方法文章

创伤性脑损伤后神经炎症与血流动力学反应的系统分析

DOI：

10.3791/61504

⸱

2022年5月27日

 ,  ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案介绍了用于表征轻度创伤性脑损伤后神经炎症和血流动力学反应的方法，并将这些数据整合到基于偏最小二乘回归的多变量系统分析中。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

轻度创伤性脑损伤（mTBI）是一个重要的公共卫生问题。反复暴露于mTBI可能导致累积性、持久性的功能缺陷。我们团队及其他多个研究已表明，mTBI可刺激细胞因子表达并激活小胶质细胞，降低脑血流量和脑代谢水平，并损害脑血管反应性。此外，多项研究报道了这些神经炎症和血流动力学标志物紊乱与认知功能障碍之间的关联。本文详细介绍了在小鼠中表征mTBI后神经炎症和血流动力学组织反应的方法。具体而言，我们描述了如何实施一种落锤式mTBI模型，如何利用一种名为扩散相关光谱（diffuse correlation spectroscopy）的非侵入性光学技术纵向测量脑血流量，以及如何对脑组织样本进行Luminex多重免疫分析，以定量检测响应并调控小胶质细胞及其他神经免疫细胞活性的细胞因子和免疫调节性磷酸化蛋白（例如MAPK和NFκB信号通路中的蛋白）。最后，我们阐述了如何采用多变量系统分析方法整合这些数据，以理解各变量之间的相互关系。明确这些生理学与分子变量之间的关联，最终将有助于我们识别导致mTBI的潜在机制。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

概述
轻度创伤性脑损伤（mTBI）每年影响约 160 万至 380 万名运动员1。这类损伤包括亚震荡性和震荡性损伤，可能导致患者出现短暂的生理、情绪、心理和认知症状2。此外，在“易损时间窗”内发生的重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）可导致认知障碍的严重程度和持续时间累积加重，其影响远超过单次 mTBI 的后果3，最终甚至可能导致永久性功能丧失4,5,6。尽管许多患者在较短时间内（<1 周）即可恢复，但仍有 10–40% 的患者会经历持续超过 > 1 个月的长期影响，部分症状可持续长达 1 年3,7,8,9。尽管此类损伤发生率高且后果持久，但其损伤机制尚不明确，目前尚无有效的治疗策略。

鉴于轻度创伤性脑损伤/反复轻度创伤性脑损伤（mTBI/rmTBI）后结局的高度变异性，从终末期mTBI/rmTBI研究获取的组织中识别早期分子触发因素的一个挑战在于缺乏纵向数据以明确证实相关分子变化 "急性分子关联" 这些分子触发因素与长期结果之间的关联。为应对这一挑战，本课题组发现，急性脑血流量减少 通过急性测量使用 一种名为扩散相关光谱（DCS）的光学工具，在重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）小鼠模型中与长期认知预后密切相关。10利用这一血流动力学生物标志物，我们发现脑血流量急性降低的小鼠（进而提示长期预后更差）同时出现神经元内MAPK和NFκB信号通路的磷酸化信号急性升高、神经元中促炎性细胞因子表达增加，以及吞噬细胞/小胶质细胞标志物Iba1的表达上调。11这些数据表明，神经元磷酸化信号传导、细胞因子表达以及小胶质细胞活化可能在脑外伤后脑血流的急性调节中发挥作用，同时也可能触发导致神经元功能障碍和更差认知结局的信号级联反应。本文中，我们详细阐述了在重复性轻度脑外伤（rmTBI）后同时探测血流动力学和神经炎症环境的方法，以及如何整合这些复杂数据集。具体而言，我们概述了该综合方法的四个关键步骤：（1）轻度创伤性脑损伤的落锤模型；（2）利用扩散相关光谱技术评估脑血流；（3）神经炎症环境的定量分析；（4）数据整合图1）。下文将简要介绍这些关键步骤，以帮助读者理解我们方法背后的原理。本论文其余部分将针对每个关键步骤提供详细的实验方案。

轻度创伤性脑损伤的落锤模型
尽管已存在许多优秀的重复性轻度创伤性脑损伤的临床前模型12,13,14,15,16,17,18我们采用一种成熟且具有临床相关性的落锤式闭合性头部损伤模型。该模型的主要特征包括：（1）对完整颅骨/头皮施加钝性冲击，随后头部在颈部允许自由旋转；（2）无明显结构性脑损伤、水肿、血脑屏障破坏、急性细胞死亡或慢性脑组织丢失；（3）仅在多次冲击后出现持续性（长达1年）的认知功能障碍19 (图2).

利用扩散相关光谱法评估脑血流
扩散相关光谱法（DCS）是一种非侵入性光学技术，用于测量血流5,20,21。在 DCS 中，将一个近红外光源置于组织表面，在组织表面距光源一定距离处放置探测器，用于检测在组织中多次散射后的光信号（图3）。运动中的红细胞引起的散射会导致探测到的光强随时间发生波动。通过一种称为相关扩散理论的简单分析模型，可将这些光强波动与脑血流指数（CBFi，图4）关联起来。尽管 CBFi 的单位（cm2/s）并非传统血流单位（mL/min/100 g），但先前在小鼠中进行的一项研究表明，CBFi 与动脉自旋标记 MRI 测得的脑血流量具有高度相关性21。

作为参考，此处使用的 DCS 仪器为实验室自制，包含一个 852 nm 长相干长度激光器、一个由 4 个光子计数雪崩光电二极管组成的阵列，以及一块硬件自相关器板（单 tau，8 通道，最小采样时间为 100 ns）21,22。数据通过使用 LabView 编写的自主开发软件采集。该设备的动物接口由一根 400 μm 多模光源光纤（波长范围 400–2200 nm，纯石英纤芯，TECS 硬包层）和一根 780 nm 单模检测光纤（波长范围 780–970 nm，纯石英纤芯，TECS 硬包层，第二模式截止波长为 730 ± 30 nm）组成，两者相距 6 mm，并嵌入黑色 3D 打印传感器中（4 mm × 8 mm，图 3）。

神经炎症环境的定量分析
尽管神经炎症受到多种细胞过程的调控，但两个关键的相关机制是细胞因子/趋化因子介导的细胞外信号传导以及磷酸化蛋白介导的细胞内信号传导。为了研究脑损伤后的神经炎症环境，从小鼠体内取出脑组织，进行显微解剖，随后使用Luminex技术对细胞因子/趋化因子和磷酸化蛋白进行定量分析（图5，图6，图7）。Luminex多重免疫检测技术通过将酶联免疫吸附测定（ELISA）与荧光标记的磁性微球结合，实现对多种此类蛋白的同时定量。每种目标蛋白使用不同的荧光标签，每种标签的微球均包被有针对该特定蛋白的捕获抗体。用于捕获各种蛋白的数百种微球混合后加入96孔板，并与样本共同孵育。样本孵育后，使用磁铁将微球固定在孔内，随后洗去样本。接着，生物素标记的检测抗体与目标分析物结合，形成类似于传统ELISA的抗体-抗原夹心结构，但每种蛋白的ELISA反应发生在不同荧光标记的微球上。加入藻红蛋白偶联的链霉亲和素（SAPE）以完成每个反应。随后，Luminex仪器读取微球信号，并根据每种荧光标签/蛋白对信号进行区分。

数据整合
由于Luminex检测中测量的分析物（例如细胞因子）数量众多，如果对每个定量蛋白单独分析，数据解读可能较为困难。为了简化分析并捕捉分析物之间的趋势，我们采用一种称为偏最小二乘回归（PLSR，图8）23的多变量分析方法。PLSR通过识别每种被测蛋白（即细胞因子或 磷酸化蛋白，称为“预测变量”）对应的权重轴，共同最优地解释被测蛋白与响应变量（例如脑血流量）之间的协方差。这些权重被称为“载荷”，并组合成一个称为潜在变量（LV）的向量。通过将被测蛋白数据在两个LV上进行投影（称为“得分”），可将数据以这些LV为坐标重新绘图。在计算PLSR后，我们采用方差最大旋转法（varimax rotation）来确定一个新的LV，使其最大化样本在该LV上的投影与预测变量之间的协方差24。该方法使我们能够将LV1定义为最能解释响应变量变异性的轴。LV2则最大化响应变量与LV1残差数据之间的协方差，这可能与样本间的生物学或技术变异性相关。最后，我们进行留一交叉验证（Leave One Out Cross Validation, LOOCV），以确保PLSR模型不严重依赖于任何一个样本23。

在本实验方案中，我们详细描述了表征轻度创伤性脑损伤（mTBI）后神经炎症及血流动力学组织反应的方法。总体工作流程如图1所示。在本方案中，小鼠采用自由落体撞击式闭合性头部损伤模型，接受一次或多次轻度创伤性脑损伤。在损伤前及损伤后多个时间点，纵向测量脑血流量。在需要研究神经炎症变化的时间点，处死动物并取出脑组织。通过显微解剖分离出目标脑区，裂解组织以提取蛋白。裂解液用于多重Luminex免疫分析，检测细胞因子和磷酸化蛋白的表达水平，同时进行Western blot分析。最后，采用偏最小二乘回归分析整合这一综合性数据集。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物实验程序均经埃默里大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》。

1. 轻度创伤性脑损伤的落体打击模型

  1. 准备落锤装置。将台钳固定在平坦表面上，并垂直安装一根1米长的导向管（内径2.54 cm），使用水平仪校准。使用一个54 g的螺栓（基本体径0.95 cm，头部直径2 cm，长度10.2 cm）进行冲击。
  2. 短暂麻醉小鼠。使用100%氧气中含4.5%异氟烷诱导麻醉45秒。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉深度足够。
  3. 诱导损伤。
    1. 迅速将小鼠从麻醉状态中取出，使其俯卧于一层薄膜（11.2 cm × 21.3 cm组织膜）中央。
    2. 双手拉紧组织膜，使小鼠保持俯卧于中央位置，并用拇指固定其尾部。将小鼠头部置于导向管正下方（图2）。
    3. 从导向管顶端释放螺栓，使其撞击小鼠头部背侧，目标区域为眼后部与耳前部之间。撞击时，小鼠会穿透组织膜，从而实现头部以颈部为轴的快速加速（图2）。
  4. 恢复
    1. 撞击后，将小鼠仰卧置于室温空气中的37 °C加热垫上。监测伤后1小时内的恢复情况。在1小时内，小鼠应能正常行走、自主寻找食物和水，且无明显运动功能障碍。
      注：根据机构动物护理与使用委员会的批准，不使用镇痛药物，原因是镇痛可能干扰关键研究参数（如脑血流、炎症标志物）。意识丧失（定义为从麻醉中移出至恢复翻正反射的时间）是预期现象，通常持续20秒至3分钟（补充表1）。可能出现短暂（<30秒）的呼吸暂停和/或类似癫痫的活动，尤其是在每日一次重复性脑损伤后。
  5. 根据需要重复操作。该损伤可每日、每周或每月重复一次。损伤次数及间隔取决于所需损伤严重程度。通常我们采用每日一次、共五次的打击方案，以诱导显著的空间学习与记忆功能障碍。
    注：既往研究表明，每日一次、共五次的打击足以诱导持续超过伤后1年的空间学习与记忆缺陷，且不伴随脑水肿、出血或明显的脑结构损伤19。小鼠每日称重，并密切观察脱水、运动功能障碍和食欲减退等迹象。若出现脱水，给予湿润饲料并每日一次皮下注射1 mL生理盐水。为防止不必要的痛苦并确保人道终点，当出现以下情况时应实施安乐死：脱水持续或加重超过>24小时（皮下生理盐水治疗后）、体重较伤前基线下降超过20%、出现如转圈或拖爪等运动功能障碍且伤后持续>1小时。

2. 采用扩散相关光谱法评估脑血流

  1. DCS 数据采集
    1. 去除头皮上的毛发。由于经颅直流电刺激（DCS）在无毛发的情况下效果最佳，因此在实验开始前需去除头部的毛发。通常在研究开始前1至3天进行脱毛处理。
      1. 用4.5%异氟烷（isoflurane）与100%氧气诱导小鼠麻醉，持续45秒，随后以1–2%异氟烷与100%氧气维持麻醉。
      2. 在眼睛与耳朵之间的头部区域剃毛。然后，使用脱毛膏去除头部的毛发，操作方法同前 图3.
      3. 让动物在加热垫上从麻醉状态中恢复，然后放回笼中。
    2. 使用 DCS 测量脑血流量。为尽量减少测量过程中的运动伪影，应在短暂异氟烷麻醉下对小鼠进行研究。
      注意：在整个测量过程中，需目视监测呼吸及脚趾夹捏反应，并根据需要调整异氟烷浓度，以确保麻醉深度保持一致。由于异氟烷具有已知的血管调节作用，麻醉深度的显著变化可能影响血流。25.
      1. 用100%氧气中的4.5%异氟烷诱导麻醉45秒，随后以100%氧气中的1.0–1.75%异氟烷维持麻醉。通过夹捏脚趾无反应及呼吸正常（约60–80次/分钟）确认麻醉深度足够。
      2. 在稳定2分钟后，轻轻将DCS传感器放置于右侧大脑半球上方，使光学传感器的上边缘与眼睛后缘对齐，传感器侧面沿中线对齐。图3用手掌盖住传感器以遮蔽室内光线。采集5秒数据（采样频率为1 Hz）。
      3. 将传感器移至左侧半球上方，采集5秒数据。
      4. 每半球重复3次，以考虑组织表面下方的局部异质性。
    3. 恢复
      1. 将小鼠移出麻醉状态，并置于加热垫上。
      2. 小鼠恢复翻正反射后，将其放回笼中。
  2. DCS 数据分析
    1. 进行初步质量控制。DCS 数据的每一帧包含一个测得的归一化强度自相关函数， Dynamic light scattering diagram, autocorrelation function g2(τ) for particle size analysis. (图4A）和光子计数率（kHz）。
      1. 为去除存在显著运动伪影的数据帧，应舍弃尾部平均值满足以下条件的数据帧 Dynamic light scattering diagram, autocorrelation function g2(τ) for particle size analysis. 曲线（即， Brownian motion analysis graph; g₂(τ>.018s) equation; dynamic light scattering results.是 > 1.005.
      2. 为去除信噪比较差的数据帧，若检测到的光子计数率低于设定阈值，则应舍弃该数据帧。 < 20 kHz
    2. 提取脑血流指数。使用 fminsearch 在 Matlab 中，拟合每个 ith 测量数据帧 Diffusion experiment; correlation function  \(g_{2,meas}(\tau)\); graph; dynamic light scattering. 用于 CBFi(i). 限制拟合范围至 Static equilibrium, ΣFx=0, diagram, illustrating forces balance on a beam.，并求出 CBF 的值i 最小化以下成本函数：
      Chi-squared equation for fitting analysis; formula χ²=Σ(g2,measi(τj)-g2,fit(τj))²; data fitting
      其中求和范围涵盖所有测得的延迟时间，τ<sub>j</sub> symbol in statistical analysis equation, depicts mean time, used in data fitting analysis.，以及 Photon correlation spectroscopy diagram, showing \(g_{2,fit}(\tau)\) for data analysis and spectral fitting. 是关联扩散方程的半无限均匀解（图4B):
      static light scattering equation for particle size analysis; g2 fit formula; analysis method
      此处 β 是由实验装置决定的相干因子， K(τ) equation for cerebral blood flow in optical imaging., Static equilibrium; equation \( r_1 = \sqrt{\rho^2 + z_0^2} \); mathematical formula., Static equilibrium formula, \(r_2 = \sqrt{\rho^2 + (z_0 + 2z_b)^2}\), equation analysis., Equation for static equilibrium; \(z_0=1/\mu'_s\); physics formula., Equation for depth measurement in optical studies: \( z_b = 2(1 + R_{eff})/3\mu_s(1 - R_{eff}) \)，Reff =0.493（假设组织折射率为1.4） ρ 为6毫米，且 μa 和 μ's 分别为组织的吸收系数和约化散射系数（假设分别为 0.25 和 9.4/cm）10,26,27).
      注意：由于 β 随时间变化幅度可达约 10%，需对每个数据帧分别拟合 β 和 CBFi 同时。
    3. 进行二次质量控制。在每次重复（包含5个数据帧）中剔除离群值。离群值定义为那些CBFi 平均 CBF 的 1.5 个标准差范围之外的值i 对于该次重复实验，若发现超过一个数据点为异常值，则应舍弃整次重复实验的数据。
    4. 估算平均脑血流指数：估算平均 CBFi 通过取所有重复实验中所有数据帧的平均值来计算每半球的数据图4C）。若未观察到显著的半球差异，则对半球进行平均，以获得平均全脑脑血流量（CBF）的估计值i.

3. 使用Luminex检测法对细胞因子和磷酸化蛋白进行多重定量

  1. 组织提取
    注意：使用 Luminex 定量脑组织中的细胞因子和磷酸化信号蛋白需要进行组织提取。
    1. 使用 4.5% 异氟烷与 100% 氧气混合气体对小鼠麻醉 1–2 分钟。通过夹趾无反应判断是否达到深麻醉状态。采用断头法处死动物。
    2. 采集组织。
      1. 取出脑组织。通常将左半脑固定用于组织学分析，从右半脑中显微解剖分离皮层和海马区的多个区域（图 5）。
      2. 将解剖后的样品置于微量离心管中，用液氮速冻。若需分析对冻融敏感的蛋白，建议在速冻前将组织切片进一步细分，以避免后续反复冻融。
        注意：本实验方案可在此暂停，组织样品可在 -80 °C 条件下长期保存，直至准备裂解。或者，也可先完成裂解，再于 -80 °C 保存。
    3. 裂解样品。
      1. 向裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂和 2 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF），配制完成裂解缓冲液。
      2. 每约 3 µg 动物组织加入 150 µL 混合裂解缓冲液。作为参考，小鼠视觉皮层组织样本重量约为 3 µg。
      3. 为实现组织匀浆，使用 1000 µL 移液器反复吹打组织约 15–20 次。为获得最佳匀浆效果，可使用匀浆器研磨杵。
      4. 将样品管置于 4 °C 条件下，在旋转仪上孵育 30 分钟。
      5. 在 4 °C 条件下以约 15,000 x g 离心 10 分钟，收集上清液。样品可立即进行后续处理，或保存于 -80 °C 以备进一步分析。
        注意：本方案制备的样品裂解液适用于 Western blot 分析，可用于检测吞噬细胞/小胶质细胞标志物 Iba1 和/或星形胶质细胞活化标志物 GFAP，从而补充细胞因子和磷酸化蛋白分析，用于神经炎症研究11。
  2. 细胞因子与磷酸化蛋白的多重免疫检测方案
    注意：尽管整体流程相似，细胞因子与磷酸化蛋白试剂盒的具体操作步骤存在一些细微差异。各步骤中的不同之处将分别注明。以下为 Luminex 检测前样品准备的详细步骤。
    1. 试剂准备（第 1 天，细胞因子与磷酸化蛋白通用）
      1. 将试剂恢复至室温（约 30 分钟）。
      2. 将多重磁珠瓶超声处理 30 秒，随后涡旋震荡 1 分钟。确保多重磁珠避光，可用铝箔包裹或使用试剂盒提供的避光瓶。
      3. 通过在 1x PBS 中加入 0.1% Tween20 配制洗涤缓冲液，或直接使用试剂盒提供的洗涤缓冲液。
    2. 裂解组织样品的准备（第 1 天，细胞因子与磷酸化蛋白通用）
      1. 若样品先前已冷冻，从冰箱中取出裂解组织样品，置于冰上解冻（约 20 分钟）。以 9,167 x g 离心 10 分钟，去除沉淀物。
      2. 根据线性范围分析结果（见第 3.3 节），将样品稀释至最佳蛋白浓度，取 25 µL。为统一所有样品的总体积，使用试剂盒提供的检测缓冲液对样品进行稀释。
    3. 96 孔板的准备（第 1 天，细胞因子与磷酸化蛋白通用）
      1. 使用试剂盒附带的 96 孔板，或底部较薄的 96 孔板（例如 Brand Tech 品牌）。
      2. 向每孔加入 200 µL 洗涤缓冲液（或 1x PBS + 0.1% Tween），在板式振荡器上以 750 rpm 振荡 10 分钟。
      3. 倾去洗涤缓冲液，并将板轻拍于纸巾上以去除残留液体。
    4. 细胞因子的免疫检测流程（第 1 天）
      1. 按以下顺序向各孔依次添加试剂。
        1. 向所有孔中加入 25 µL 检测缓冲液。
          1. 仅向背景孔中额外加入 25 µL 检测缓冲液。每次实验运行至少设置两个背景孔。背景孔不加样品，用于定义仪器在无样品条件下的荧光读数强度。
          2. 向对应的样品孔中加入 25 µL 稀释后的各样品。
          3. 向所有孔中加入 25 µL 1x 多重磁珠（图 6）。加样前务必涡旋震荡磁珠 1 分钟。
      2. 用封板膜密封板孔，并用铝箔包裹。于 2–8 °C 条件下孵育过夜（12–16 小时）。
    5. 细胞因子的免疫检测流程（第 2 天）
      1. 将 96 孔板置于磁力分离架上，确保孔位与磁铁对齐。静置 2 分钟。在板仍附着于磁力分离架时倾去孔内液体。
      2. 按以下步骤洗涤板两次。
        1. 向每孔加入 200 µL 洗涤缓冲液，并在室温下于振荡器上振荡 2 分钟。
        2. 将板置于磁力分离架上，室温静置 2 分钟。
        3. 在板仍附着于磁力分离架时倾去孔内液体。
      3. 向每孔加入 25 µL 检测抗体（图 6），用铝箔覆盖。在室温下于板式振荡器（750 rpm）上孵育 1 小时。
      4. 保留检测抗体不洗脱，向每孔加入 25 µL 链霉亲和素-藻红蛋白（SAPE）（图 6），用铝箔覆盖。在室温下于板式振荡器（750 rpm）上孵育 30 分钟。
      5. 将板置于磁力分离架上，静置 2 分钟。倾去孔内液体，取下板。
      6. 洗涤板两次（参见步骤 3.2.5.2）。
      7. 向每孔加入 75 µL Luminex 驱动液（若使用 MAGPIX 仪器）或检测缓冲液（若使用 200 或 FlexMap 3D 仪器）。在室温下于板式振荡器上重新悬浮磁珠 5 分钟。
      8. 使用 Luminex 仪器（MAGPIX、200 或 FlexMap 3D）读取数据，参照用户手册进行正确操作（图 6）。
    6. 磷酸化蛋白的免疫检测流程（第 1 天）
      1. 按以下顺序向各孔依次添加试剂。
        1. 向所有孔中加入 25 µL 检测缓冲液。
          1. 仅向背景孔中额外加入 25 µL 检测缓冲液。每次实验运行建议至少设置两个背景孔。背景孔不加样品，用于定义仪器在无样品条件下的荧光读数强度。
          2. 向每个样品孔中加入 25 µL 稀释后的样品。
          3. 向所有孔中加入 25 µL 1x 多重磁珠（图 6）。
            注意：Luminex 检测试剂盒提供的多重磁珠为 20x 储存液。使用前需将 20x 储存液涡旋震荡 2 分钟，再用检测缓冲液稀释至 1x 工作液。加样前将 1x 磁珠悬液涡旋震荡 1 分钟。
        2. 用封板膜密封板孔，并用铝箔包裹。于 2–8 °C 条件下孵育过夜（12–16 小时）。
    7. 磷酸化蛋白的免疫检测流程（第 2 天）
      1. 将 96 孔板置于磁力分离架上，确保板完全对齐。静置 2 分钟。在板仍附着于磁力分离架时倾去孔内液体。
      2. 洗涤板两次（参见细胞因子检测第 2 天流程中的步骤 b）。
      3. 将 20x 储存的检测抗体用检测缓冲液稀释至 1x 工作液。向每孔加入 25 µL 1x 检测抗体（图 6），用铝箔覆盖。在室温下于板式振荡器（750 rpm）上孵育 1 小时。
      4. 将 96 孔板置于磁力分离架上，静置 2 分钟。倾去孔内液体，取下板。
      5. 将 25x 储存的 SAPE 用检测缓冲液稀释至 1x 工作液。向每孔加入 25 µL 1x SAPE（图 6），用铝箔覆盖，在室温下于板式振荡器（750 rpm）上孵育 15 分钟。
      6. 保留 SAPE 在孔中不洗脱，向每孔加入 25 µL 放大缓冲液。用铝箔覆盖。
      7. 在室温下于板式振荡器（750 rpm）上孵育 15 分钟。
      8. 将板置于磁力分离架上静置 2 分钟。倾去孔内液体，取下板。
      9. 向每孔加入 75 µL Luminex 驱动液（若使用 MAGPIX 仪器）或检测缓冲液（若使用 200 或 FlexMap 3D 仪器）。在室温下于板式振荡器上重新悬浮磁珠 5 分钟。
      10. 使用 Luminex 仪器（MAGPIX、200 或 FlexMap 3D）读取数据，参照用户手册进行正确操作（图 6）。
  3. 样品稀释曲线的线性验证
    1. 样品准备：使用不同总蛋白浓度对测试样品进行系列稀释。对于整体脑组织，细胞因子检测建议上样量为 0–25 µg，磷酸化蛋白检测建议上样量为 0–12 µg。总蛋白浓度可通过双辛可宁酸（BCA）法测定。
    2. 多重免疫检测：对选定样品执行 Luminex 检测（参见第 3.2 节）。
    3. 数据分析
      1. 绘制每种蛋白的荧光强度与上样蛋白量的关系图（图 7）。
      2. 对每种待测物，确定总蛋白上样量与荧光强度读数呈线性关系的范围（图 7）。
      3. 为确定完整检测运行时应上样的总蛋白量，需识别每种待测物的线性区间，并选择一个适用于大多数待测物的蛋白浓度。
        注意：尽管多数蛋白具有相似的线性范围，但并非所有蛋白的线性区间均重叠。若出现此情况，可能需要对每个样品以不同总蛋白量重复检测多次。或者，可将非线性样品排除在分析之外。此外，部分蛋白可能完全不呈现线性范围。

4. 偏最小二乘回归

注意：提供示例 R 代码和示例数据电子表格以执行偏最小二乘分析。

  1. 数据准备：按照提供的示例数据表格“MyData”格式整理数据。在第1行中包含变量名称，样本名称放在A列，响应变量放在B列，所有预测变量放在C列及之后的列中。最后两行填写背景数据，并将这两个样本的名称均设为“Background”。
  2. 在 RStudio 中进行偏最小二乘回归
    1. 从 www.r-project.org 安装 R（免费，开源）。
    2. 从 www.rstudio.com 安装 RStudio Desktop（免费，开源许可证）。
    3. 下载本出版物提供的示例 R 代码“PLSR_Sample_Code.R”，并将其保存到包含数据表格的同一文件夹中。在 RStudio 中打开该代码文件。
    4. 在 用户输入 部分，将“dataFileName”更改为数据表格的文件名。
    5. 通过选中要运行的代码段，然后点击脚本右上角的 运行 按钮，依次执行以下步骤：
      1. 在 RStudio 中加载必要的 R 包、函数、工作目录地址以及用户输入值（“Preliminaries”子部分）。
      2. 将数据加载到 RStudio 中，并通过从所有测量值中减去平均背景信号并对每个分析物进行 z-score 标准化，准备原始数据以供处理（“Read Data and Subtract Background”子部分）（图 8A）。
      3. 使用 Comprehensive R Archive Network (CRAN) 上提供的 plsRglm 包 v1.2.528 在 RStudio 中执行偏最小二乘回归。在 LV1-LV2 平面上进行方差最大旋转（varimax rotation）（stats 包 v3.6.2）23，以识别一个能最好地区分响应变量的样本的新水平轴（“PLS”子部分）（图 8B）。
      4. 进行留一交叉验证（Leave One Out Cross Validation, LOOCV），即每次迭代中依次排除一个样本，并重新计算 PLSR 模型。计算所有 LOOCV 运行中分析物载荷的标准差（“LOOCV”子部分）。
  3. 生成代表性图表：按照上述说明运行提供的示例代码，生成代表性图表，图表将自动以 PDF 文件形式导出至工作目录（即包含数据和代码文件的文件夹）。
    1. 创建如 图 8A 所示的处理后数据热图（“PLS”子部分）。根据 z-score 定义的色谱对每个条目着色。按照目标潜在变量中计算出的顺序对分析物进行排序。
    2. 创建得分图，其中 LV1 得分沿水平轴绘制，LV2 得分沿垂直轴绘制，如 图 8B 所示（“PLS”子部分）。根据各样本的响应变量测量值对每个数据点着色，以可视化各潜在变量与响应变量之间的关系。
    3. 创建条形图，显示每个预测变量的载荷，以可视化各分析物对潜在变量的贡献程度，如 图 8C 所示（“LOOCV”子部分）。
    4. 创建将 LV1 得分对响应变量进行回归的图表，以可视化 PLSR 模型对样本的分离效果，如 图 8D 所示（“PLS”子部分）。

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结果

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先前收集的数据来自之前的研究，其中一组八只 C57BL/6 小鼠每日一次接受三次闭合性头部损伤（图2）11。在本研究中，最后一次损伤后 4 小时，采用扩散相关光谱法测量脑血流（图3、图4）。在损伤后脑血流评估完成后，动物被实施安乐死，并提取脑组织，通过免疫分析法对细胞因子和磷酸化蛋白进行定量（图5）。我们还通过 Western blot 对吞噬细胞/小胶质细胞活化标志物 Iba1 进行定量（方法见11）。每只小鼠的脑组织被裂解，并使用 BCA 法测定总蛋白浓度。采用 Milliplex MAP 小鼠细胞因子/趋化因子 32 重检测试剂盒进行多重细胞因子定量，并使用 Luminex MAGPIX 系统读取结果（图6）。在采集所有样本数据之前，进行了线...

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讨论

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本文详细介绍了评估重复性轻度创伤性脑损伤后血流动力学和神经炎症反应的方法。此外，我们还展示了如何将这些数据整合到基于偏最小二乘回归的多变量系统分析中。下文将讨论该方案中一些关键步骤和局限性，以及这些方法相较于现有方法的优势与不足。

轻度创伤性脑损伤的落锤模型。 这种创伤性脑损伤诱导方法的优势在于，其模拟了运动相关性头部损伤中常见的钝性冲击后迅速出现的前后向旋转加速度10,19。诚然，平滑脑的小鼠大脑并不能完全再现具有脑回结构的人类大脑的复杂性；然而，该模型确实可引发许多与人类轻度创伤性脑损伤（mTBI）相似的临床和行为后遗症，包括在重复损伤后出现持续的空间 学习与记忆功能缺陷。此外，尽管该模型的冲击性质较轻（无结构性或神经元损伤、无血脑屏障通透性改变、认知缺陷仅在多次冲击后出现等19），但其确实会引起明显的意识丧失，这与人类中意识丧失较为少见的情况形成对比。这种更显著的意识丧...

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本项目由美国国立卫生研究院R21 NS104801（EMB）和R01 NS115994（LBW/EB）以及亚特兰大儿童保健中心青年教员重点奖项（EMB）资助。本研究还获得了美国国防部通过国会指定医学研究项目（Award No. W81XWH-18-1-0669，LBW/EMB）的支持。文中观点、解释、结论和建议均为作者意见，并不一定代表美国国防部的观点。 本材料基于美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（Grant No. 1937971）资助的研究工作。本材料中表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者意见，并不一定反映美国国家科学基金会的立场。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
可调移液器任意可调移液器
铝箔VWR89107-726
Bio-Plex 细胞裂解试剂盒C Bio-Rad171304012
BRAND BRANDplates pureGrade 微孔板，非无菌BrandTech781602 96
Complete mini 蛋白酶抑制剂片剂Sigma-Aldrich11836153001
脱毛膏AmazonNair
去离子水（DiH2O）VWRVWRL0200-1000
用于96孔平底板的手持式磁力分离架Millipore Sigma 目录40-285
硬件自相关器板www.correlator.comFlex05-8ch
异氟烷 250 mLMED-VET INTERNATIONALRXISO-250
Kimwipe（11.2 × 21.3 cm）VWR21905-026
实验室涡旋混合器VWR10153-838
LabViewNational InstrumentsLabVIEW
Luminex 200、HTS、FLEXMAP 3D 或 MAGPIX 配 xPONENT 软件Luminex Corporation
Luminex 驱动液LuminexMPXDF-4PK
Luminex 包被液EMD MilliporeSHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP 小鼠细胞因子/趋化因子磁珠检测面板 —— 预混 32 重 —— 免疫学多重检测Millipore SigmaMCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK 信号通路 10 重检测试剂盒 —— 细胞信号通路多重检测Millipore Sigma48-660MAG
Mini LabRoller 旋转混合仪VWR10136-084
苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma-AldrichP7626-1G
磷酸盐缓冲液（PBS）VWR97064-158
板封膜机VWR82050-992
聚丙烯微量离心管VWR20901-547
Mini LabRollerMillipore SigmaZ674591
试剂储液槽VWR89094-668
R 编程语言
RStudiowww.rstudio.com
超声破碎仪
滴定板振荡器VWR12620-926
Tween20Sigma-AldrichP9416-50ML
1 米丙烯酸导管McMaster-Carr49035K85
4 光子计数雪崩光电二极管Perkin-ElmerSPCM-AQ4C-IO
400 微米多模光源光纤Thorlabs Inc.FT-400-EMT
54 克螺栓Ace Hardware0.95 厘米基本体直径，2 厘米头直径，10.2 厘米长度
780 纳米单模检测光纤Thorlabs Inc.780HP
852 纳米长相干长度激光器TOPTICA PhotonicsiBeam smart

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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