方法文章

创伤性脑损伤后神经炎症与血流动力学反应的系统分析

DOI：

10.3791/61504

⸱

2022年5月27日

 ,  ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本方案介绍了用于表征轻度创伤性脑损伤后神经炎症和血流动力学反应的方法，并将这些数据整合到基于偏最小二乘回归的多变量系统分析中。

摘要

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轻度创伤性脑损伤（mTBI）是一个重要的公共卫生问题。反复暴露于mTBI可能导致累积性、持久性的功能缺陷。我们团队及其他多个研究已表明，mTBI可刺激细胞因子表达并激活小胶质细胞，降低脑血流量和脑代谢水平，并损害脑血管反应性。此外，多项研究报道了这些神经炎症和血流动力学标志物紊乱与认知功能障碍之间的关联。本文详细介绍了在小鼠中表征mTBI后神经炎症和血流动力学组织反应的方法。具体而言，我们描述了如何实施一种落锤式mTBI模型，如何利用一种名为扩散相关光谱（diffuse correlation spectroscopy）的非侵入性光学技术纵向测量脑血流量，以及如何对脑组织样本进行Luminex多重免疫分析，以定量检测响应并调控小胶质细胞及其他神经免疫细胞活性的细胞因子和免疫调节性磷酸化蛋白（例如MAPK和NFκB信号通路中的蛋白）。最后，我们阐述了如何采用多变量系统分析方法整合这些数据，以理解各变量之间的相互关系。明确这些生理学与分子变量之间的关联，最终将有助于我们识别导致mTBI的潜在机制。

引言

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概述
轻度创伤性脑损伤（mTBI）每年影响约 160 万至 380 万名运动员1。这类损伤包括亚震荡性和震荡性损伤，可能导致患者出现短暂的生理、情绪、心理和认知症状2。此外，在“易损时间窗”内发生的重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）可导致认知障碍的严重程度和持续时间累积加重，其影响远超过单次 mTBI 的后果3，最终甚至可能导致永久性功能丧失4,5,6。尽管许多患者在较短时间内（<1 周）即可恢复，但仍有 10–40% 的患者会经历持续超过 > 1 个月的长期影响，部分症状可持续长达 1 年3,7,8,9。尽管此类损伤发生率高且后果持久，但其损伤机制尚不明确，目前尚无有效的治疗策略。

鉴于轻度创伤性脑损伤/反复轻度创伤性脑损....

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方案

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所有动物实验程序均经埃默里大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》。

1. 轻度创伤性脑损伤的落体打击模型

  1. 准备落锤装置。将台钳固定在平坦表面上，并垂直安装一根1米长的导向管（内径2.54 cm），使用水平仪校准。使用一个54 g的螺栓（基本体径0.95 cm，头部直径2 cm，长度10.2 cm）进行冲击。
  2. 短暂麻醉小鼠。使用100%氧气中含4.5%异氟烷诱导麻醉45秒。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉深度足够。
  3. 诱导损伤。
    1. 迅速将小鼠从麻醉状态中取出，使其俯卧于一层薄膜（11.2 cm × 21.3 cm组织膜）中央。
    2. 双手拉紧组织膜，使小鼠保持俯卧于中央位置，并用拇指固定其尾部。将小鼠头部置于导向管正下方（图2）。
    3. 从导向管顶端释放螺栓，使其撞击小鼠头部背侧，目标区域为眼后部与耳前部之间。撞击时，小鼠会穿透组织膜，从而实现头部以颈部为轴的快速加速（图2）。
  4. 恢复
    1. 撞击后，将小鼠仰卧置于室温空气中的37 °C加热垫上。监测伤后1小时内的恢复情况。在1小时内，小鼠应能正常行走、自主寻找食物和水，....

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结果

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先前收集的数据来自之前的研究，其中一组八只 C57BL/6 小鼠每日一次接受三次闭合性头部损伤（图2）11。在本研究中，最后一次损伤后 4 小时，采用扩散相关光谱法测量脑血流（图3、图4）。在损伤后脑血流评估完成后，动物被实施安乐死，并提取脑组织，通过免疫分析法对细胞因子和磷酸化蛋白进行定量（图5）。我们还通过 Western blot 对吞噬细胞/小胶质细胞活化标志物 Iba1 进行定量（方法见11）。每只小鼠的脑组织被裂解，并使用 BCA 法测定总蛋白浓度。采用 Milliplex MAP 小鼠细胞因子/趋化因子 32 重检测试剂盒进行多重细胞因子定量，并使用 Luminex MAGPIX 系统读取结果（图6）。在采集所有样本数据之前，进行了线.......

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讨论

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本文详细介绍了评估重复性轻度创伤性脑损伤后血流动力学和神经炎症反应的方法。此外，我们还展示了如何将这些数据整合到基于偏最小二乘回归的多变量系统分析中。下文将讨论该方案中一些关键步骤和局限性，以及这些方法相较于现有方法的优势与不足。

轻度创伤性脑损伤的落锤模型。 这种创伤性脑损伤诱导方法的优势在于，其模拟了运动相关性头部损伤中常见的钝性冲击后迅速出现的前后向旋转加速度10,19。诚然，平滑脑的小鼠大脑并不能完全再现具有脑回结构的人类大脑的复杂性；然而，该模型确实可引发许多与人类轻度创伤性脑损伤（mTBI）相似的临床和行为后遗症，包括在重复损伤后出现持续的空间 学习与记忆功能缺陷。此外，尽管该模型的冲击性质较轻（无结构性或神经元损伤、无血脑屏障通透性改变、认知缺陷仅在多次冲击后出现等19），但其确实会引起明显的意识丧失，这与人类中意识丧失较为少见的情况形成对比。这种更显著的意识丧.......

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致谢

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本项目由美国国立卫生研究院R21 NS104801（EMB）和R01 NS115994（LBW/EB）以及亚特兰大儿童保健中心青年教员重点奖项（EMB）资助。本研究还获得了美国国防部通过国会指定医学研究项目（Award No. W81XWH-18-1-0669，LBW/EMB）的支持。文中观点、解释、结论和建议均为作者意见，并不一定代表美国国防部的观点。 本材料基于美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（Grant No. 1937971）资助的研究工作。本材料中表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者意见，并不一定反映美国国家科学基金会的立场。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
可调移液器任意可调移液器
铝箔VWR89107-726
Bio-Plex 细胞裂解试剂盒C Bio-Rad171304012
BRAND BRANDplates pureGrade 微孔板，非无菌BrandTech781602 96
Complete mini 蛋白酶抑制剂片剂Sigma-Aldrich11836153001
脱毛膏AmazonNair
去离子水（DiH2O）VWRVWRL0200-1000
用于96孔平底板的手持式磁力分离架Millipore Sigma 目录40-285
硬件自相关器板www.correlator.comFlex05-8ch
异氟烷 250 mLMED-VET INTERNATIONALRXISO-250
Kimwipe（11.2 × 21.3 cm）VWR21905-026
实验室涡旋混合器VWR10153-838
LabViewNational InstrumentsLabVIEW
Luminex 200、HTS、FLEXMAP 3D 或 MAGPIX 配 xPONENT 软件Luminex Corporation
Luminex 驱动液LuminexMPXDF-4PK
Luminex 包被液EMD MilliporeSHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP 小鼠细胞因子/趋化因子磁珠检测面板 —— 预混 32 重 —— 免疫学多重检测Millipore SigmaMCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK 信号通路 10 重检测试剂盒 —— 细胞信号通路多重检测Millipore Sigma48-660MAG
Mini LabRoller 旋转混合仪VWR10136-084
苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma-AldrichP7626-1G
磷酸盐缓冲液（PBS）VWR97064-158
板封膜机VWR82050-992
聚丙烯微量离心管VWR20901-547
Mini LabRollerMillipore SigmaZ674591
试剂储液槽VWR89094-668
R 编程语言
RStudiowww.rstudio.com
超声破碎仪
滴定板振荡器VWR12620-926
Tween20Sigma-AldrichP9416-50ML
1 米丙烯酸导管McMaster-Carr49035K85
4 光子计数雪崩光电二极管Perkin-ElmerSPCM-AQ4C-IO
400 微米多模光源光纤Thorlabs Inc.FT-400-EMT
54 克螺栓Ace Hardware0.95 厘米基本体直径，2 厘米头直径，10.2 厘米长度
780 纳米单模检测光纤Thorlabs Inc.780HP
852 纳米长相干长度激光器TOPTICA PhotonicsiBeam smart

参考文献

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  1. Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
  2. Iraji, A., et al.

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标签

Luminex

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