方法文章

通过流式细胞术和过继性转移对肿瘤浸润性髓系细胞进行功能分析

3.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61511

⸱

2021年3月5日

 ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了在小鼠皮内或皮下肿瘤模型中进行实体瘤解离和髓系细胞分离的可靠方法。流式细胞术可用于肿瘤微环境中异质性髓系细胞群体的表型鉴定，而分选后的细胞可通过过继转移实验来验证其功能活性。

摘要

肿瘤浸润性髓系细胞群体是一类具有广泛免疫抑制功能的异质性细胞，肿瘤可利用这些细胞支持自身生长。这类细胞在肿瘤组织及继发性淋巴组织中的积聚会导致抗肿瘤免疫应答受到抑制，因此成为治疗干预的重要靶点。已知局部细胞因子微环境可决定肿瘤浸润性髓系细胞的功能编程，因此研究人员已设计出多种策略，旨在调控肿瘤微环境（TME），使其呈现更有利于抗肿瘤髓系细胞活性的细胞因子谱型。为评估治疗干预所引起的肿瘤浸润性髓系细胞变化，本文将阐述从荷瘤小鼠的皮肤内/皮下实体肿瘤组织中分离肿瘤组织的操作流程，以为白细胞的回收做准备。本文还将提供流式细胞术分析策略，用于鉴定分离所得白细胞中的异质性髓系细胞群体，并表征其独特的髓系表型。最后，本文将介绍一种分离具有活性的髓系细胞用于功能检测的方法，并评估其在过继性细胞转移治疗背景下的治疗价值。

引言

肿瘤微环境（TME）由快速增殖的肿瘤细胞和周围异质性的间质细胞区室组成。由于生长中的肿瘤通常血管化程度较低，TME成为一个以缺氧、营养缺乏和酸中毒为特征的独特外周部位1。为了在这种环境中存活，肿瘤通过应激反应和代谢重编程，分泌多种可溶性因子，促进组织重塑和血管生成，并选择性募集免疫细胞2。由于髓系细胞是TME中最丰富的造血细胞类型之一，目前对肿瘤浸润性髓系细胞在TME中作用的研究日益受到关注。

髓系细胞是一类异质性且具有可塑性的天然免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞。尽管它们在组织稳态和适应性免疫应答调控中发挥关键作用，但其功能会因局部微环境中激活信号的组成不同而发生极化3。肿瘤通过在肿瘤微环境（TME）中分泌可溶性因子，利用髓系细胞的这些特性。这些替代性信号可将髓系造血导向不成熟的分化方向，并改变已存在的肿瘤浸润性髓系细胞的功能3。事实上，TME中的髓系细胞常促进肿瘤进展，并可抑制抗肿瘤免疫应答，从而对癌症治疗产生不利影响。

尽管促进免疫抑制性髓系细胞耗竭的治疗策略已被证明可延缓肿瘤生长4，但由于缺乏靶向特异性，可能误清除具有免疫刺激功能的髓系细胞，而后者反而有助于控制癌症。这些促炎性髓系细胞可发挥显著的抗肿瘤作用，包括直接杀伤肿瘤细胞以及激活细胞毒性CD8+ T细胞5。另一种策略是恢复肿瘤微环境中髓系细胞的组成和功能，该方法已显示出治疗成效6；然而，将其“重编程”为抗肿瘤表型背后的生物学机制仍未完全阐明。因此，对肿瘤相关髓系细胞进行全面表征，对于进一步改进癌症治疗至关重要。

遗憾的是，肿瘤组织的可重复性解离以分离髓系细胞仍具有挑战性。与其它白细胞亚群相比，肿瘤来源的髓系细胞对ex vivo操作更为敏感，而过于剧烈的肿瘤处理可能导致酶切表位破坏以及回收细胞活力下降7。 本方法旨在提供一种可靠的肿瘤解离手段，以保持细胞表面标志物的完整性用于分析，并维持细胞活力以进行功能研究。与倾向于使用更强烈酶混合物以提高多种细胞亚群可重复释放的肿瘤浸润白细胞（TIL）分离方案相比，本方法采用更为温和的酶消化条件，以最大化髓系细胞的回收率。同时提供了高水平的多色流式设门策略，用于鉴定小鼠肿瘤中髓系细胞亚群，以便进一步表征和/或分选。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：所有动物实验均符合加拿大动物护理委员会的指导方针，并已获得麦克马斯特大学动物研究伦理委员会的批准。

1. 肿瘤收获与解离

  1. 将6-8周龄雌性C57BL/6小鼠进行皮内/皮下接种，注射2 × 105 B16 黑色素瘤细胞，如 Nguyen 所述 等8 让肿瘤生长7天后再进行收获。
  2. 通过颈椎脱位处死小鼠，操作时注意不要破坏肿瘤。采集前用70%乙醇喷洒小鼠体表。
  3. 使用手术刀和剪刀，将皮内/皮下肿瘤连同周围组织（包括附着的肿瘤引流淋巴结）一起手术切除，并将肿瘤置于预先称重的微量离心管中。置于冰上保存。
    注意：肿瘤采集应在动物专用生物安全柜中进行。较大的肿瘤使用15 mL离心管。
  4. 称取肿瘤重量，向每管中加入500 µL含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基，用剪刀在管内或6孔板中将肿瘤剪切成小块。
    注意：加入消化液后，肿瘤组织块应足够小，以便可用电动移液器混匀。
  5. 在含10% FBS和5 mM钙的RPMI-1640培养基中溶解IV型胶原酶（0.5 mg/mL）和DNase（0.2 mg/mL），配制解离混合液 氯化物
    注意：为最大限度保持胶原酶活性，解离混合液必须现配现用。
  6. 将剪碎的肿瘤悬液转移至15 mL锥形管中，每0.25 mg肿瘤组织加入10 mL消化液。将锥形管置于温度可控的轨道摇床中，37 °C、200 rpm振荡消化30分钟。加入两倍体积含10%胎牛血清（FBS）和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的冷RPMI-1640培养基以中和胶原酶活性，随后于4 °C冰箱中静置10分钟。
  7. 短暂涡旋后，将悬液转移至置于50 mL锥形管上的40 µm细胞筛中。使用注射器推杆和中和培养基将残留的肿瘤组织充分解离，并冲洗过筛。将悬液以500 × g离心5分钟。 g，4 °C），弃去上清液，将沉淀重悬于含2% FBS和1 mM EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）中。

2. 肿瘤浸润淋巴细胞富集与流式细胞术染色（FACS）

  1. 为富集肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）以进行髓系细胞表征，根据制造商说明书使用专为生物素阳性选择设计的磁性细胞分离试剂盒，并结合生物素标记的CD45.2抗体（参见材料表）。
  2. 将细胞重悬于200 µL FACS缓冲液（含0.5% w/v牛血清白蛋白（BSA）的PBS）中，并转移至96孔U型底板。
    注意：染色浓度不得超过1 × 108 个细胞/mL。根据需要调整体积，并将样本分至多个孔中以应对高细胞数量。
  3. 将板在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。每孔加入50 µL Fc阻断液（在FACS缓冲液中按1:200稀释纯化的抗小鼠CD16/CD32大鼠抗体[参见材料表]，终浓度为2.5 µg/mL），通过移液器吹打混匀细胞。4 °C孵育10分钟。
  4. 每孔加入50 µL含2倍浓度表面染色抗体（CD45.2、NK1.1、CD11c、F4/80、CD8a、Ly6C、CD11b、CD4、Ly6G，均按1:50稀释）和可固定活力染料（FVS，按1:500稀释）的FACS缓冲液，通过移液器吹打混匀细胞。4 °C孵育20分钟。
    注意：用铝箔覆盖板以避免光照。实验前应对抗体进行滴定，以经验方式确定最佳稀释比例。
  5. 每孔加入200 µL FACS缓冲液洗涤细胞两次，每次将悬液在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
  6. 每孔加入100 µL固定/透膜溶液（参见材料表），通过移液器吹打混匀细胞，4 °C孵育20分钟。
  7. 每孔加入100 µL 1×透膜缓冲液（参见材料表），将板在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
  8. 每孔加入200 µL 1×透膜缓冲液洗涤细胞，将悬液在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
    注意：在将细胞重悬于透膜缓冲液后，实验可暂停过夜。将样本置于4 °C避光保存。恢复实验前，先短暂混匀细胞再进行离心。
  9. 每孔加入100 µL含1倍浓度细胞内染色抗体（诱导型一氧化氮合酶2（NOS2）、精氨酸酶1（Arg1），均按1:100稀释）的透膜缓冲液，通过移液器吹打混匀细胞。4 °C孵育20分钟。
    注意：用铝箔覆盖板以避免光照。实验前应对抗体进行滴定，以经验方式确定最佳稀释比例。
  10. 每孔加入100 µL 1×透膜缓冲液，将板在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
  11. 每孔加入200 µL 1×透膜缓冲液洗涤细胞，将悬液在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
  12. 将细胞重悬于300 µL FACS缓冲液中。在进行流式细胞术分析前，通过带有40 µm滤网帽的5 mL圆底聚苯乙烯管过滤样本。

3. 肿瘤髓系细胞分选用于功能研究

  1. 通过流式细胞术分析确定目标髓系细胞群后，根据制造商说明书，使用专为CD11b或CD11c阳性选择设计的磁性细胞分离试剂盒对大量髓系细胞进行预富集，以用于分选（参见材料表）。
  2. 使用针对目标髓系细胞亚群的特异性表面染色抗体（CD11b、Ly6C、Ly6G，稀释比例为1:100），按照步骤2.2–2.5所述方法对预富集的细胞进行染色。
    注意：应包含可固定的活细胞染料，以确保分选活的髓系细胞。染色浓度不得超过1 × 108 个细胞/mL。根据细胞数量调整体积，并将样本分装至多个孔中以进行补偿。
  3. 将细胞重悬于冷分选缓冲液中（含1% w/v BSA、25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和1 mM EDTA的PBS）。通过装有40 µm滤网帽的5 mL圆底聚丙烯管过滤样本。将细胞置于冰上，并用铝箔包裹管子。
    注意：调整细胞浓度/体积以符合分选仪器的所需规格。
  4. 准备含有捕获液的样本收集管（含PBS与50% FBS的5 mL圆底聚丙烯管）。
    注意：分选前夜用5 mL捕获液包被管壁。次日运行样本前，弃去多余液体，仅保留1–2 mL捕获液。
  5. 调整分选仪设置，降低样本压力，防止液滴形成受到干扰。安装130 µm喷嘴头，使用10 psi设置。以低流速运行样本，并以100 rpm频率定期振荡，确保液滴沉积于管子中心。分选完成后，将样本置于冰上保存。
  6. 在4 °C孵育样本10分钟。离心5分钟（500 × g，4 °C），弃去上清液，将沉淀重悬于适合功能实验或过继转移的培养基中。

4. 纯化肿瘤髓系细胞的过继性转移

  1. 将重悬于30 µL PBS中的1 × 106个B16黑色素瘤肿瘤细胞经皮内接种至6-8周龄雌性C57BL/6小鼠体内。
    注意：应提前接种小鼠，确保在进行过继性转移时肿瘤体积不超过100 mm3。
  2. 将分选后的肿瘤髓系细胞重悬于含25 mM HEPES和1 mM EDTA的PBS中，细胞浓度为2 × 106个/mL。使用带40 µm滤网帽的5 mL圆底聚苯乙烯管过滤样品。置于冰上保存。
  3. 使用3%异氟烷诱导并维持小鼠麻醉状态。涂抹眼膏以防止眼部干燥或损伤。
  4. 用31 G注射器吸取50 µL细胞悬液。轻轻弹动注射器以排除气泡。使用酒精棉片清洁注射部位。
  5. 使用无菌镊子提起肿瘤基部的皮肤。以轻微向上倾斜的角度将针头插入皮下空间，从皮肤下方进入肿瘤。用镊子夹住针头周围的皮肤，缓慢注入注射器中的全部液体。拔针时继续用镊子夹住皮肤并缓慢抽出针头，随后用棉签擦拭可能的渗漏液。
    注意：如需进行其他治疗干预，可在此时实施。
  6. 让小鼠从麻醉状态中恢复。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

结果表明，该方法可从实体小鼠肿瘤中获得大量髓系细胞。受体完整性和细胞活力的保持有助于对目标髓系细胞亚群进行可靠的 functional 分析。该髓系细胞分离方法的改进使得在过继性 T 细胞治疗期间，通过使用 I 类组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）MS-275 对肿瘤微环境（TME）进行正常化处理后，能够明确肿瘤内髓系细胞功能的动态变化。通常，TIL 分离方案并未采取最大化髓系细胞得率的步骤。9因此，酶消化通常过于剧烈，导致样本活力下降。当处理B16黑色素瘤肿瘤时，在对CD45.2进行阳性富集前，使用I型胶原酶处理1小时（一种常用条件）会导致细胞活力显著降低。+ 通过磁选法分离细胞，其形态（前向散射面积（FSC-A）） 与. 侧向散射面积（SSC-A）及髓系细胞亚群门控（CD11b） 与 CD11c) 表明髓系细胞（CD11b）的得率+ 或 CD11c+）以及非髓系细胞（CD11b- CD11c-) 极低（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

尽管肿瘤浸润性髓系细胞在肿瘤内处于不同的活化和分化状态，但已鉴定出多个亚群，包括肿瘤相关树突状细胞（TADCs）、肿瘤相关中性粒细胞（TANs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）以及肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）12。然而，用于鉴定这些髓系细胞亚群的细胞表面标志物存在表达重叠，使得目前在表型上难以将肿瘤内的髓系细胞与其他髓系细胞区分开来13。同样，现有髓系抗体染色组合也可能难以检测到治疗诱导的肿瘤浸润性髓系细胞的表型变化。综上所述，特异性表面标志物的缺乏限制了对髓系细胞生物学特性的深入理解。为了明确区分天然存在、肿瘤驱动以及受治疗影响的髓系细胞，必须在表型特征的基础上，结合其功能对髓系细胞亚群进行综合评估。

本文所述的肿瘤组织收获与解离方法，可实现髓系细胞的分离，同时保持细胞活力及表面标志物的完整性。由于肿瘤浸润性髓系细胞对ex vivo操作较为敏感7，本实验方案的重点在于采用较为温和的机械和酶解解离方法。然而，根据肿瘤组织类型...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作由安大略省政府资助的安大略癌症研究所、加拿大卫生研究院（FRN 123516 和 FRN 152954）、加拿大癌症协会（资助号 705143）以及特里·福克斯研究所（TFRI-1073）提供支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 700 小鼠抗小鼠 CD45.2BD Biosciences5606931:100
APC-Cy7 小鼠抗小鼠 NK-1.1BD Biosciences5606181:100
生物素标记的小鼠抗小鼠 CD45.2BD Biosciences553771
BV421 仓鼠抗小鼠 CD11cBD Biosciences5627821:100
BV650 大鼠抗小鼠 F4/80BD Biosciences7432821:100
BV711 大鼠抗小鼠 CD8aBD Biosciences5630461:100
IV 型胶原酶，粉末状Gibco17104019
DNase IRoche10104159001
EasySep 小鼠 CD11b 阳性选择试剂盒 IIStemcell Technologies18970
EasySep 小鼠 CD11c 阳性选择试剂盒 IIStemcell Technologies18780
EasySep 释放小鼠生物素阳性选择试剂盒Stemcell Technologies17655
FITC 大鼠抗小鼠 Ly-6CBD Biosciences5531041:100
可固定的活力染色 510BD Biosciences5644061:1000
固定/破膜溶液试剂盒（BD Cytofix/Cytoperm）BD Biosciences554714
PE 大鼠抗 CD11bBD Biosciences5573971:100
PE-Cy7 大鼠抗小鼠 CD4BD Biosciences5527751:100
PerCP-Cy5.5 大鼠抗小鼠 Ly-6GBD Biosciences5606021:100
破膜/洗涤缓冲液（BD Perm/Wash）BD Biosciences554723
纯化的大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体）BD Biosciences553141
iNOS 单克隆抗体 (CXNFT)，APC 标记Thermo Fisher17-5920-821:100
人/小鼠精氨酸酶 1/ARG1 荧光素偶联抗体R&D SystemsIC5868F1:100

参考文献

  1. Paardekooper, L. M., Vos, W., vanden Bogaart, G. Oxygen in the tumor microenvironment: effects on dendritic cell function. Oncotarget. 10 (8), 883-896 (2019).
  2. Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
  3. Jahchan, N. S., et al. Tuning the tumor myeloid microenvironment to fight cancer. Frontiers in Immunology. 10, 1611(2019).
  4. Srivastava, M. K., et al. Myeloid suppressor cell depletion augments antitumor activity in lung cancer. PLoS One. 7 (7), 40677(2012).
  5. Awad, R. M., De Vlaeminck, Y., Maebe, J., Goyvaerts, C., Breckpot, K. Turn back the TIMe: targeting tumor infiltrating myeloid cells to revert cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 1977(2018).
  6. Strauss, L., et al. Targeted deletion of PD-1 in myeloid cells induces antitumor immunity. Science Immunology. 5 (43), 1863(2020).
  7. Cassetta, L., et al. Deciphering myeloid-derived suppressor cells: isolation and markers in humans, mice and non-human primates. Cancer Immunology, Immunotherapy. 68 (4), 687-697 (2019).
  8. Nguyen, A., et al. HDACi delivery reprograms tumor-infiltrating myeloid cells to eliminate antigen-loss variants. Cell Reports. 24 (3), 642-654 (2018).
  9. Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors. Journal of Visual Experiments: JoVE. (136), e57685(2018).
  10. Engfeldt, P., Arner, P., Ostman, J. Nature of the inhibitory effect of collagenase on phosphodiesterase activity. Journal of Lipid Research. 26 (8), 977-981 (1985).
  11. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. Journal of Visual Experiments: JoVE. (44), e2259(2010).
  12. Schupp, J., et al. Targeting myeloid cells in the tumor sustaining microenvironment. Cellular Immunology. 343, 103713(2019).
  13. Gabrilovich, D. I., Ostrand-Rosenberg, S., Bronte, V. Coordinated regulation of myeloid cells by tumours. Nature Reviews Immunology. 12 (4), 253-268 (2012).
  14. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  15. Roussel, M., et al. Mass cytometry deep phenotyping of human mononuclear phagocytes and myeloid-derived suppressor cells from human blood and bone marrow. Journal of Leukocyte Biology. 102 (2), 437-447 (2017).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

视频即将推出

相关文章