本方法旨在通过制备可溶性提取物，结合细胞活力检测和表型分析（包括流式细胞术、RT-PCR、免疫细胞化学以及其他细胞和分子生物学技术），评估生物材料的细胞毒性。
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本文内容
摘要
摘要
生物材料直接或间接与人体组织接触，因此评估其细胞毒性至关重要。此类评估可通过多种方法进行，但不同方法之间存在较大差异，影响了结果的可重复性及相互比较。本文提出一种利用可溶性浸提液评估生物材料细胞毒性的实验方案，我们将其应用于牙科生物材料。文中详细描述了浸提液的制备过程，包括颗粒制备及其在培养基中的浸提步骤。生物材料细胞毒性的评估基于四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞代谢活性、磺酰罗丹明B（SRB）法检测细胞活力、流式细胞术分析细胞死亡模式，以及May-Grünwald Giemsa染色观察细胞形态。此外，本文还提供了一套评估细胞功能的方案，通过免疫细胞化学和PCR检测特定标志物的表达水平。本方案采用浸提液法，为生物材料的细胞毒性及细胞效应评价提供了可重复且可靠的全面指导。
引言
生物相容性可定义为材料整合组织并诱导有利治疗反应的能力，且不引起局部或全身性损伤1,2,3。对于任何拟用于医学用途的材料，其生物相容性评价均至关重要。因此，本实验方案为致力于开发新型生物材料或探索现有生物材料新应用的研究人员提供了一种系统且全面的方法。
体外细胞毒性试验广泛用于生物相容性评价的第一阶段，通常采用原代细胞培养或细胞系。其结果是评估潜在临床应用价值的初步指标。除了在生物材料研发中具有关键作用外，此类检测也是满足美国和欧盟监管机构（FDA 和 CE 认证）市场准入现行法规要求的强制性环节4,5,6,7,8。此外，在生物医学研究中采用标准化检测方法，有助于对相似生物材料或医疗器械的不同研究结果进行重复验证和比较，具有重要意义9。
国际标准化组织（ISO）指南被....
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方案
1. 制备菌体沉淀
- 通过在聚氯乙烯（PVC）板上打制已知尺寸的圆形孔来制备聚氯乙烯（PVC）模具。
注：PVC模具可制成不同尺寸。使用公式 A = h(2πr) + 2πr2 计算PVC模具的接触表面积（r：圆柱半径；h：圆柱高度）。 - 根据制造商说明书，并尽可能在实验开始前制备待测生物材料。
注：对于膏状/膏状配方的生物材料，需手动用调拌刀混合适量基质膏和催化剂。对于基于液体和粉末配方的其他材料，应根据制造商说明书或适用于新材料的方法，进行手动调拌或使用振动机械混合。对于液态材料，此步骤无需进行。从第2步开始实验方案。 - 用调拌刀将生物材料置于模具中，并让其在适当时间内固化。
注：生物材料的固化时间及固化条件必须遵循制造商说明书或适用于新材料的规定。 - 固化后，将生物材料颗粒从PVC模具中取出，并放入容器中（可使用6孔板或培养皿）。
- 通过将颗粒置于紫外灯（UV）下每侧照射20分钟，对颗粒进行灭菌。
2. 获取生物材料的提取物
注意：所有操作均应在严格的无菌条件下进行。
- 根据1.1节所述公式计算颗粒表面积，确定所需的颗粒数量。
注意：作为参考值，250 mm的接触表面积2/mL
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结果
此处的代表性结果涉及牙科生物材料的研究。该提取方法可用于获取牙科材料暴露后细胞的毒性特征及细胞功能，包括对代谢活性（图2）、细胞活力、细胞死亡特征及细胞形态（图3）以及特定蛋白表达（图4）的影响。
MTT 法可用于简便快速地评估材料的细胞毒性。可对两种或多种材料进行比较（图2）；即使在低浓度（6.25%）和中等浓度（50%）下，若代谢活性显著降低，则表明材料毒性较高（图2a）。同时，细胞毒性较小的材料则仅表现出轻微或无代谢活性降低（图2b）。通过比较不同时间点的结果，可判断细胞毒性效应是即时发生还是出现在后期阶段。
细胞活力的变化提供了有关活细胞减少的重要信息，这种减少可能.......
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讨论
本方案的设计参考了ISO 10993-5标准，该标准涉及与组织接触的生物材料体外细胞毒性的评价，旨在评估材料的生物相容性，并有助于研究的可重复性21这是一个在科学界日益受到关注的问题，许多作者在实验设计中已开始遵循这些建议 体外 研究15,22,23,24,25,26,27,28.
所选方法旨在筛选细胞生物学中最相关的方面。因此，本方案超越了常规建议，提供了一种全面的细胞毒性评估方法，不仅.......
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披露
作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
感谢以下机构的支持：GAI 2013（科英布拉大学医学院）；CIBB 由葡萄牙科学技术基金会（FCT，科学技术基金会）通过战略项目 UIDB/04539/2020 和 UIDP/04539/2020 提供资助。感谢密歇根大学牙科学院 Jacques Nör 提供 MDPC-23 细胞系。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无水乙醇 | 默克密理博 | 100983 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase 细胞解离试剂 |
| ALDH 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
| Annexin V FITC | BD 生物科学 | 556547 | |
| 抗生素-抗真菌溶液 | Sigma | A5955 | |
| BCA 法 | 赛默飞世尔科技 | 23225 | Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma | 10035-04-8 | |
| CD133抗体 | 美天旎生物技术 | 293C3-APC | 别藻蓝蛋白（APC） |
| CD24 抗体 | BD 生物科学 | 658331 | 别藻青蛋白-H7（APC-H7） |
| CD44抗体 | Biolegend | 103020 | 太平洋蓝（PB） |
| 细胞筛 | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
| 胶原酶 IV 型 | Gibco | 17104-019 | |
| cOmplete Mini | 罗氏 | 118 361 700 0 | |
| DAB + 染色剂 | Dako | K3468 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma | 43815 | |
| DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
| DNA酶I | 罗氏 | 11284932001 | |
| DSP（M-20）抗体，1:100 | Santa Cruz Biotechnology | LS-C20939 | |
| ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | 人子宫内膜腺癌细胞系 |
| 表皮生长因子 | Sigma | E9644 | |
| Hepes 0.01 M | Sigma | MFCD00006158 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Sigma | F0291 | |
| 改良吉姆萨染色液，GS-500 | Sigma | MFCD00081642 | |
| 甘油 | Dako | C0563 | |
| 血细胞计数板 | VWR | HERE1080339 | |
| HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | 人乳腺鳞状细胞癌细胞系 |
| 胰岛素、转铁蛋白、硒溶液 | Gibco | 41400045 | |
| 梅-格雷夫斯病ünwald Stain MG500 | Sigma | MFCD00131580 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | 人乳腺腺癌细胞系 |
| 甲基纤维素 | AlfaAesar | 45490 | |
| NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
| 辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊免疫球蛋白多克隆抗体，1:100 | Dako | G-21234 | |
| 聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯) | Sigma | P3932 | |
| 腐胺 | Sigma | P7505 | |
| RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | 人子宫内膜癌细胞系 |
| 脱氧胆酸钠 | JMS | EINECS 206-132-7 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma | 436143 | |
| 底物缓冲液 | Dako | 926605 | |
| Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
| Triton-X 100 | 默克 | 108603 | |
| 台盼蓝 | Sigma | T8154 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma | T4049 | |
| <强>β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A5316 |
参考文献
- Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
- Bruinink, A., Luginbuehl, R. Evaluation of biocompatibility using in vitro methods: interpretation and limitations. Advances in Biochemical Engineerin....
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重印与许可
