以下是一种通过增加拷贝数抑制子筛选来鉴定基因相互作用的实验方案，适用于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。该方法使研究人员能够在短寿命酵母突变体中快速鉴定、克隆并验证抑制子。我们测试了自噬缺陷型突变体中SIR2基因拷贝数增加对寿命的影响。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
衰老是指生物体正常生物学功能随时间依赖性退化的过程，会增加死亡的概率。许多遗传因素参与了正常衰老过程的改变。这些因素以复杂的方式相互作用，这一点已通过在多种生物中鉴定并保守的大量关联证据得到证实。大多数研究集中于功能缺失型或无效突变体，以便能够同时快速筛选大量基因。相比之下，关于基因过表达在此过程中所起作用的研究则少得多。本研究中，我们提出一种简便的方法，用于在芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae中鉴定并克隆基因，以研究其对多种遗传背景下存在的短寿命时序性寿命表型的抑制作用。本实验方案设计为适用于不同研究背景和不同学术阶段的研究人员。我们选择克隆编码组蛋白去乙酰化酶的SIR2基因至pRS315载体中，因为目前关于其对时序性寿命影响的研究结果尚存争议。SIR2还在自噬过程中发挥一定作用，而自噬会在多个基因（包括转录因子ATG1）被敲除时受到破坏。作为原理验证，我们克隆SIR2基因，对自噬缺陷型atg1Δ突变体所特有的寿命缩短表型进行抑制子筛选，并将其与遗传背景相同但为野生型的菌株进行比较。
引言
衰老是多种生物过程随时间推移而发生的完整性丧失，最终增加了生物体死亡的概率。对于所有物种而言，衰老几乎是不可避免的。在细胞层面，存在若干已被充分表征的与衰老相关的特征，包括：基因组不稳定性、表观遗传改变、蛋白质稳态失衡、线粒体功能障碍、营养感应失调、细胞衰老以及端粒缩短1,2。在酵母等单细胞生物中，这会导致复制潜能和时序性寿命的下降3,4。这些细胞变化在人类等更复杂的生物体中表现为多种病理状态，包括癌症、心力衰竭、神经退行性疾病、糖尿病和骨质疏松症5,6,7。尽管衰老过程具有诸多复杂性，但这些分子层面的标志性特征在进化上迥异的生物体中具有高度保守性8,9,10。发现衰老过程中这些通路的变化促使人们认识到，可通过生活方式干预对其进行调控——例如，限制饮食已被证明可显著延长多种生物的寿命11
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 筛选潜在的遗传相互作用
- 利用《酿酒酵母基因组数据库》（Saccharomyces Genome Database，SGD，https://www.yeastgenome.org29,30）确定导致酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）出现异常缩短的时序性寿命（CLS）的遗传背景，该数据库汇总了该生物体已知的表型信息。
- 在网页顶部的选项中选择功能标签。
- 选择表型，然后选择浏览所有表型。
- 在酵母表型本体选项中，滚动至发育子标题，并在寿命子标题下选择时序性寿命。
- 选择减少作为限定词，以识别那些在缺失后表现出时序性寿命缩短表型的基因。在本方法验证中选择了atg1Δ，其会导致寿命缩短的CLS表型，并且自噬功能受损26。
- 基于第1.2步中鉴定出的突变体已报道或预测的本体属性....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
由于关于该作用存在相互矛盾的报道 SIR2 在衰老过程中，我们选择该基因作为研究对象，因其可能是衰老的潜在抑制因子 atg1Δ 突变体的缩短的CLS表型26. 的作用 SIR2 存在争议，关于其在延长细胞寿命（CLS）方面的作用有相互矛盾的报道，但在至少一种酵母遗传背景下已明确与其延长CLS相关，并在自噬和线粒体自噬中发挥作用22,31,32,41.
我们选用的质粒载体是pRS315穿梭载体，该载体构建的目的是便于在芽殖酵母和细菌中进行遗传操作、扩增和维持42。该载体含有LEU2营养标记基因、T7和T3启动子，并且是一种着丝粒（CEN）载体，可在.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
解析衰老的遗传机制是一项艰巨的挑战，其中蕴含着大量有待深入研究的机遇，有望揭示复杂相互作用背后的本质。目前已有多种方法可快速生成功能缺失型突变体，用于酵母无效菌株的研究45,46。本文所述方法提供了一种简便的策略，用于鉴定基因并将其克隆至pRS315载体，以开展过表达抑制子研究。该策略的一个优势在于，可通过稳定载体实现中等水平的基因过表达，从而避免染色体整合可能带来的不可预见的技术难题47。本方法的呈现方式旨在吸引处于不同科研阶段的研究人员参与，本论文的多位作者在学习过程中即通过鉴定和克隆潜在抑制子的方式参与了此项工作。
在本研究中，我们展示了如何利用Saccharomyces基因组数据库中整合的大量数据，识别特定表型——在此案例中为与改变的时序性寿命相关的遗传联系。我们将SIR2基因克隆至pRS315载体中，以检测中度过表达对短寿且自噬缺陷突变体atg1Δ时序性寿.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
James T. Arnone 要感谢威廉帕特森大学 2017 年和 2018 年重组 DNA 技术课程中的学生们，他们从本项目启动之初就积极参与，虽然其贡献尚未达到作者署名标准：Christopher Andino、Juan Botero、Josephine Bozan、Brenda Calalpa、Brenda Cubas、Headtlove Essel Dadzie、Irvin Gamarra、Preciousgift Isibor、Wayne Ko、Nelson Mejia、Hector Mottola、Rabya Naz、Abdullah Odeh、Pearl Paguntalan、Daniel Raza’e、Gabriella Rector、Aida Shono 和 Matthew So。你们都是出色的科学家，我非常想念你们大家！
作者谨此感谢威廉帕特森大学教学与研究技术部门提供的宝贵支持：Greg Mattison、Peter Cannarozzi、Rob Meyer、Dante Portella 和 Henry Heinitsh。作者还感谢教务长办公室在艺术项目（ART）方面的支持，科学与健康学院院长办公室及研究中心对本研究工作的支持，以及生物学系对本项目的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 真菌/细菌DNA试剂盒 | Zymo Research | D6005 | |
| HindIIIHF酶 | New England Biolabs | R3104S | |
| Phusion高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | M0530S | |
| 质粒小提试剂盒 | Qiagen | 12123 | |
| SacII酶 | New England Biolabs | R0157S | |
| 鲑鱼精子DNA | Thermofisher | AM9680 | |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | M0202S |
参考文献
- López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
- Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
