使用高速摄像机和图像分析对快速移动微泡区域进行成像和定量

Summary

气穴微泡使用连接到变焦镜头的高速摄像机进行成像。阐述了实验设置，并采用图像分析计算气穴面积。使用 ImageJ 完成图像分析。

Abstract

提出了一种用于成像气穴气泡并计算气穴面积的实验和图像分析技术。这里提出的高速成像实验技术和图像分析方案，也可以应用于其他研究领域的成像显微气泡;因此，它具有广泛的应用。我们将其应用于牙科超声波刻度器周围的图像气穴。图像气穴来描述它，并了解如何将其用于各种应用，这一点非常重要。围绕牙科超声波刻度器发生的气穴可以用作一种新的牙菌斑去除方法，比目前的牙周治疗技术更有效，造成的损害更少。我们提出了一种使用高速摄像机和变焦镜头成像牙科超声波刻度器尖端周围发生的气穴气泡云的方法。我们还使用机器学习图像分析计算气穴面积。开源软件用于图像分析。提供的图像分析易于复制，不需要编程经验，并且可以很容易地修改以适应用户的应用。

Introduction

成像气泡的运动对于各种应用都很重要，因为它控制着系统的流体动力学。有许多应用，这非常有用:在流化床反应器^1，2，,2或用于清洁气穴气泡^3,3，4。成像气泡的目的是更好地了解气泡动力学或气泡云的方向和运动。这可以通过观察图像结构以及使用图像分析来获取定量信息（如气泡的大小）来实现。

气穴气泡是当压力低于饱和压力值5时在流体中发生的气体或^蒸汽实体。当声场以超声波频率应用于流体时，它们可能发生。它们反复生长和坍塌，在坍塌时可以释放能量，以高速微喷气机和冲击波^{6，7,的形式}。这些可以通过剪切力将表面上的颗粒清除，并导致表面^清洁8。气穴气泡正在调查不同行业的表面清洁，如半导体，食品和伤口清洁^{,9，10，11，12。1011,129}它们还可用于清洁牙齿和生物材料中的牙菌斑，如牙科植入物^{12、13。,13}气穴发生在目前使用的牙科仪器，如超声波刻度仪和内音文件，并显示出潜在的附加清洁过程与这些仪器^14。

气穴气泡的振荡发生在几微秒内，因此需要高速摄像机以每秒数千帧的成像来捕捉^其运动。我们演示了一种围绕牙科超声波刻度器进行微泡气穴成像的方法。目的是了解气穴如何围绕不同的超声波刻度器变化，因此它可以被优化为清洁牙菌斑的新方法。

以前用于研究气穴的方法包括气精，它使用发光来检测气穴发生的地方^{15，16。15,}然而，这是一种间接技术，它无法实时可视化气穴气泡。因此，它无法准确确定它在仪器上发生的确切地点，并且除非与其他成像技术相结合，否则无法获得有关气泡动力学^的信息。高速成像不仅可以成像气穴气泡的产生和坍塌，还可以成像气穴发生的类型:气穴云、微流和微喷头^{6,6、7、18。,18}这些提供了有关气穴如何清洁表面的更多信息。

我们提出了一种使用高速摄像机成像气穴微泡并计算气穴发生平均面积的方法。此方法使用围绕不同牙科超声波刻度器尖端发生的气穴示例进行演示，尽管实验和图像分析步骤可用于其他应用，例如成像其他宏和微泡。

Protocol

1. 仪器设置

1. 选择要成像的仪器或对象。在这个实验中，对超声波刻度仪进行了成像。气穴气泡发生在水中超声波刻度器的尖端周围。
2. 选择一个微型定位阶段，通过 XYZ 平移和旋转对仪器进行成像。放在实验室插孔上。将仪器手柄连接到微定位级
3. 选择光学透明的水容器进行成像。这些实验中使用的容器是用玻璃显微镜幻灯片创建的。
4. 选择具有旋转平台的 XY 阶段。放在实验室插孔上。将水容器放在舞台上，并加注过滤水（反渗透或蒸馏）。

2. 高速摄像机设置

1. 选择具有所需帧速率和分辨率的高速摄像机以及带光纤导光的高强度光源。
2. 将微定位滑动板连接到高速摄像机机身，并将其连接到三脚架支架上。
3. 选择具有所需分辨率和焦距的镜头并将其连接到相机。对于此实验，以 8.4 μm/像素的分辨率使用变焦镜头。
4. 向成像罐加注水，并定位仪器的尖端以所需方向在水箱中成像。
5. 在连接相机并在软件中加载实时视图后，使用低放大倍率对焦到超声波刻度器的尖端，必要时重新定位光源。将仪器和光源放在摄像机前面并对焦。调整到所需的帧速率和亮度。
   注:在高帧速率、短快门速度和/或高放大倍数下进行成像需要更高的光照强度。可以在反射模式或传输模式下提供照明。在此协议中，使用高强度冷照明装置在传输模式（亮场）中提供照明。
6. 为高速摄像机设置最佳帧速率和快门速度。在这个实验中，帧速率为6400 fps，快门速度为262纳秒。快速移动气泡（如气穴气泡）需要短快门速度，以确保它们聚焦。
7. 调整变焦镜头的放大倍率和光源的强度，使背景为白色，而不会过度曝光。

3. 校准

1. 记录尖端的位置（在 x-y 级旋转，仪器的旋转角度，以进行可重复性）。
2. 为确保每次重复的视场一致，请选择参考点并记下坐标。在这种情况下，参考点是超声波刻度器的尖端。然后，它可以在视图领域内同一位置的未来实验中重新定位。
3. 如果像素大小未知，则在设定的放大倍率下使用具有 10 μm 标记的颗粒图像，并使用图像分析软件（如斐济）计算分辨率。

4. 高速视频录制

1. 在不气穴的情况下对仪器进行成像。在计算气穴气泡区域时，将从图像分析中的气穴图像中减去。以 TIFF 等格式保存视频，这样不会丢失图像质量。
2. 成像使用气穴操作的仪器。确保有足够的帧进行精确分析，例如，每次 5 次重复，每次 500 帧。

5. 图像处理

1. 从 ImageJ 网站（https://imagej.net/Fiji）下载斐济^19。 提供了 ImageJ 宏代码，该代码会自动执行下面描述的图像分析步骤，还可以更改以适应应用程序。宏的单个步骤在步骤 5.3-5.5 中描述。
2. 裁剪图像以移除因照明不均匀而导致的任何较暗区域（如果需要）。确保所有图像都裁剪到图像中的相同大小和相同点。
3. 通过使用自动阈值之一自动设置阈值，将图像转换为二进制图像。在此示例中，使用最小自动阈值。
4. 运行填充孔命令，从气泡中删除任何被错误地分段的黑色像素。
5. 计算堆栈的直方图，以显示与缩放器对应的像素数和每个帧中的气穴。
6. 在这种情况下，与气泡对应的像素为白色，并且值为 255。保存这些测量值。
7. 对于仪器在没有气泡的情况下运行的视频，重复步骤 5.3-5.6。
8. 仅根据直方图的结果计算超声波刻度器尖端的均值。
9. 从缩放器周围的气泡视频计算的每个区域中减去仪器的均值区域。气泡区域留有测量。
10. 使用斐济的图像计算器从缩放器的二进制图像中减去具有气泡的缩放器的二进制图像来可视化。
11. 计算气泡区域的平均值和标准偏差。
12. 将值从像素数转换为面积（本例中为 μm^2），乘以像素大小平方。通过以与成像相同的放大倍率对高速摄像机进行成像，并使用 ImageJ 设置比例来计算每个像素的大小。
13. 绘制数据。如果比较不同的条件，也可以进行统计分析，以显示气泡面积的任何显著差异。

6. ImageJ 宏

1. 在 ImageJ/Fiji 菜单中，转到 插件 > 新 > 宏。确保在语言菜单下选中 IJ1 宏，然后复制并粘贴以下代码。单击运行以执行宏 （补充文件）。

Results

图1中显示了测试的超声波刻度器尖端之一的图像分析步骤。FSI 1000 尖端和 10P 尖端在水箱内成像，冷却水关闭（图 2）。气穴发生在尖端 FSI 1000 的弯曲附近，最大功率，靠近尖端 10P 中的自由端（图 3 和图 4）。FSI 1000 尖端的气穴平均面积为 0.1 ± 0.07 mm 2，10P 尖端的均值为 0.50 ±^{0.25 mm 2（}图 5）。²

图1:高速成像设置和图像分析 步骤 （a） 研究中使用的高速成像设置的示意图。（b） 研究中使用的图像分析步骤的示意图，仅显示刻度器尖端左侧的原始图像，并带气穴，然后相互二进制和减去，以计算气穴云的面积。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:比较不同提示高速 图像静止显示气穴发生在测试的两个超声波刻度器尖端周围 （a） FSI 1000 （b） 10P. 请点击这里查看这个数字的较大版本。

图 3:提示 10P 高速图像:高速图像静止提示 10P，以每秒 6400 帧拍摄的视频。 在尖端的自由端周围可以看到气穴。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:提示 FSI1000 高速图像:提示 FSI 1000 的高速图像静止图像，以每秒 6400 帧的速度拍摄的视频。 在尖端中间可以看到气穴。 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:气穴区图像分析结果。 FSI 1000 和 10P 超声波刻度仪尖端周围气穴平均面积，使用所述图像分析技术计算。误差条表示标准偏差。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件。 请点击这里下载此文件。

Discussion

本文所述的技术能够对具有高空间和时间分辨率的快速移动微泡进行成像。它有可能有利于广泛的科学学科，如化学工程，牙科和医学。工程应用包括用于清洁表面的成像气穴气泡，或用于流化床反应器中的成像气泡。生物医学应用包括围绕医疗和牙科仪器的成像气穴，以及使用气穴气泡从硬和软组织中成像生物膜脱毛。在这项研究中，我们演示了该技术，通过两个不同的牙科超声波刻度器尖端成像气穴。本研究中测试的两个尖端之间，气穴量不同，在尖端 10P 的自由端周围观察到更多的气穴云。这以前与振动振幅^20有关。高速视频显示，FSI 1000 尖端的振动较小，这可能是为什么围绕此尖端的气穴较少的原因。

图像分析方法的一个局限性是，删除刻度器面积的图像减法技术并不完全准确，因为刻度器是振荡的，因此减法可能会将刻度器的一些区域错误地分割为气泡。但是，这一点通过从大量帧（n=2000）中平均面积来解释。对于要减去的对象是静止的应用程序中，这不是问题。对于要减去的移动对象的算数具有更高方差的算物，我们建议在减去结果之前同步两个视频中的移动。在目前的研究中，我们没有同步振荡，但由于振动较低，我们可以假设在两次测量中振荡彼此非常对应。

图像阈值是准确的，因为亮场照明提供了具有良好对比度的统一背景。确保背景是统一的，并且不包含任何其他可能错误地分段的对象，这一点至关重要。可以使用其他自动阈值来修改阈值方法，以适应应用程序。手动阈值（用户设置阈值）也是可能的，但不建议这样做，因为它会降低结果的可重复性，因为不同的用户将选择不同的阈值。

图像分析已用于许多其他气泡成像研究。他们还使用类似的背光方法，在气泡和背景之间获得最佳对比度，并阈值对^{气泡进行分割 21、22、23、24。,22,23,24}本研究显示的方法也可以推广到许多不同的气泡成像应用，这些应用不仅限于高速成像。高速成像已用于在水中产生的气穴气泡，也围绕仪器，如内音文件和超声波刻度器12，25，26，27，28。^{12,25,26,27,28}例如，Rivas等人和Macedo等人使用连接到显微镜上的高速摄像机，由冷光源提供照明，用于用气穴进行图像清洁，并在内向文件^{17、29周围}进行图像气^穴。明亮的场照明在背景和气泡之间提供了更多的对比度，因此可以使用简单的分割技术，如阈值，正如Rivas等人所证明的，用于成像和量化气穴侵蚀和清洁随着时间的推移²⁹。由于灰度^4，30的变异性较高，暗场^{照明使阈,}值更加困难。图像分析已用于其他研究，以收集有关气泡^{1，2,的信息}。Vyas等人使用机器学习方法在超声波刻度器20周围分割气^穴气泡。本文中描述的方法更快，因为它使用简单的阈值，因此计算密集度较低，并且可以分析在刻度器上方和下方发生的气泡。但是，当前论文中使用的阈值方法只有在背景均匀时才准确。如果在成像过程中无法获得统一的背景，可以使用其他图像处理技术，例如使用背景减法使用滚球半径来校正不均匀的照明，使用中值或高斯滤镜进行滤波以消除噪声，或者也使用基于机器学习的技术^{20，31。,31}

最后，提出了一种高速成像和分析方案，用于成像和计算微观运动物体的面积。通过成像超声波刻度器周围的气穴气泡，我们演示了这种方法。它可用于其他牙科仪器（如牙内音文件）周围的成像气穴，并可轻松适应其他非牙科气泡成像应用。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 倍附件	Navitar	1-50011
12 倍，带 12 毫米微调 远距离显微镜变焦镜头	Navitar	1-50486
2x 适配器，带 f 安装	点 Navitar	1-62922
Cavitron Plus 超声波洁牙机	登士柏 Sirona	8184003
Cavitron 超声波插件 FSI 1000FSI 1000	登士柏 Sirona	UCAFTHD
光纤导光板。8 毫米光纤束，长度 1500 毫米。用于 Hayashi light 的聚焦镜头组件，用于安装的 1/4"-20 三脚架< br/>螺纹。	林	LGC1- 8L1500
齿轮头	曼富图	MN405	7.5kg 负载能力
HDF7010 大功率 LED 内窥镜 light 光源。150W LED 提供相当于 250W 氙气的冷输出。	林	LA-HDF710
重型三脚架	曼富图	MN475B	齿轮式中轴，12公斤负载
高速摄像机	平台	103526	FASTCAM Mini AX200 900K M3 （16GB 内存）
高精度旋转 载物台	Thorlabs	PR01/M
实验室千斤顶	Camlab	1194083
微定位滑板	曼富图	SKU 454
微定位载物台 3D	Thorlabs	PT3/M
微定位载物台旋转	Thorlabs	OCT-XYR1/M	OCT-XYR1/M - 带实心顶板的 XY 载物台
NEWTRON P5 XS超声波洁牙机	Acteon	F62118
超声波插件 10P	Acteon	F00253