通过流式细胞术和过继性转移对肿瘤浸润性髓系细胞进行功能分析

摘要

本方案提供了在小鼠皮内或皮下肿瘤模型中进行实体瘤解离和髓系细胞分离的可靠方法。流式细胞术可用于肿瘤微环境中异质性髓系细胞群体的表型鉴定，而分选后的细胞可通过过继转移实验来验证其功能活性。

摘要

肿瘤浸润性髓系细胞群体是一类具有广泛免疫抑制功能的异质性细胞，肿瘤可利用这些细胞支持自身生长。这类细胞在肿瘤组织及继发性淋巴组织中的积聚会导致抗肿瘤免疫应答受到抑制，因此成为治疗干预的重要靶点。已知局部细胞因子微环境可决定肿瘤浸润性髓系细胞的功能编程，因此研究人员已设计出多种策略，旨在调控肿瘤微环境（TME），使其呈现更有利于抗肿瘤髓系细胞活性的细胞因子谱型。为评估治疗干预所引起的肿瘤浸润性髓系细胞变化，本文将阐述从荷瘤小鼠的皮肤内/皮下实体肿瘤组织中分离肿瘤组织的操作流程，以为白细胞的回收做准备。本文还将提供流式细胞术分析策略，用于鉴定分离所得白细胞中的异质性髓系细胞群体，并表征其独特的髓系表型。最后，本文将介绍一种分离具有活性的髓系细胞用于功能检测的方法，并评估其在过继性细胞转移治疗背景下的治疗价值。

引言

肿瘤微环境（TME）由快速增殖的肿瘤细胞和周围异质性的间质细胞区室组成。由于生长中的肿瘤通常血管化程度较低，TME成为一个以缺氧、营养缺乏和酸中毒为特征的独特外周部位¹。为了在这种环境中存活，肿瘤通过应激反应和代谢重编程，分泌多种可溶性因子，促进组织重塑和血管生成，并选择性募集免疫细胞²。由于髓系细胞是TME中最丰富的造血细胞类型之一，目前对肿瘤浸润性髓系细胞在TME中作用的研究日益受到关注。

髓系细胞是一类异质性且具有可塑性的天然免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞。尽管它们在组织稳态和适应性免疫应答调控中发挥关键作用，但其功能会因局部微环境中激活信号的组成不同而发生极化³。肿瘤通过在肿瘤微环境（TME）中分泌可溶性因子，利用髓系细胞的这些特性。这些替代性信号可将髓系造血导向不成熟的分化方向，并改变已存在的肿瘤浸润性髓系细胞的功能³。事实上，TME中的髓系细胞常促进肿瘤进展，并可抑制抗肿瘤免疫应答，从而对癌症治疗产生不利影响。

尽管促进免疫抑制性髓系细胞耗竭的治疗策略已被证明可延缓肿瘤生长⁴，但由于缺乏靶向特异性，可能误清除具有免疫刺激功能的髓系细胞，而后者反而有助于....

方案

注意：所有动物实验均符合加拿大动物护理委员会的指导方针，并已获得麦克马斯特大学动物研究伦理委员会的批准。

1. 肿瘤收获与解离

1. 将6-8周龄雌性C57BL/6小鼠进行皮内/皮下接种，注射2 × 10⁵ B16 黑色素瘤细胞，如 Nguyen 所述 等⁸ 让肿瘤生长7天后再进行收获。
2. 通过颈椎脱位处死小鼠，操作时注意不要破坏肿瘤。采集前用70%乙醇喷洒小鼠体表。
3. 使用手术刀和剪刀，将皮内/皮下肿瘤连同周围组织（包括附着的肿瘤引流淋巴结）一起手术切除，并将肿瘤置于预先称重的微量离心管中。置于冰上保存。
   注意：肿瘤采集应在动物专用生物安全柜中进行。较大的肿瘤使用15 mL离心管。
4. 称取肿瘤重量，向每管中加入500 µL含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基，用剪刀在管内或6孔板中将肿瘤剪切成小块。
   注意：加入消化液后，肿瘤组织块应足够小，以便可用电动移液器混匀。
5. 在含10% FBS和5 mM钙的RPMI-1640培养基中溶解IV型胶原酶（0.5 mg/mL）和DNase（0.2 mg/mL），配制解离混合液 氯化物
   注意：为最大限度保持胶原酶活性，解离混合液必须现配现用。
6. 将剪碎的肿瘤悬液转移至15....

结果

结果表明，该方法可从实体小鼠肿瘤中获得大量髓系细胞。受体完整性和细胞活力的保持有助于对目标髓系细胞亚群进行可靠的 functional 分析。该髓系细胞分离方法的改进使得在过继性 T 细胞治疗期间，通过使用 I 类组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）MS-275 对肿瘤微环境（TME）进行正常化处理后，能够明确肿瘤内髓系细胞功能的动态变化。通常，TIL 分离方案并未采取最大化髓系细胞得率的步骤。⁹因此，酶消化通常过于剧烈，导致样本活力下降。当处理B16黑色素瘤肿瘤时，在对CD45.2进行阳性富集前，使用I型胶原酶处理1小时（一种常用条件）会导致细胞活力显著降低。⁺ 通过磁选法分离细胞，其形态（前向散射面积（FSC-A）） 与. 侧向散射面积（SSC-A）及髓系细胞亚群门控（CD11b） 与 CD11c) 表明髓系细胞（CD11b）的得率⁺ 或 CD11c⁺）以及非髓系细胞（CD11b^- CD11c^-) 极低（

讨论

尽管肿瘤浸润性髓系细胞在肿瘤内处于不同的活化和分化状态，但已鉴定出多个亚群，包括肿瘤相关树突状细胞（TADCs）、肿瘤相关中性粒细胞（TANs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）以及肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）¹²。然而，用于鉴定这些髓系细胞亚群的细胞表面标志物存在表达重叠，使得目前在表型上难以将肿瘤内的髓系细胞与其他髓系细胞区分开来¹³。同样，现有髓系抗体染色组合也可能难以检测到治疗诱导的肿瘤浸润性髓系细胞的表型变化。综上所述，特异性表面标志物的缺乏限制了对髓系细胞生物学特性的深入理解。为了明确区分天然存在、肿瘤驱动以及受治疗影响的髓系细胞，必须在表型特征的基础上，结合其功能对髓系细胞亚群进行综合评估。

本文所述的肿瘤组织收获与解离方法，可实现髓系细胞的分离，同时保持细胞活力及表面标志物的完整性。由于肿瘤浸润性髓系细胞对ex vivo操作较为敏感⁷，本实验方案的重点在于采用较为温和的机械和酶解解离方法。然而，根据肿瘤组织类型.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 700 小鼠抗小鼠 CD45.2	BD Biosciences	560693	1:100
APC-Cy7 小鼠抗小鼠 NK-1.1	BD Biosciences	560618	1:100
生物素标记的小鼠抗小鼠 CD45.2	BD Biosciences	553771
BV421 仓鼠抗小鼠 CD11c	BD Biosciences	562782	1:100
BV650 大鼠抗小鼠 F4/80	BD Biosciences	743282	1:100
BV711 大鼠抗小鼠 CD8a	BD Biosciences	563046	1:100
IV 型胶原酶，粉末状	Gibco	17104019
DNase I	Roche	10104159001
EasySep 小鼠 CD11b 阳性选择试剂盒 II	Stemcell Technologies	18970
EasySep 小鼠 CD11c 阳性选择试剂盒 II	Stemcell Technologies	18780
EasySep 释放小鼠生物素阳性选择试剂盒	Stemcell Technologies	17655
FITC 大鼠抗小鼠 Ly-6C	BD Biosciences	553104	1:100
可固定的活力染色 510	BD Biosciences	564406	1:1000
固定/破膜溶液试剂盒（BD Cytofix/Cytoperm）	BD Biosciences	554714
PE 大鼠抗 CD11b	BD Biosciences	557397	1:100
PE-Cy7 大鼠抗小鼠 CD4	BD Biosciences	552775	1:100
PerCP-Cy5.5 大鼠抗小鼠 Ly-6G	BD Biosciences	560602	1:100
破膜/洗涤缓冲液（BD Perm/Wash）	BD Biosciences	554723
纯化的大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体）	BD Biosciences	553141
iNOS 单克隆抗体 (CXNFT)，APC 标记	Thermo Fisher	17-5920-82	1:100
人/小鼠精氨酸酶 1/ARG1 荧光素偶联抗体	R&D Systems	IC5868F	1:100