C 保存 2‒4 周。为确保高重复性和可比性，建议即使后续立即使用，也始终将样品在液氮中冷冻 5 分钟。提取后的样品可在 -80 °C 长期保存，前提是仅允许解冻一次。若使用冻存样品进行分析，务必确保解冻后无可见颗粒。如有颗粒，需再次在 4 °C 条件下以 ≥ 18,000 x g 离心 10 分钟，并将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。

5. 进行高效液相色谱运行

  1. 为馏分收集器配备96个小型闪烁小瓶（容量约为6 mL），并在每个小瓶中加入2 mL适合低pH值和高浓度磷酸铵缓冲液的闪烁液（例如Ultima-Flo AP液体闪烁液）（参见材料表）。
    注意：小瓶的数量和大小取决于所使用的馏分收集器和闪烁计数器。如果使用此处描述的梯度，至少收集前90个馏分，以获得完整的肌醇多磷酸谱图。同时务必正确标记每个小瓶及其对应的瓶盖，以防止馏分或样品混淆。
  2. 启动高效液相色谱（HPLC）系统/泵并准备运行。启动活塞密封清洗功能，并在整个运行过程中保持开启。使用合适的注射器（参见材料表），通过手动进样方式将步骤4.5中的全部上清液（约750 µL）注入系统。如果可进行自动进样，则将样品转移至相应的样品小瓶中。将阀门从“加载”位置切换至“进样”位置，并启动梯度程序和馏分收集器。
    注意：根据所使用的HPLC系统不同，启动程序可能有所差异，尤其是在比较旧型号系统（如本文所述）与完全由软件控制的新机型时。必须确保梯度洗脱、样品进样和馏分收集同时开始。
  3. 在HPLC运行过程中，定期检查系统压力。初始压力应约为18–24 bar（1.8–2.4 MPa），当达到100%缓冲液B时，压力应缓慢上升至50–60 bar（5–6 MPa）。
    警告：压力降低可能表明系统存在泄漏，而压力升高则提示系统堵塞。短时间内压力波动（≥3 bar/几秒）可能表明系统中存在气泡。请注意，从色谱柱流出的所有物质，以及进样器或后续部位发生的任何泄漏物均为放射性物质。
    注意：系统压力也取决于HPLC设备本身，可能高于或低于此处所述数值。大约经过15–20次运行后，压力会缓慢升高，但这并不一定影响所得结果的质量。
  4. 运行结束后，紧密关闭小瓶，并通过剧烈振荡使馏分与闪烁液充分混合。可立即进行测量，或将小瓶直立存放，最好避光保存。
    注意：与闪烁液混合后的馏分可在数周内保持稳定，可后续测量。由于氚的半衰期为12.32年，信号衰减可忽略不计。
  5. 当日最后一个样品运行结束后，关闭两台HPLC泵。
  6. （可选）为了延长系统使用寿命，特别是在不经常使用的情况下，可通过将缓冲液B的毛细管插入装有缓冲液A的瓶子中，让泵运行10–15分钟，以清洗泵B及毛细管。下次使用前，请记住将毛细管重新插入缓冲液B中，并将泵B从混合器上断开，用缓冲液B冲洗。待泵和毛细管再次充满缓冲液B后，重新连接至混合器，系统即可再次使用。

6. 测定组分比例

  1. 将小瓶插入闪烁计数器样品架中，并使用液体闪烁计数器对每个小瓶测量5 min。
  2. 理想情况下，应使用可直接容纳小瓶的样品架，避免将小瓶悬挂在较大的（例如20 mL）小瓶中，以减少计数误差。本方案中使用的软件设置见补充图1。
    注意：应定期使用未淬灭的[3H]标准品执行SNC（自归一化与校准）程序。可采用较短的计数时间（1–5 min）以减少等待时间。然而，为确保较高的计数重复性和准确性，建议计数时间为5 min。

7. 数据分析

  1. 将闪烁计数器的测量结果导出为电子表格文件或兼容/可转换的文件格式。使用配备 Excel 或类似软件以及 Origin 等合适分析软件的计算机对数据进行评估。
  2. 绘制二维线图，以每分钟计数（cpm）为纵坐标，保留时间（retention time）为横坐标（见图1、图2）。
  3. 为比较不同样品之间的数据，需对数据进行归一化处理，方法是分别对每个样品从第25分钟至第96分钟洗脱的各组分的cpm值进行加和。
    注：选择第25分钟作为截断点，是为了在分析中排除未掺入的[3H]-myo-肌醇、InsP1和InsP2，因为这些组分的信号波动较大，且难以良好分离（至少在本方案所建议的梯度条件下），其高放射性会显著影响归一化因子的准确性。
  4. 将所有样品的数据归一化至在第25–96分钟区间内总cpm值最低的样品：用该最低总cpm值除以其他各样品在相同区间（第25–96分钟）的总cpm值，得到归一化因子；随后将每个组分的cpm值乘以该因子，实现各组分数据的归一化。
    注：最终，所有相互比较的样品在第25分钟至结束区间内cpm值的总和应相等。当以实际谱图形式在同一图表/图示中展示多个分析结果时，仅应使用已归一化的数据。 补充图2 展示了这些计算步骤的示例（为简化起见，仅使用两个样品的第25–35分钟组分）。然而，在某些情况下无需进行数据归一化。例如，当按照步骤7.4对峰进行定量，并以占总InsPs的百分比形式呈现结果时（如图3D所示）。如前所述，当将多个分析结果并列以谱图形式展示，或需依据实际测得的放射性强度得出结论时（例如，处理a） 使InsP7较对照组增加x%，此处参考的是两个样品InsP7的cpm值，而非其占总InsPs的百分比），则必须进行归一化处理。若要分析基因型或处理方式差异对标记效率的影响，则不应进行归一化，否则会掩盖这些差异。但需注意，使用本方法进行绝对定量较为困难，因为本方案的提取效率可能因多种原因而存在变异性，甚至在相同基因型和处理条件的重复实验中也可能观察到差异。此外，根据所使用的HPLC系统、色谱柱及梯度程序的不同，截断时间可能需要相应调整。
  5. 为对特定肌醇多磷酸峰进行相对定量分析，并进一步生成包含重复实验数据的柱状图用于统计分析，请继续使用专业软件对色谱图进行峰面积计算（例如Origin软件）。参见补充图3。
    注：大多数由软件控制的HPLC系统均配备具备此功能的专用软件。峰的确定依据是cpm值高于背景信号（背景在不同运行间有一定波动）且保留时间与已发表文献数据相似的组分。特定峰的保留时间可在电子表格软件（如Excel）中确定，并用于在分析软件（如Origin）中指定峰范围以计算定积分。补充图3 示意了峰识别、背景扣除及峰面积积分的过程。

结果

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此处展示的结果旨在说明在技术和生物学层面变化下可能获得的结果。前者以使用新柱与老化柱的分析（图1）以及新鲜样品与储存样品的分析（图3）为例；后者则通过分析两种不同植物系统——A. thaliana（图1、图3）和 L. japonicus（图2）——的提取物来体现。

图 1A‒C 展示了一次理想的 SAX-HPLC 运行结果，显示了在闪烁计数后从 A. thaliana 提取物中获得的完整肌醇多磷酸谱。请注意，各峰分离良好，可根据先前描述的色谱迁移率将其分配给不同的异构体（或对映体对）5,7。

图2 展示了SAX-HPLC分析的代表性结果 L. japonicus 在相同条件下培养和标记的幼苗 拟南芥 幼苗。尽管目前所知的InsP种类和峰谱可能均来自 拟南芥 可以看出，在比较两种物种的图谱时，特定InsP异构体的相对含量（例如异构体之间的比例）存在显著差异。例如，莲属（Lotus）提取物中InsP的相对含量有所增加3c, InsP4b, InsP5b 且降低 InsP3a, InsP4a, InsP5a 和 InsP5c 与……相比 拟南芥 这为进一步的研究留下了空间。 图 2D 展示不同InsP异构体之间的比例差异 拟南芥 和 莲.

图3展示了在提取后分成两份的同一样本的两种InsP谱图。其中一半样本立即进行分析，另一半则在-80 °C保存一天后进行分析。请注意，不同样本之间仅观察到微小差异（即图3A‒C和图3D中的黑色和红色曲线）。这表明一次冻融循环不会对样本造成影响，且该方法本身可产生可重复的结果。

用于分析肌醇磷酸盐的高效液相色谱图；保留时间与活性关系；图中标签为 A-D。
图1：采用本实验方案获得的成功与失败的SAX-HPLC分析中典型的InsP谱图。（A‒C）对17日龄野生型（Col-0）拟南芥幼苗使用[3H]-myo-肌醇进行放射性标记后所得的SAX-HPLC谱图。肌醇磷酸盐（InsP）的全局提取与SAX-HPLC检测在同一天完成。（A）全谱图；（B、C）A图谱的局部放大。所有可见峰均被标出并归类至相应的InsP种类。根据已发表的色谱迁移率数据5,7，InsP4a可能代表Ins(1,4,5,6)P4或Ins(3,4,5,6)P4，InsP5a代表InsP5 [2-OH]，InsP5b代表InsP5 [4-OH]或其对映体形式InsP5 [6-OH]，InsP5c代表InsP5 [1-OH]或其对映体形式InsP5 [3-OH]。InsP3a-c、InsP4b、InsP7和InsP8的异构体性质目前仍不明确。图（D）显示的是生长条件相同的植物样品，但使用了已老化色谱柱（>40次运行后）所获得的SAX-HPLC谱图。可见InsP6信号明显减少，且检测不到焦磷酸肌醇（PP-InsPs）。请点击此处查看该图的高清版本。

植物样品中肌醇磷酸（InsP）含量的HPLC色谱图与柱状图比较。
图2：L. japonicus 植物的代表性InsP谱图。 对17日龄野生型（Gifu）L. japonicus 幼苗用[3H]-myo-肌醇进行放射性标记后所得的SAX-HPLC谱图（A‒C）。(A) 完整谱图；(B、C) A图谱的局部放大。所有可见峰均被标出并归类至相应的InsP种类。根据已发表的色谱迁移率5,7，InsP4a 可能代表Ins(1,4,5,6)P4 或Ins(3,4,5,6)P4，InsP5b 可能代表InsP5 [4-OH] 或其对映体形式InsP5 [6-OH]，InsP5c 可能代表InsP5 [1-OH] 或其对映体形式InsP5 [3-OH]。InsP3a-c、InsP4b、InsP7 和InsP8 的异构体性质尚不明确。(D) A. thaliana（数据来自图1A‒C）与L. japonicus（数据来自图2A–C）中各InsP种类（以洗脱峰25‒96的总放射活性百分比表示）的比较。请点击此处查看该图的放大版本。

HPLC chromatograms and bar chart comparing InsP content in fresh vs frozen samples; retention time data.
图3：分装样品的InsP谱图，展示SAX-HPLC分析的可重复性。 (A‒C) 野生型（Col-）17天龄植株的SAX-HPLC图谱0) 拟南芥 用[3H]-myo-肌醇。运行前，将样品分为两份，其中一份立即上样运行，另一份在-80 °C保存一天后运行。A）全光谱；（B, CA图所示谱图的放大细节。所有可见峰均被标出并对应至相应的InsP种类。依据已发表的色谱迁移率5,7, InsP4a 很可能代表 Ins(1,4,5,6)P4 或 Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a 代表 InsP5 [2-OH], InsP5a 代表 InsP5 [2-OH], InsP5b 代表 InsP5 [4-OH] 或其对映异构体 InsP5 [6-OH] 和 InsP5c 代表 InsP5 [1-OH] 或其对映异构体 InsP5 [3-OH]。InsP的异构体性质3a-c, InsP4b, InsP7，以及 InsP8 仍不明确。面板 D 显示InsP的定量结果6 以及PP-InsPs InsP7 和 InsP8 两次运行的结果均如此。数值表示相应InsP种类占所有InsP的百分比（基于洗脱组分25–96的总放射活性）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图1：使用液体闪烁计数器进行液体闪烁计数的软件设置。 图示展示了本方案中用于[3H]样品闪烁计数所使用的软件版本及相关设置。 请点击此处下载该图。

补充图2：数据归一化的代表性示例。 工作表的截图展示了将SAX-HPLC运行结果相互归一化所用的全部步骤和公式。为简化起见，仅显示样品的25–35号组分。请点击此处下载该图。

补充图3：使用分析软件进行峰识别、背景扣除和积分。 （A）将SAX-HPLC分析的数据导入软件（28–96分钟），并选择峰分析工具。（B‒E）通过在各个峰之间设置点手动定义基线，并扣除背景。（F）根据峰的形态特征及已发表的色谱迁移率手动确定峰5,7。（G）通过每分钟计数（cpm）值手动定义峰的范围。（H）对峰进行积分，并计算其占所有峰的百分比。请点击此处下载该图。

讨论

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本文介绍了一种多功能且灵敏的方法，用于定量植物提取物中的肌醇多磷酸盐（InsPs），包括焦磷酸肌醇多磷酸盐（PP-InsPs），并提供了建立该方法的实用建议。尽管该方案总体上具有良好的稳健性，但仍可能出现次优的运行或分析结果。大多数情况下，这些异常运行可通过高度磷酸化的InsPs显著减少甚至完全丢失来识别，尤其是PP-InsP类物质InsP7和InsP8。可能的原因包括植物材料的微生物污染，以及在提取过程中由于植物材料研磨或解冻不充分，导致其未能立即与提取缓冲液接触，从而未能充分灭活内源性植物PP-InsP水解酶。其他原因还包括中和缓冲液添加不足或过量导致pH调节不准确，或样品量不足。后者可能导致PP-InsPs难以被检测，因为这些物质在细胞中通常含量极低。在步骤3.5中，若样品量过多或干燥不充分，可能导致高氯酸被稀释，从而同样造成酶灭活不充分，并特异性地导致InsP6和PP-InsPs的损失。本方案中所用的植物材料量以及放射性标记物的用量均基于成本与性能进行了优化，因此接近仍能获得理想结果的最低用量。此外，色谱柱树脂的分辨率会随着使用逐渐下降 。这一过程的最初表现（作者尚未完全明确其原因）是在高效液相色谱（HPLC）谱图中特异性地丢失高度磷酸化的InsP种类，如PP-InsPs。随着树脂进一步老化，甚至InsP6也无法被色谱柱有效分离（图1D）。因此，使用性能良好的色谱柱，以及对样品进行细致处理和对HPLC组件进行妥善维护，对于确保结果的准确性至关重要。

在比较样品和运行结果时，尤其是使用不同设备（例如高效液相色谱系统和色谱柱）或在不同日期获得的结果，必须对样品进行相互归一化处理（如步骤7.3所述），并以相同的方式进行分析。只有通过归一化，才能准确地在同一张图中展示多个样品（图3）。若要相对于总肌醇多磷酸（total InsPs）或某一特定肌醇多磷酸（InsP）分子来定量各个InsP，则无需进行归一化，前提是仅展示相对值而非绝对值。理想情况下，应同时展示InsP谱图和定量结果。然而，在某些情况下，难以在同一张图中充分展示两个或更多的运行结果。不同的保留时间或背景活性水平的差异可能使得仅依靠未定量的SAX-HPLC谱图进行比较变得困难。当需要比较大量样品时，同样存在此类问题。在此类情况下，有必要使用其他软件（例如Origin）对各个峰进行单独定量分析。

作者意识到本文所述方案可进一步优化，并需根据每个具体的研究问题进行调整。尽管本方案针对Arabidopsis提取物进行了优化7,17，但该方法具有广泛适用性，也可用于分析其他植物物种的InsP谱型。本文首次展示了L. japonicus的InsP谱型，以示例说明该方法的普适性，此分析过程中无需对标记条件、InsP提取或SAX-HPLC运行程序进行任何修改（图2）。值得注意的是，尽管总体相似，L. japonicus与Arabidopsis的InsP谱型之间仍存在差异。例如，在L. japonicus中，InsP5 [4-OH]或其对映体形式InsP5 [6-OH]的含量高于InsP5 [1-OH]或其对映体形式InsP5 [3-OH]，而在Arabidopsis中，InsP5 [1-OH]或其对映体形式InsP5 [3-OH]则是主要的InsP5组分。同样，我们预计培养基成分、[3H]-myo-inositol浓度、植株生长阶段、环境条件（如光照和温度）、化学物质添加或植物-微生物互作等因素的改变，可能需要进行测试并相应调整。

需要考虑的该方法的一个重要缺点是，标记过程是在（无菌）液体培养基中进行的，而这种环境并不代表大多数陆生植物的生理状态。此外，由于[³H]-myo-inositol成本较高，标记溶液的体积和培养容器的尺寸通常受到限制，这也限制了可使用植物的大小。可通过将[³H]-myo-inositol直接渗透到土壤中生长的植物叶片中，然后按照本文所述方案进行操作，从而避免液体培养，如先前报道所述10。

与替代方法（如TiO₂富集法）相比，本方案存在若干不足之处2 下拉实验结合聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或基于质谱的技术。由于[3H]-myo-肌醇标记，仅直接来源于放射性标记的InsP种类 myo-inositol 最终将被检测到。此处所述方法无法识别其他肌醇异构体，例如 scyllo-肌醇及其他异构体，其中一些已在特定植物中被发现44此外， myo- 来自其他通路的InsPs将被排除，包括由以下途径合成的InsPs： 从头合成 合成 myo-肌醇和 myo-肌醇-3-磷酸，通过葡萄糖-6-磷酸在催化作用下的异构化反应生成 myo-肌醇-3-磷酸合酶（MIPS）蛋白45。尽管[32P] 或 [33P]-正交-磷酸盐可作为替代标记物，但其使用存在主要缺点，因为所有含磷酸盐的分子（包括丰富的核苷酸及其衍生物）都将被标记。这些分子也可通过本方案提取并结合到SAX柱上，导致背景活性显著升高，从而干扰各个肌醇磷酸（InsP）峰的鉴定5此外，对[32P]- 或 [33放射性标记的InsPs和PP-InsPs可能受到磷酸基团和焦磷酸基团转化的显著影响，因而可能无法反映肌醇化合物的实际质量水平。

另一方面，[3H]-myo-肌醇可特异性标记含myo-肌醇的分子，例如肌醇多磷酸（InsPs）、含肌醇的脂类（如磷脂酰肌醇）以及龙胆二糖醇。然而，本实验方案仅分析InsPs，因为脂类在提取缓冲液中不溶解，而龙胆二糖醇无法结合SAX 柱。

迄今为止，通过[3H]-myo-肌醇标记与TiO2下拉/PAGE方法所获得的植物InsP谱图之间的差异仍不清楚，因为在植物中尚未进行此类比较。最近一项动物细胞研究探讨了这一问题46。该研究通过比较哺乳动物细胞系的SAX-HPLC谱图与PAGE凝胶结果，鉴定出一类在[3H]-myo-肌醇标记中不可见、因而应直接由葡萄糖-6-磷酸衍生而来的InsP6池。在磷酸盐饥饿24小时后，通过TiO2下拉纯化InsP并进行PAGE凝胶定量，InsP6含量增加了150%；而对经相同处理的[3H]-myo-肌醇标记细胞进行SAX-HPLC分析，仅检测到[3H]-InsP6增加了15%。如前所述，在大多数情况下，PAGE分析无法检测到低于InsP5的InsP。只要质谱分析方案尚未优化至可有效检测这类高度带负电荷的分子，放射性标记结合SAX-HPLC似乎是首选方法。

另一个尚未解决的挑战是在SAX-HPLC分析（或任何其他用于InsP分析的方法）中区分对映异构体10,17。该挑战可通过添加手性选择剂来解决，即使用如L-精氨酸酰胺等对映体纯的化合物，这些化合物可与相应的对映异构分子相互作用，形成可分离的非对映异构复合物10。据我们所知，该方法迄今仅被用于通过核磁共振（NMR）分析来区分InsP5对映异构体InsP5 [1-OH]和InsP5[3-OH]10。对于其他对映异构体对的区分，或通过手性SAX-HPLC分析或基于手性PAGE的方法成功区分对映异构体，目前尚未见报道，仍需进一步开发。考虑到PP-InsPs的合成及其在磷素可利用性条件下的保守调控机制，我们预期，特别是非放射性方法，如PAGE或质谱（MS）相关方法，结合营养成分分析，将有助于“真实数据”验证工作，以校准用于诊断作物养分缺乏的遥感数据17,18,24,25。然而，本文所介绍的方法目前仍可被视为InsP分析的金标准，并将在揭示这些引人入胜的信号分子在植物中新的生物学功能方面发挥关键作用。

披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG，德国研究基金会）根据德国卓越战略资助——卓越集群 EXC-2070 – 390732324（PhenoRob）、研究培训组 GRK2064，以及授予 G.S. 的个人研究项目 SCHA1274/4-1 和 SCHA1274/5-1。我们还感谢 Li Schlüter 和 Brigitte Ueberbach 提供的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
离心机Eppendorf AG型号：5430 R
磷酸氢二铵，≥97%Carl Roth GmbH + Co. KG0268.1
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物，≥99%，p.a.，ACSCarl Roth GmbH + Co. KG8043.2
Falcon 12孔透明平底TC处理多孔细胞培养板，带盖，独立包装，无菌Corning Inc.353043
组分收集器LAMBDA Instruments GmbH型号：OMNICOLL 单通道收集器
培养孵育箱poly klima GmbH型号：PK 520-LED
HPLC泵Kontron Instruments型号：420
用于Rheodyne阀的HPLC进样器，1 mLHamilton Company81365
HPLC进样器Supelco型号：Rheodyne 9725
肌醇，myo-[1,2-3H(N)]American Radiolabeled Chemicals Inc.ART 0261
液氮University, Chemistry Department
液体闪烁计数器PerkinElmer Inc型号：TRI-CARB 2900TR
微型研磨棒Carl Roth GmbH + Co. KGCXH7.1
混合纤维素酯滤膜，ME系列（ME 24），无衬片，孔径0.2 µm，直径47 mm圆形GE Healthcare Life Sciences10401770
HPLC混合器Kontron Instruments型号：M 800
Murashige & Skoog培养基，盐混合物Duchefa BiochemieM0221
OriginPro软件OriginLab Corp.
正磷酸，≥85%，p.a.，ISOCarl Roth GmbH + Co. KG6366.1
Partisphere 5 µm SAX柱，125 × 4.6 mmHichrom Limited4621-0505
高氯酸，70%，99.999%痕量金属级Sigma-Aldrich311421
培养皿，方形，聚苯乙烯材质，透明，120/120/17 mm，无菌Greiner Bio One International GmbH688161
pH指示试纸，pH 5.5 - 9.0，NeutralitMerck KGaA109564
PhytagelSigma-AldrichP8169
碳酸钾Carl Roth GmbH + Co. KGP743.2
安全锁扣管，1.5 mLEppendorf AG30120086
9725型进样器用样品环，体积2 mL，PEEK材质Supelco57648
SNAPTWIST闪烁瓶，6.5 mLSimport Scientific Inc.S207-5
无菌操作台LaboGene型号：ScanLaf MARS 900
蔗糖，≥99.5%，p.a.Carl Roth GmbH + Co. KG4621.1
Ultima-Flo AP液体闪烁液PerkinElmer Inc6013599
超纯去离子水Milli-Q
无扳手WVS端接套件Hichrom Limited4631-1001

参考文献

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SAX HPLC H HPLC Arabidopsis thaliana

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