使用高速相机和图像分析对快速移动微泡区域进行成像与量化

摘要

使用连接变焦镜头的高速相机对空化微泡进行成像。文中详细说明了实验装置，并通过图像分析计算空化的面积。图像分析使用 ImageJ 软件完成。

摘要

本文介绍了一种用于成像空化气泡并计算其面积的实验与图像分析技术。此处提供的高速成像实验方法及图像分析流程也可应用于其他研究领域中微小气泡的成像，因此具有广泛的应用前景。我们将其应用于牙科超声洁治器周围空化现象的成像。对空化进行成像非常重要，有助于表征其特性，并理解如何将其应用于各种实际场景。发生在牙科超声洁治器周围的空化效应可作为一种新型牙菌斑清除方法，相比现有的牙周治疗技术，该方法可能更高效且对组织损伤更小。本文介绍了一种利用高速相机和变焦镜头对牙科超声洁治器尖端周围空化气泡云进行成像的方法。同时，我们采用机器学习图像分析技术计算空化区域的面积。图像分析使用开源软件完成，所介绍的方法易于复现，无需编程经验，且可根据用户的具体应用需求轻松修改。

引言

对气泡运动进行成像是许多应用中的重要环节，因为气泡运动控制着系统的流体动力学行为。该技术可在多种场景中发挥重要作用，例如流化床反应器^1,2，或利用空化气泡进行清洗的过程^3,4。对气泡成像的目的是更深入地理解气泡动力学特性，或了解气泡群的运动方向与行为。这既可以通过观察所获得图像中的结构实现，也可以借助图像分析技术获取定量信息，例如气泡的尺寸。

空化气泡是当流体压力低于饱和压力值时在流体中形成的气体或蒸气实体⁵。当在超声频率下对流体施加声场时，可能产生空化气泡。它们会反复生长和崩塌，在崩塌时以高速微射流和冲击波的形式释放能量^6,7。这些能量可通过剪切力使表面颗粒脱落，从而实现表面清洁⁸。目前，空化气泡在半导体、食品和伤口清洁等不同工业领域的表面清洗应用正受到研究^9,10,11,12。它们还可用于清除牙齿上的牙菌斑以及牙科种植体等生物材料表面的污染物^12,13。在目前使用的牙科器械（如超声波洁牙器和根管锉）周围会发生空化现象，并显示出作为这些器械辅助清洗手段的潜力¹⁴。

空化气泡的振荡发生在几微秒内，因此需要使用高速相机以每秒数千帧的速度进行成像，才能捕捉其运动过程⁸。我们展示了一种对牙科超声洁治器周围微气泡空化现象进行成像的方法。该研究的目的是了解不同超声洁治器周围空化效应的变化规律，从而将其优化为一种新型的牙菌斑清除方式。

以往用于研究空化现象的方法包括声致化学发光法，该方法使用鲁米诺来检测空化发生的位置^15,16。然而，这是一种间接技术，无法实时观察空化气泡。因此，该方法不能准确定位空化在仪器上的具体发生位置，也无法获得有关气泡动力学的信息，除非与其他成像技术结合使用¹⁷。高速成像不仅能够捕捉空化气泡的生长与塌陷过程，还能识别发生的空化类型：空化云、微射流和微喷射流^6,7,18。这些信息有助于更深入地了解空化如何实现表面清洁。

我们介绍一种利用高速相机成像空化微泡并计算空化发生平均面积的方法。本方法以不同牙科超声洁治器工作尖周围发生的空化现象为例进行演示，但其实验与图像分析步骤也可应用于其他场景，例如对其他宏观和微观气泡的成像。

方案

1. 仪器设置

1. 选择待成像的仪器或物体。本实验中对超声波洁牙器进行了成像。超声波洁牙器的尖端在水中会产生空化气泡。
2. 为待成像仪器选择一个具有XYZ平移和旋转功能的微调定位平台。将其放置在实验升降台（laboratory jack）上。将仪器手柄固定在微调定位平台上。
3. 选择一个光学透明的盛水容器用于成像。本实验所用容器由玻璃显微镜载玻片制成。
4. 选择一个带有旋转平台的XY平台。将其放置在实验升降台上。将盛水容器置于平台上，并加入过滤水（反渗透水或蒸馏水）。

2. 高速摄像机设置

1. 选择具有所需帧率和分辨率的高速摄像机，以及带有光纤导光管的高强度光源。
2. 将微调滑动平台安装到高速摄像机机身，并将其连接至三脚架支架。
3. 选择具有所需分辨率和焦距的镜头，并将其安装到摄像机上。本实验中使用变焦镜头，分辨率为 8.4 µm/像素。
4. 用水填充成像水槽，并将待成像器械的尖端以所需方向置于水槽中。
5. 连接摄像机并在软件中加载实时预览后，先使用低倍率对超声洁牙器的尖端进行对焦，必要时重新调整光源位置。将器械和光源置于摄像机前方并对焦。调节至所需的帧率和亮度。
   注意：在高帧率、短曝光时间及/或高倍率成像时，需要更高的光照强度。照明可采用反射模式或透射模式。本方案中使用高强度冷光源装置，以透射模式（明场）提供照明。
6. 为高速摄像机设置最佳帧率和曝光时间。本实验中帧率为 6400 fps，曝光时间为 262 纳秒。对于快速移动的气泡（如空化气泡），需使用短曝光时间以确保成像清晰。
7. 调节变焦镜头的放大倍数和光源强度，使背景呈现白色且不过曝。

3. 校准

1. 记录探针的位置（x-y载物台的旋转角度，仪器的旋转角度，以确保可重复性）。
2. 为确保每次重复实验的视野一致，需选择一个参考点并记录其坐标。本实验中参考点为超声洁牙器的尖端。后续实验中可将其重新定位至视野中的相同位置。
3. 若像素尺寸未知，可在设定的放大倍数下对具有10 µm刻度的测微尺进行成像，并使用Fiji等图像分析软件计算分辨率。

4. 高速视频记录

1. 在无空化状态下对器械成像。该图像将在图像分析中用于从空化图像中减去背景，以计算空化气泡的面积。将视频保存为TIFF等格式，以避免损失图像质量。
2. 对处于空化工作状态的器械进行成像。确保有足够的帧数以进行准确分析，例如重复5次，每次500帧。

5. 图像处理

1. 从 ImageJ 网站（https://imagej.net/Fiji）下载 Fiji¹⁹。已提供一个 ImageJ 宏代码，可自动执行下述图像分析步骤，也可根据具体应用进行修改。该宏的各个步骤详见 5.3–5.5。
2. 如有必要，裁剪图像以去除因照明不均导致的较暗区域。确保所有图像裁剪至相同尺寸，并在图像中的相同位置进行裁剪。
3. 使用一种自动阈值方法将图像转换为二值图像。本示例中采用最小自动阈值法。
4. 执行“填充孔洞”命令，以消除气泡内部被错误分割的黑色像素。
5. 计算图像栈的直方图，以显示每帧中对应超声洁治器和空化气泡的像素数量。
6. 本例中，对应气泡的像素为白色，其值为 255。保存这些测量结果。
7. 对无气泡状态下仪器工作的视频重复执行步骤 5.3–5.6。
8. 仅根据直方图结果计算超声洁治器尖端的平均面积。
9. 从含气泡视频中计算出的各面积值中减去仪器本身的平均面积，所得剩余面积即为气泡面积。
10. 使用 Fiji 中的图像计算器，通过从含气泡的二值图像中减去洁治器的二值图像来可视化气泡分布。
11. 计算气泡面积的均值和标准差。
12. 将像素数量转换为实际面积（本例中为 µm²），方法是乘以像素尺寸的平方。通过使用高速相机在与拍摄实验相同放大倍数下成像一个网格标尺，并利用 ImageJ 设置标尺，来确定每个像素的实际大小。
13. 绘制数据图表。若比较不同条件下的气泡面积，还可进行统计分析以检验差异的显著性。

6. ImageJ 宏

1. 在 ImageJ/Fiji 菜单中，依次选择 Plugins > New > Macro。确保语言菜单下已选中 IJ1 Macro，然后复制并粘贴以下代码。点击运行以执行该宏（补充文件）。

结果

其中一个测试的超声波洁牙器工作尖的图像分析步骤如图1所示。FSI 1000 工作尖和 10P 工作尖在关闭冷却水的情况下置于水箱中成像（图2）。在最大功率下，FSI 1000 工作尖的空化现象发生在弯曲部位附近，而 10P 工作尖的空化则发生在自由端附近（图3 和 图4）。FSI 1000 工作尖的平均空化面积为 0.1 ± 0.07 mm²，10P 工作尖的平均空化面积为 0.50 ± 0.25 mm²（图5）。

图1：高速成像装置及图像分析步骤（a）本研究中所用高速成像装置的示意图。（b）本研究中所用图像分析步骤的示意图，显示了仅包含洁牙尖端的原始图像（左侧）以及含有空化现象的图像，随后将这些图像进行二值化处理并相互相减，以计算空化云的面积。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：不同超声洁治器工作尖的比较 高速摄像静止图像显示在两种测试的超声洁治器工作尖周围产生的空化现象（a）FSI 1000（b）10P。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：尖端10P的高速图像：尖端10P的高速图像帧，来自以每秒6400帧拍摄的视频。 可观察到尖端自由端周围出现空化现象。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：Tip FSI1000 高速图像：以每秒 6400 帧拍摄的视频中提取的 Tip FSI1000 高速图像帧。 可观察到在探头中部周围出现空化现象。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：空化区域图像分析结果。 使用所述图像分析技术计算出的 FSI-1000 和 10P 超声洁牙机探头周围发生空化的平均面积。误差线表示标准偏差。请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件。请点击此处下载该文件。

讨论

本文所述技术能够以高空间和时间分辨率对快速移动的微泡进行成像，有望广泛应用于化学工程、牙科和医学等多个科学领域。工程应用包括对用于表面清洁的空化气泡，或对流化床反应器中的气泡进行成像。生物医学应用则包括对医用和牙科器械周围产生的空化现象进行成像，以及利用空化气泡对硬组织和软组织上的生物膜进行清创成像。在本研究中，我们通过成像两种不同牙科超声洁治器工作尖周围的空化现象来验证该技术。在本研究测试的两种工作尖之间，空化程度存在差异，其中10P型工作尖的自由端周围观察到更多的空化云。这此前已被归因于振动幅度²⁰。高速视频显示，FSI 1000型工作尖的振动较小，这可能是其周围空化现象较少的原因。

图像分析方法的一个局限性在于，用于去除锉刀区域的图像相减技术并不完全准确，因为锉刀处于振荡状态，因此相减过程可能会将锉刀的某些部分错误地分割为气泡。然而，通过大量帧数（n=2000）的面积平均化处理，已对此误差进行了校正。对于需要去除的对象为静止的应用场景，此问题不会出现。在需要去除的运动物体具有较大变异性的研究中，我们建议在相减前对两段视频中的运动进行同步，以获得准确的结果。在本研究中，我们未对振荡进行同步，但由于振动幅度较低，可以认为这两次测量中的振荡状态具有良好的对应性。

图像阈值分割准确，因为明场照明提供了具有高对比度的均匀背景。必须确保背景均匀，且不包含任何可能被错误分割的其他物体。可根据具体应用需求，采用其他自动阈值方法对阈值分割方法进行调整。手动阈值分割（即由用户设定阈值）也是可行的，但不推荐使用，因为不同用户会选择不同的阈值，从而降低结果的可重复性。

图像分析已广泛应用于其他气泡成像研究中。这些研究同样采用背光方法，以获得气泡与背景之间的最佳对比度，并利用阈值分割技术对气泡进行分割^21,22,23,24。本研究所展示的方法也可推广应用于多种不同的气泡成像场景，不仅限于高速成像。高速成像已被用于研究水中产生的空化气泡，以及诸如根管锉和超声洁牙器等器械周围的空化气泡^{12,25,26,27,28}。例如，Rivas 等人和 Macedo 等人使用连接显微镜的高速相机，并通过冷光源照明来成像空化清洁过程以及根管锉周围的空化现象^17,29。明场照明可在背景与气泡之间提供更高的对比度，使得可以采用诸如阈值分割等简单的分割技术，正如 Rivas 等人所展示的那样，用于随时间成像并量化空化侵蚀和清洁效果²⁹。暗场照明由于灰度变化较大，使得阈值分割更加困难^4,30。其他研究也已使用图像分析来获取有关气泡的更多信息^1,2。Vyas 等人采用机器学习方法对超声洁牙器周围的空化气泡进行分割²⁰。本文所述方法更为快速，因其采用简单的阈值分割，计算量较小，且可分析洁牙器上方和下方出现的气泡。然而，本文所用的阈值分割方法仅在背景均匀时才具有较高准确性。若在成像过程中无法获得均匀背景，则可采用其他图像处理技术，例如使用滚动球半径进行背景扣除以校正非均匀照明，采用中值或高斯滤波器滤除噪声，或使用基于机器学习的技术^20,31。

综上所述，我们提出了一种高速成像与分析方案，用于对微观运动物体进行成像并计算其面积。我们通过成像超声洁牙器周围产生的空化气泡验证了该方法。该方法可用于其他牙科器械（如根管锉）周围的空化现象成像，也可轻松扩展应用于其他非牙科领域的气泡成像研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25倍接头	Navitar	1-50011
12倍，12毫米微调 长距离显微镜变焦镜头	Navitar	1-50486
带F卡口的2倍转接器	Navitar	1-62922
Cavitron Plus 超声波洁牙机	Dentsply Sirona	8184003
Cavitron 超声波工作头 FSI 1000FSI 1000	Dentsply Sirona	UCAFTHD
光纤导光束，8毫米光纤束，长度1500毫米。用于Hayashi光源的聚焦透镜组件，1/4"-20三脚架 螺纹安装接口。	Hayashi	LGC1- 8L1500
齿轮式云台	Manfrotto	MN405	7.5千克负载能力
HDF7010 高功率LED内窥镜光源 150W LED提供相当于250W 氙灯的冷光源输出。	Hayashi	LA-HDF710
重型三脚架	Manfrotto	MN475B	带齿轮中心柱，12千克负载能力
高速相机	Photron	103526	FASTCAM Mini AX200 900K M3（16GB内存）
高精度旋转平台	Thorlabs	PR01/M
实验室升降台	Camlab	1194083
微调滑动板	Manfrotto	SKU 454
三维微调平台	Thorlabs	PT3/M
微调旋转平台	Thorlabs	OCT-XYR1/M	OCT-XYR1/M - 带实心顶板的XY平台
NEWTRON P5 XS 超声波洁牙机	Acteon	F62118
超声波工作头 10P	Acteon	F00253