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方法文章

一种用于表征调控线虫时序性寿命遗传关联的抑制子筛选方法 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

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DOI：

10.3791/61506

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2020年9月17日

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1Department of Biology, William Paterson University

本文内容

摘要

以下是一种通过增加拷贝数抑制子筛选来鉴定基因相互作用的实验方案，适用于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。该方法使研究人员能够在短寿命酵母突变体中快速鉴定、克隆并验证抑制子。我们测试了自噬缺陷型突变体中SIR2基因拷贝数增加对寿命的影响。

摘要

衰老是指生物体正常生物学功能随时间依赖性退化的过程，会增加死亡的概率。许多遗传因素参与了正常衰老过程的改变。这些因素以复杂的方式相互作用，这一点已通过在多种生物中鉴定并保守的大量关联证据得到证实。大多数研究集中于功能缺失型或无效突变体，以便能够同时快速筛选大量基因。相比之下，关于基因过表达在此过程中所起作用的研究则少得多。本研究中，我们提出一种简便的方法，用于在芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae中鉴定并克隆基因，以研究其对多种遗传背景下存在的短寿命时序性寿命表型的抑制作用。本实验方案设计为适用于不同研究背景和不同学术阶段的研究人员。我们选择克隆编码组蛋白去乙酰化酶的SIR2基因至pRS315载体中，因为目前关于其对时序性寿命影响的研究结果尚存争议。SIR2还在自噬过程中发挥一定作用，而自噬会在多个基因（包括转录因子ATG1）被敲除时受到破坏。作为原理验证，我们克隆SIR2基因，对自噬缺陷型atg1Δ突变体所特有的寿命缩短表型进行抑制子筛选，并将其与遗传背景相同但为野生型的菌株进行比较。

引言

衰老是多种生物过程随时间推移而发生的完整性丧失，最终增加了生物体死亡的概率。对于所有物种而言，衰老几乎是不可避免的。在细胞层面，存在若干已被充分表征的与衰老相关的特征，包括：基因组不稳定性、表观遗传改变、蛋白质稳态失衡、线粒体功能障碍、营养感应失调、细胞衰老以及端粒缩短1,2。在酵母等单细胞生物中，这会导致复制潜能和时序性寿命的下降3,4。这些细胞变化在人类等更复杂的生物体中表现为多种病理状态，包括癌症、心力衰竭、神经退行性疾病、糖尿病和骨质疏松症5,6,7。尽管衰老过程具有诸多复杂性，但这些分子层面的标志性特征在进化上迥异的生物体中具有高度保守性8,9,10。发现衰老过程中这些通路的变化促使人们认识到，可通过生活方式干预对其进行调控——例如，限制饮食已被证明可显著延长多种生物的寿命11。这些通路之间以复杂的方式相互交汇与整合，并与其他许多通路相互作用。阐明并表征这些相互作用，为延长寿命和健康寿命的治疗干预提供了潜在可能12,13,14。

衰老分子机制的保守性使得利用较为简单的模式生物——包括芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae15,16——来功能解析调控该过程的遗传相互作用成为可能。芽殖酵母中已建立两种衰老模型：时序性衰老（时序寿命，CLS）和复制性衰老（复制寿命，RLS）17。时序性衰老衡量的是细胞在不分裂状态下能够存活的时间，类似于大多数时间处于G0期的细胞所经历的衰老过程，例如神经元4。而复制性寿命则指细胞在衰竭前能够分裂的次数，用于模拟有丝分裂活跃的细胞类型（例如，一个细胞能够产生的子代细胞数量）18。

本方法的总体目标是提供一种利用S. cerevisiae对衰老遗传学进行功能解析的实验方案。尽管已有众多研究人员开展了大量出色的研究，推动了我们对当前衰老机制的理解，但对于处于学术生涯早期的新生研究者而言，该领域仍存在大量可供探索的机会。本文介绍了一种清晰的方法学框架，可帮助研究人员进一步推动衰老领域的研究进展。该方案旨在为所有研究人员提供必要的工具，使其能够提出并验证自身新颖的科学假设，无论其学术生涯处于何种阶段。本方法的优势 在于，它是一种经济高效的技术，任何机构的研究人员均可便捷地开展，且无需某些实验方案所必需的昂贵或专用设备19。此类筛选实验有多种设计方式，本文所述方法特别适用于筛选那些与同源野生型酵母菌株相比，表现出显著缩短的时序性寿命的非必需基因缺失突变体。

作为概念验证，我们克隆了 SIR2 基因，该基因编码一种赖氨酸去乙酰化酶，已有报道表明其过表达既可延长也可缩短复制寿命。最近研究发现，SIR2 的过表达可延长酿酒酵母的复制寿命；然而，多个研究团队报告称 SIR2 与复制寿命延长之间并无关联，致使其功能尚未明确20,21,22。鉴于文献中存在这些相互矛盾的结果，我们选择该基因开展独立研究，以帮助阐明 SIR2 在复制衰老过程中是否发挥作用。此外，在线虫模型系统中增加 SIR2 同源基因的拷贝数可延长其寿命23。

自噬是一种细胞内降解系统，可将细胞质中的产物（如蛋白质和细胞器）运送至溶酶体24。自噬通过降解受损的蛋白质和细胞器以维持细胞稳态，在此过程中与长寿密切相关25。自噬的诱导依赖于多个基因表达的协调调控，而敲除ATG1基因会导致芽殖酵母的复制寿命（CLS）异常缩短26。ATG1编码一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，该蛋白在自噬过程中的囊泡形成以及细胞质到液泡（真菌的溶酶体类似物）通路中发挥必需作用27,28。本文中，我们介绍了一种拷贝数增加筛选方法，用于检测SIR2基因拷贝数增加对野生型及atg1基因缺失背景下复制寿命（CLS）的影响。该方法特别适用于初级研究人员以及以本科生为主的科研机构的研究团队，其中许多机构服务于在科学领域中代表性不足的群体，且科研资源有限。

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方案

1. 筛选潜在的遗传相互作用

  1. 利用《酿酒酵母基因组数据库》（Saccharomyces Genome Database，SGD，https://www.yeastgenome.org29,30）确定导致酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）出现异常缩短的时序性寿命（CLS）的遗传背景，该数据库汇总了该生物体已知的表型信息。
    1. 在网页顶部的选项中选择功能标签。
    2. 选择表型，然后选择浏览所有表型。
    3. 在酵母表型本体选项中，滚动至发育子标题，并在寿命子标题下选择时序性寿命。
    4. 选择减少作为限定词，以识别那些在缺失后表现出时序性寿命缩短表型的基因。在本方法验证中选择了atg1Δ，其会导致寿命缩短的CLS表型，并且自噬功能受损26。
  2. 基于第1.2步中鉴定出的突变体已报道或预测的本体属性，确定可用于筛选可能抑制该表型的遗传相互作用的靶基因。重复上述步骤1.1.1–1.1.4中的表型搜索，查询在野生型背景下过表达时可导致CLS延长的基因。根据已报道的CLS表型及其与自噬的相互作用，选择了SIR231,32。

2. 准备试剂

注意：除非另有说明，否则每种溶液均需在 121 ˚C 下高压灭菌 20 分钟，方可使用。

  1. YPAD 液体培养基：每升双蒸水中加入 1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 右旋糖（葡萄糖）和 40 mg 腺嘌呤（以硫酸腺嘌呤二水合物形式添加）。使用磁力搅拌器充分混匀。
  2. LB 液体培养基：每升双蒸水中加入胰蛋白胨（10 g）、酵母提取物（5 g）和氯化钠（10 g）。使用磁力搅拌器充分混匀。
  3. 制备 1000 倍浓缩（100 mg/mL）氨苄青霉素储备液：溶于双蒸水中，充分混匀后过滤除菌。
  4. 合成完全缺亮氨酸（SC-LEU）液体培养基：每升双蒸水中加入 1.7 g 无氨基酸酵母氮源基础培养基、2% 葡萄糖、1.92 g SC-LEU 缺陷型混合物和 5 g 硫酸铵。使用磁力搅拌器充分混匀。
  5. TE 缓冲液：将 Tris（终浓度 10 mM）和 EDTA（终浓度 1 mM）溶于双蒸水中，使用磁力搅拌器充分混匀。
  6. 制备 50% PEG 3350 溶液：溶于双蒸水中，使用磁力搅拌器充分混匀。
  7. 用双蒸水配制 1 M 和 100 mM 醋酸锂溶液，使用磁力搅拌器充分混匀。
    注意：若需制备固体琼脂平板，在 2.1 和 2.2 中所述培养基灭菌前，每升培养基中加入 20 g 琼脂。若制备含氨苄青霉素的平板，则在 2.2 所述培养基冷却至约 60 ˚C 后加入 1 mL 氨苄青霉素溶液。倒入无菌培养皿中，静置 48–72 小时使其完全凝固后再使用。长期保存时置于 4 ˚C 保存。

3. 设计克隆策略，将 SIR2 克隆至 pRS315 载体中

  1. 设计PCR引物以扩增用于克隆至pRS315载体的SIR2基因。
    1. 手动设计引物，使其具有21–22个核苷酸与SIR2基因上下游的基因间区域互补。通过参考现有数据集33,34中的特征图谱，确保克隆包含整个基因以及mRNA的非翻译区。
    2. 确保PCR引物设计产生的正向和反向引物的熔解温度（Tm）高于53 °C且低于60 °C。
      注意：理想情况下，两个引物的Tm应尽可能接近，序列允许的前提下，GC含量约为40–50%，并避免二核苷酸重复，同时在整个序列中平衡GC与AT分布。
    3. 在完成可用于生成克隆扩增子的PCR引物设计后，在每个引物的5’端添加与质粒克隆载体兼容的限制性内切酶消化（R.E.D.）靶位点。本方法中，在上游正向引物添加HindIII限制性内切酶识别位点（5’-AAGCTT-3’），在下游反向引物添加SacII限制性内切酶识别位点（5’-CCGCGG-3’）。
      注意：使用SacII和HindIII位点要求这两个内切酶的共识切割位点在目标基因中不存在。如果任一酶在目标基因内部有识别位点，则应选择其他限制性内切酶。pRS315载体的多克隆位点区域兼容多种酶。
    4. 最后，在每个引物的5’端添加一个四核苷酸（5’-NNNN-3’）序列悬垂，以允许限制性内切酶结合并切割扩增子。引物设计完成后，将寡核苷酸进行商业合成，用于SIR2基因的克隆。
    5. PCR引物的重悬：使用台式微量离心机以最大速度离心PCR引物4分钟。加入TE溶液，配制成100 µM的储存液。将储存液保存于-20 °C，并在PCR应用中稀释10倍使用。
      注意：配制100 μM储存液时，将引物溶解于体积为引物管中nmol数10倍的无菌TE缓冲液中，单位为微升。例如，若引物管中含有15.6 nmol引物，则加入156 μL TE缓冲液。
  2. 从野生型酵母中分离基因组DNA（gDNA），用于PCR扩增SIR2克隆构建体。
    注意：目前市面上有多种高质量的酵母gDNA提取产品。使用包含zymolyase消化真菌细胞壁的试剂盒可获得更高质量的gDNA（产量更高，杂质更少）。以下方案始终能获得高浓度和高纯度的DNA。推荐试剂盒的详细信息见材料表。
    1. 在富集培养基（如YPAD）中培养5 mL野生型酵母菌液48–72小时至对数后期。在室温下以>800 x g离心3分钟收集酵母细胞，弃去培养基，用120 μL含5 μL zymolyase（2单位酶/μL）的zymolyase消化缓冲液重悬细胞。涡旋混匀后，37 °C孵育40分钟。
    2. 加入120 μL变性裂解缓冲液（如盐酸胍）、250 μL氯仿，涡旋混匀60秒。
    3. 以>8,000 x g离心2分钟，将上清液转移至纯化柱中，置于无菌收集管内。
    4. 以>8,000 x g离心60秒，弃去穿流液。基因组DNA将结合在柱基质上。
    5. 用300 μL基于乙醇的洗涤缓冲液洗涤柱子两次，每次重复上述离心步骤（3.2.4）。每次离心后弃去穿流液。将柱子转移至1.5 mL微量离心管中，加入60 μL TE缓冲液，室温孵育60秒。快速离心30秒以洗脱DNA。
      注意：测定样品中DNA的浓度（260 nm处吸光度）和质量（260 nm/280 nm吸光度比值）。典型产量为100–200 ng/μL gDNA，260 nm/280 nm吸光度比值应尽可能接近1.8。
  3. 扩增并分离用于克隆的pRS315质粒载体。
    注意：目前市面上有多种高质量的质粒载体纯化产品。建议本步骤采用基于硅胶柱的化学方法。以下所述改进可获得最高浓度和纯度。详细信息见材料表。
    1. 在LB+氨苄青霉素（80 μg/mL）培养基中过夜培养5 mL含有pRS315载体的E. coli菌液。在室温（15–25 °C）下以>8,000 x g离心2分钟收集菌体。
    2. 用250 μL含RNase A（100 μg/mL）的TE缓冲液重悬菌体沉淀，并转移至微量离心管中。确保无细胞团块残留。
    3. 加入250 μL裂解缓冲液，通过倒置管6–8次混匀。室温孵育5分钟。裂解时间不得超过5分钟，略短更佳。
    4. 立即加入350 μL中和缓冲液，倒置管10次充分混匀。以>8,000 x g离心10分钟。
    5. 小心用移液器将上清液转移至硅胶自旋柱中。离心30秒，弃去穿流液。
    6. 加入500 μL高盐洗涤缓冲液，按步骤3.3.5离心。弃去穿流液。加入750 μL基于乙醇的洗涤缓冲液洗涤DNA结合柱，以去除残留盐分，按步骤3.3.5离心。
    7. 弃去穿流液，再以>8,000 x g额外离心2分钟以去除残留洗涤缓冲液。将自旋柱放入洁净、标记的1.5 mL微量离心管中。为洗脱DNA，向自旋柱中心加入20 μL TE缓冲液，室温孵育1分钟，再以>8,000 x g离心1分钟。
    8. 使用分光光度计测定DNA的量（260 nm处吸光度）和质量（260 nm/280 nm吸光度比值）。典型产量为1–2 μg/μL。
  4. 从野生型基因组DNA中PCR扩增候选基因SIR2
    1. 为获得适合克隆的扩增子，应使用高保真（HF）PCR聚合酶，以避免在扩增序列中意外引入突变。
      注意：市面上有多种不同的高保真PCR产品。为便于优化PCR反应条件，建议使用两种缓冲液组合：一种为标准HF缓冲液，另一种专为高GC含量和复杂扩增子优化。详细信息见材料表。
    2. 按照表1所述条件对SIR2构建体进行PCR扩增。
      注意：为提高克隆步骤的成功率，可设置多个相同的50 μL反应，并通过PCR柱纯化步骤浓缩。务必设置一个无gDNA模板的对照反应（阴性对照）。
    3. 按照表2所述设置PCR循环条件。
      注意：不同引物对的退火温度不同，不同聚合酶的工作速度也不同。应根据所选酶和设计的引物组合的具体参数优化扩增条件。
    4. 通过1.0% TAE-琼脂糖凝胶电泳（含0.5 μg/mL溴化乙锭用于可视化）观察PCR产物，验证PCR反应是否成功，预期产生约2.5 kb的DNA片段。
  5. 将候选基因SIR2进行限制性酶切和连接，插入pRS315质粒载体。
    1. 对载体和插入片段进行限制性酶切：625 ng DNA（载体或插入片段），加水至终体积50 μL，加入5 μL缓冲液、1 μL SacII和1 μL HindIII。37 °C孵育3小时，随后80 °C加热20分钟以灭活酶。酶切产物可在下一步操作前4 °C保存。
    2. 设置15 μL连接反应以构建目标质粒：6 μL无菌水、2 μL酶切载体（50 ng DNA）、4 μL酶切插入片段（100 ng DNA）、2 μL T4反应缓冲液和1 μL T4 DNA连接酶。16 °C过夜孵育，随后80 °C加热20分钟以灭活酶。
      注意：设置无插入片段对照，用额外4 μL无菌水（共10 μL）替代插入片段。
    3. 将连接反应转化至E. coli。
      注意：市面上有多种感受态细胞可供选择。本方案使用化学感受态细胞，使用前保存于-80 °C。
      1. 将50 μL冷冻的感受态E. coli细胞置于冰上融化至刚好解冻，立即加入15 μL连接反应液，轻弹管壁数次。立即将管子放回冰上，孵育30分钟。
      2. 在精确42 °C水浴中热激20秒，立即放回冰上孵育2分钟。向每管转化反应中加入450 μL室温复苏培养基（如SOC或LB），37 °C摇床孵育60分钟。
      3. 对每管转化反应进行1:10稀释。采用无菌操作，将150 µL未稀释菌液和1:10稀释菌液分别涂布于LB +（80 μg/mL）氨苄青霉素平板35。37 °C过夜培养。
  6. 筛选潜在转化子中的过表达载体。
    1. 采用无菌操作，将生长的潜在转化子接种至5 mL LB +（80 μg/mL）氨苄青霉素培养基中，过夜培养。按照上述第3.3.1–3.3.7节所述步骤，从每个潜在转化子中提取质粒，并通过限制性酶切后进行1.0% TAE-琼脂糖凝胶电泳（含0.5 μg/mL溴化乙锭用于可视化）筛选插入片段是否成功整合。

4. 将载体转化至 atg1Δ 和野生型酵母菌株中

注意：本步骤采用改良的乙酸锂转化法进行36。

  1. 离心收集15 mL野生型和 atg1-null 酵母细胞在 YPAD 培养基中过夜培养至对数生长早期至中期（O.D. 600nm = 0.4–0.9），继续生长 3 分钟 > 800 x g 在室温下
  2. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL无菌ddH₂O中2O，并将内容物转移至1.7 mL离心管中。以离心力沉淀细胞3分钟 > 800 x g 在室温下
  3. 移去上清液，用移液器轻轻将细胞重悬于250 μL 100 mM醋酸锂溶液中。根据将要进行的转化实验数量，将细胞分装至不同的微量离心管中。每次转化使用50 μL细胞与醋酸锂混合液。
  4. 设置转化反应体系。向每次转化反应中加入：240 μL 50% PEG3350、36 μL 1.0 M 醋酸锂，以及 5 μL 鲑鱼精子（或其他载体）DNA（煮沸 5 分钟后置于冰上）。
    注意：PEG 黏度很高。请小心移液和测量。每次加入组分后，均需通过移液充分混匀，再进行下一步操作。
  5. 每次转化加入5 μL相应的质粒。涡旋振荡各管以充分混匀。将样品在30 °C孵育45 min。在42 °C热激10 min。
  6. 离心细胞3分钟 > 800 x g 在室温下，小心移除转化混合物，并将样品重悬于 300 μL 无菌 ddH₂O 中2O. 通过重复上述离心步骤沉淀细胞，小心去除上清液，并将样品重悬于200 μL无菌ddH₂O中。2O.
  7. 为每种转化后的酵母菌株设置1/10和1/100稀释度。
  8. 采用无菌操作技术，将每个样品中的150 μL接种至SC-亮氨酸平板上，以筛选质粒。均匀铺布细胞，待平板干燥后倒置，于30 °C培养48–72 h。
    注意：一旦获得合适的菌株，可将其于-80 °C条件下在25%甘油中长期保存。拷贝数的定量可通过多种方法测定，包括qPCR、RNA-FISH或其它适当的方法。37,38.

5. 测定复制性寿命以检测缩短的CLS表型是否被抑制

  1. 通过测定菌落形成单位（CFUs）随时间变化的数量，检验假定的抑制因子在短寿命酵母atg1Δ突变体中过表达对复制寿命（CLS）的影响39。
    注意：本实验部分必须设置适当的对照组。典型的实验将比较以下四组：携带空载体的野生型（WT）酵母菌株、携带抑制因子载体的野生型菌株、携带空载体的基因缺失突变体以及携带抑制因子载体的基因缺失突变体。
    1. 挑取待研究菌株的单个菌落，接种至SC-LEU培养基中，在30 °C条件下振荡培养72 h。
    2. 使用血细胞计数板测定培养物中细胞的浓度40。
    3. 取部分培养物进行稀释，使150 µL无菌水中含有数量一致的细胞。采用无菌操作技术将稀释后的细胞接种至SC-LEU平板，于30 °C培养72 h。这些平板代表第3天的时间点，实验结果将以该时间点的存活率为100%进行归一化处理39。
      注意：接种的细胞数量应为200–500个，数量足够大以保证分析的准确性，同时又便于计数。本研究中采用的接种量为200个细胞。
    4. 继续将酵母培养物在30 °C下培养，定期取样并按照步骤5.1.3所述方法进行涂布。持续该过程直至菌株完全失去活力，随后汇总并分析结果。
      注意：本研究中所用全部菌株的详细列表见Table 3。

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结果

由于关于该作用存在相互矛盾的报道 SIR2 在衰老过程中，我们选择该基因作为研究对象，因其可能是衰老的潜在抑制因子 atg1Δ 突变体的缩短的CLS表型26. 的作用 SIR2 存在争议，关于其在延长细胞寿命（CLS）方面的作用有相互矛盾的报道，但在至少一种酵母遗传背景下已明确与其延长CLS相关，并在自噬和线粒体自噬中发挥作用22,31,32,41.

我们选用的质粒载体是pRS315穿梭载体，该载体构建的目的是便于在芽殖酵母和细菌中进行遗传操作、扩增和维持42。该载体含有LEU2营养标记基因、T7和T3启动子，并且是一种着丝粒（CEN）载体，可在...

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讨论

解析衰老的遗传机制是一项艰巨的挑战，其中蕴含着大量有待深入研究的机遇，有望揭示复杂相互作用背后的本质。目前已有多种方法可快速生成功能缺失型突变体，用于酵母无效菌株的研究45,46。本文所述方法提供了一种简便的策略，用于鉴定基因并将其克隆至pRS315载体，以开展过表达抑制子研究。该策略的一个优势在于，可通过稳定载体实现中等水平的基因过表达，从而避免染色体整合可能带来的不可预见的技术难题47。本方法的呈现方式旨在吸引处于不同科研阶段的研究人员参与，本论文的多位作者在学习过程中即通过鉴定和克隆潜在抑制子的方式参与了此项工作。

在本研究中，我们展示了如何利用Saccharomyces基因组数据库中整合的大量数据，识别特定表型——在此案例中为与改变的时序性寿命相关的遗传联系。我们将SIR2基因克隆至pRS315载体中，以检测中度过表达对短寿且自噬缺陷突变体atg1Δ时序性寿...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

James T. Arnone 要感谢威廉帕特森大学 2017 年和 2018 年重组 DNA 技术课程中的学生们，他们从本项目启动之初就积极参与，虽然其贡献尚未达到作者署名标准：Christopher Andino、Juan Botero、Josephine Bozan、Brenda Calalpa、Brenda Cubas、Headtlove Essel Dadzie、Irvin Gamarra、Preciousgift Isibor、Wayne Ko、Nelson Mejia、Hector Mottola、Rabya Naz、Abdullah Odeh、Pearl Paguntalan、Daniel Raza’e、Gabriella Rector、Aida Shono 和 Matthew So。你们都是出色的科学家，我非常想念你们大家！

作者谨此感谢威廉帕特森大学教学与研究技术部门提供的宝贵支持：Greg Mattison、Peter Cannarozzi、Rob Meyer、Dante Portella 和 Henry Heinitsh。作者还感谢教务长办公室在艺术项目（ART）方面的支持，科学与健康学院院长办公室及研究中心对本研究工作的支持，以及生物学系对本项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
真菌/细菌DNA试剂盒Zymo ResearchD6005
HindIIIHF酶New England BiolabsR3104S
Phusion高保真DNA聚合酶New England BiolabsM0530S
质粒小提试剂盒Qiagen12123
SacII酶New England BiolabsR0157S
鲑鱼精子DNAThermofisherAM9680
T4 DNA连接酶New England BiolabsM0202S

参考文献

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