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获取生物材料的细胞毒性和细胞反应

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DOI：

10.3791/61512

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2021年7月8日

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1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal

通讯作者： Anabela Baptista Paula <anabelabppaula@sapo.pt>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方法旨在通过制备可溶性提取物，结合细胞活力检测和表型分析（包括流式细胞术、RT-PCR、免疫细胞化学以及其他细胞和分子生物学技术），评估生物材料的细胞毒性。

摘要

生物材料直接或间接与人体组织接触，因此评估其细胞毒性至关重要。此类评估可通过多种方法进行，但不同方法之间存在较大差异，影响了结果的可重复性及相互比较。本文提出一种利用可溶性浸提液评估生物材料细胞毒性的实验方案，我们将其应用于牙科生物材料。文中详细描述了浸提液的制备过程，包括颗粒制备及其在培养基中的浸提步骤。生物材料细胞毒性的评估基于四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞代谢活性、磺酰罗丹明B（SRB）法检测细胞活力、流式细胞术分析细胞死亡模式，以及May-Grünwald Giemsa染色观察细胞形态。此外，本文还提供了一套评估细胞功能的方案，通过免疫细胞化学和PCR检测特定标志物的表达水平。本方案采用浸提液法，为生物材料的细胞毒性及细胞效应评价提供了可重复且可靠的全面指导。

引言

生物相容性可定义为材料整合组织并诱导有利治疗反应的能力，且不引起局部或全身性损伤1,2,3。对于任何拟用于医学用途的材料，其生物相容性评价均至关重要。因此，本实验方案为致力于开发新型生物材料或探索现有生物材料新应用的研究人员提供了一种系统且全面的方法。

体外细胞毒性试验广泛用于生物相容性评价的第一阶段，通常采用原代细胞培养或细胞系。其结果是评估潜在临床应用价值的初步指标。除了在生物材料研发中具有关键作用外，此类检测也是满足美国和欧盟监管机构（FDA 和 CE 认证）市场准入现行法规要求的强制性环节4,5,6,7,8。此外，在生物医学研究中采用标准化检测方法，有助于对相似生物材料或医疗器械的不同研究结果进行重复验证和比较，具有重要意义9。

国际标准化组织（ISO）指南被众多独立的商业、监管和学术实验室广泛采用，用于以准确且可重复的方式测试材料。ISO 10993-5 涉及体外细胞毒性评估，ISO 10993-12 则涉及样品制备10,11。在生物材料测试中 ，根据材料类型、接触组织及治疗目的，提供了三类测试方法以供选择：浸提液法、直接接触法和间接接触法8,11,12,13。浸提液法通过将生物材料加入细胞培养基中进行富集获得；直接接触法是将生物材料直接放置于细胞培养物上；而间接接触法则是通过屏障（如琼脂糖凝胶）将材料与细胞分隔后进行共孵育11。必须设置适当的对照组，并至少进行三次独立的实验5,8,10,11,14。

模拟或放大临床条件对于确定细胞毒性潜力至关重要。在进行浸提物测试时，材料的表面积； 培养基体积；培养基和材料的pH值；材料的溶解度、渗透压和扩散比率；以及振荡、温度和时间等浸提条件均会影响培养基的富集程度5。

该方法可对多种固态和液态药物制剂的细胞毒性进行定量和定性评估。可开展多种检测，如中性红摄取试验、集落形成试验、MTT 检测和 XTT 检测5,10,14。

目前发表的大多数细胞毒性评估研究采用的是较为简单的检测方法，即 MTT 和 XTT 法，这些方法提供的信息有限。生物相容性评估不仅应包括对细胞毒性的评价，还应包括对测试材料生物活性的评估——本方案支持这一观点2。在有合理依据并加以记录的情况下，应使用额外的评估标准。因此，本方案旨在提供一份全面的指南，详细阐述一套用于生物材料细胞毒性评价的方法。此外，本文还描述了对不同细胞过程的评估，包括细胞死亡类型、细胞形态、细胞在特定蛋白质合成中的功能以及特定组织的生成。

方案

1. 制备菌体沉淀

  1. 通过在聚氯乙烯（PVC）板上打制已知尺寸的圆形孔来制备聚氯乙烯（PVC）模具。
    注：PVC模具可制成不同尺寸。使用公式 A = h(2πr) + 2πr2 计算PVC模具的接触表面积（r：圆柱半径；h：圆柱高度）。
  2. 根据制造商说明书，并尽可能在实验开始前制备待测生物材料。
    注：对于膏状/膏状配方的生物材料，需手动用调拌刀混合适量基质膏和催化剂。对于基于液体和粉末配方的其他材料，应根据制造商说明书或适用于新材料的方法，进行手动调拌或使用振动机械混合。对于液态材料，此步骤无需进行。从第2步开始实验方案。
  3. 用调拌刀将生物材料置于模具中，并让其在适当时间内固化。
    注：生物材料的固化时间及固化条件必须遵循制造商说明书或适用于新材料的规定。
  4. 固化后，将生物材料颗粒从PVC模具中取出，并放入容器中（可使用6孔板或培养皿）。
  5. 通过将颗粒置于紫外灯（UV）下每侧照射20分钟，对颗粒进行灭菌。

2. 获取生物材料的提取物

注意：所有操作均应在严格的无菌条件下进行。

  1. 根据1.1节所述公式计算颗粒表面积，确定所需的颗粒数量。
    注意：作为参考值，250 mm的接触表面积2/mL11,15 通过加入9粒（r 3 mm × h 1.5 mm）的颗粒实现 每 mL 培养基。
  2. 制备可溶性提取物（富含生物材料的提取物）。
    1. 将沉淀物置于50 mL离心管中，加入相应量的细胞培养基。将离心管放入培养箱中，在37°C下孵育24小时 37°，持续旋转。
      注意：使用适用于细胞培养的细胞培养基。
    2. 24小时后，从培养箱中取出试管。此时，提取物的浓度为1/1或100%。
    3. 通过向细胞培养基中连续等体积添加预处理培养基，对提取物进行系列稀释。
      注意：培养基无需调节pH。
      1. 加入1 mL培养基至1 mL 100%提取物中，得到50%提取物。再加入1 mL培养基至1 mL 50%提取物中，得到25%提取物，依此类推（图1).
        注意：使用每种化合物对应的相关浓度。

连续稀释示意图，DMEM中的可溶性提取物，浓度梯度为100%至6.25%。
图1：可溶性提取物的制备与稀释方案。 请点击此处查看此图的放大版本。

3. 细胞与生物材料浸提液的孵育

  1. 制备细胞悬液，并根据实验所需的细胞数量，将其接种至合适的细胞容器中，例如多孔板。
    1. 从处于对数生长期、融合度为80%至90%的细胞培养瓶开始。
    2. 弃去细胞培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并加入胰蛋白酶-EDTA溶液（75 cm2 培养瓶使用1至2 mL）消化贴壁细胞使其脱落。
    3. 加入细胞培养液（75 cm2 培养瓶使用2至4 mL），将细胞悬液转移至离心管中，在200 × g 条件下离心5分钟。
    4. 将沉淀重悬于已知体积的细胞培养液中。
      注意：本方案适用于贴壁细胞培养；但经过简单调整后也可用于悬浮细胞培养。
    5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并计算细胞悬液的浓度。
    6. 将确定数量的细胞悬液用培养基稀释后接种至多孔培养板中。作为参考，接种密度建议为5 – 20 × 105 个细胞/cm2。
      注意：应根据细胞类型及其特性（特别是细胞倍增时间）计算合适的接种细胞数量。
  2. 将细胞置于培养箱中孵育24小时，以促进细胞贴壁。
  3. 孵育结束后，向培养板中加入待测材料的可溶性提取液。
    1. 吸除原有细胞培养液。
    2. 根据预设的浓度梯度，向各孔中加入生物材料的提取液；对照孔中加入新鲜细胞培养液。
    3. 将培养板继续孵育24小时或更长时间。
      注意：每次实验均需设置阴性对照组，即不加处理因素、仅维持在正常培养液中的细胞。孵育时间可根据具体研究目的进行调整。

4. 代谢活性的评估

  1. 在细胞与生物材料提取物共孵育后，从培养板中吸去培养基，并用 PBS 清洗每个孔。
  2. 在每个孔中加入适量体积的 PBS（pH 7.4）配制的 0.5 mg/mL 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基氯化四氮唑（MTT）溶液。
  3. 将培养板在 37 °C 条件下避光孵育 4 小时或过夜。
  4. 为溶解生成的甲臜结晶，向每个孔中加入适量体积的异丙醇中 0.04 M 盐酸溶液，并将培养板振荡 30 分钟。
    注意：根据孔的大小调整 MTT 和异丙醇的用量。
  5. 如有必要，通过上下吹打混匀各孔内容物，直至肉眼不可见结晶。
  6. 使用分光光度计，在 570 nm 波长下以 620 nm 作为参比波长测定吸光度。
  7. 为计算代谢活性，将处理组细胞的吸光度除以对照组培养物的吸光度；为获得百分比值，乘以 100。

5. 细胞死亡评估

注意：进行此评估时，每个实验条件至少应使用 106 个细胞。

  1. 根据所评估的条件，使用正确标识的离心管。
  2. 在细胞与生物材料提取物共孵育后，收集培养基至相应的离心管中。
  3. 消化并悬浮细胞，将细胞悬液加入相应的离心管中。
  4. 在120 × g 条件下离心5分钟，浓缩细胞悬液。
  5. 用PBS洗涤沉淀，在1,000 × g 条件下离心5分钟，弃去PBS。
  6. 加入1 mL PBS，将细胞沉淀转移至已标识的流式管中。
  7. 在1,000 × g 条件下离心5分钟，去除PBS。
  8. 加入100 µL结合缓冲液（0.01 M HEPES、0.14 mM NaCl和0.25 mM CaCl2）16，室温避光孵育约15分钟，使细胞膜恢复。
  9. 室温避光条件下，加入2.5 μL荧光标记的Annexin-V和1 μL碘化丙啶，孵育15分钟。
  10. 孵育结束后，加入400 μL PBS，立即上机进行流式分析。使用适当的软件进行数据的分析与定量。
  11. 以活细胞、早期凋亡、晚期凋亡/继发性坏死及坏死细胞的百分比形式呈现结果。

6. 形态学评估

  1. 选择合适尺寸的无菌玻璃盖玻片，使其能够放入多孔板内。
  2. 使用无菌镊子将每片盖玻片放入一个孔中。
  3. 将适当浓度的细胞悬液加入各孔中，于37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润环境中孵育过夜。
  4. 将细胞培养物暴露于提取物中，操作方法如前所述。
  5. 吸除培养基，并用PBS洗涤。
  6. 让盖玻片在室温下干燥，然后加入足量的May-Grünwald染液以覆盖盖玻片；孵育3分钟。
  7. 去除染液，并用蒸馏水洗涤1分钟。
  8. 去除水液，加入足量的吉姆萨（Giemsa）染液以覆盖盖玻片；孵育15分钟。
  9. 用流水冲洗盖玻片。
  10. 将盖玻片转移至载玻片上。
  11. 在显微镜下观察。使用选定的放大倍数拍摄照片。

7. 通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）评估细胞功能

注意：进行此评估时，每个条件至少应使用 2×106 个细胞。例如，碱性磷酸酶可作为评估成牙本质细胞活性的兴趣基因。其他兴趣基因见表1。

  1. 按照上述方法接种细胞。
    注意：接种的细胞浓度可能需要根据细胞类型以及所研究生物材料的细胞毒性进行相应调整。
  2. 按照上述方法用可溶性提取物孵育细胞。
  3. 按照前述方法将细胞解离，获得细胞悬液。
  4. 用 PBS 洗涤细胞两次；洗涤时在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
  5. 通过将细胞沉淀重悬于 1 mL RNA 纯化溶液（例如 NZYol）中，剧烈搅拌并反复吹打，以裂解细胞。
  6. 将样品在室温下孵育 5 分钟。
  7. 加入 200 µL 氯仿，用手剧烈振荡试管 15 秒。
  8. 在室温下孵育 3 分钟。
  9. 在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。在此离心过程中，样品会形成两相，RNA 位于水相（上层）。
  10. 将水相转移至新管中，加入 500 µL 冷异丙醇以沉淀 RNA。
  11. 在室温下孵育样品 10 分钟，然后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
  12. 弃去上清液，并在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟，用 1 mL 75% 乙醇洗涤沉淀。
  13. 在室温下干燥沉淀，直至乙醇完全挥发。
  14. 用无 RNase 的水重悬沉淀。
  15. 使用吸收光谱法在 260 nm 和 280 nm 波长下定量并测定样品纯度。确定 RNA 纯度，使用纯度比值（A260/280）约为 2.0 的样品。
  16. 将样品储存在 -80 °C 下。
  17. 按照试剂盒制造商的说明书进行 RT-PCR 实验。17
    注意：根据研究目的，选择需检测的特定标志物。

8. 通过蛋白质鉴定评估细胞功能

注意：根据研究目标，选择需要评估的特定蛋白质。例如，本研究以牙本质涎蛋白（DSP）作为评估成牙本质细胞活性的兴趣蛋白。其他感兴趣的蛋白质见表1。

  1. 将细胞培养在盖玻片上，并按前述方法加入提取物处理。
  2. 用 PBS 洗涤细胞培养物。
  3. 在室温下用 3.7% 多聚甲醛固定 30 分钟。
  4. 用 PBS 洗涤两次。
  5. 用含 0.5% Triton 的 PBS 处理 15 分钟以进行透化。
  6. 用含 0.3% 过氧化氢的 PBS 封闭过氧化物酶，作用 5 分钟。
  7. 用 PBS 洗涤两次。
  8. 用含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）的溶液洗涤两次。
  9. 用 2% BSA 封闭细胞培养物，孵育 45 分钟。
  10. 用含 0.5% BSA 的 PBS 洗涤。
  11. 根据所选蛋白，加入一抗在室温下孵育 60 分钟。
    注意：本实验方案使用一抗 DSP(M20) 抗体（1:100 稀释）和二抗多克隆兔抗山羊免疫球蛋白/HRP（1:100 稀释）。
  12. 用含 0.5% BSA 的 PBS 洗涤五次。
  13. 加入二抗，在室温下孵育 90 分钟。
    注意：使用含 0.5% BSA 的 PBS 配制抗体稀释液。
  14. 用含 0.5% BSA 的 PBS 洗涤五次，每次洗涤 1 分钟。
  15. 加入底物与显色剂混合液（浓度为每毫升底物中含 20 µL 显色剂），孵育 25 分钟。
  16. 用含 0.5% BSA 的 PBS 洗涤两次。
  17. 用苏木精复染 15 分钟。
  18. 依次用 0.037 mol/L 氨水和蒸馏水洗涤 5 分钟，以去除多余染料。
  19. 将盖玻片封固于载玻片上，封片介质使用甘油。
  20. 室温避光过夜干燥。
  21. 在显微镜下观察，并以选定的放大倍数拍摄照片。

9. 通过茜素红S检测法评估矿化

  1. 配制浓度为 40 mM 的茜素红 S 溶液18。在避光条件下搅拌 12 小时以充分混匀。
    注意：配制 100 mL 茜素红 S 溶液时，将 1.44 g 茜素粉末（分子量：360 g/mol）溶于超纯水中，并避光保存。该溶液的 pH 值至关重要，应控制在 4.1 至 4.3 之间。
  2. 按照上述方法，用可溶性提取物孵育细胞培养物。
  3. 用 PBS 洗涤细胞培养物三次。
  4. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。
  5. 用 PBS 洗涤三次。
  6. 在 37 °C、避光条件下，用茜素红染色液染色 20 分钟。
  7. 染色后，用 PBS 洗涤培养板，以去除多余的染料。
  8. 在显微镜下观察，并以选定的放大倍数拍摄照片。
  9. 向每孔中加入提取液（由 10% (w/v) 乙酸和 20% (w/v) 甲醇组成），室温下搅拌 40 分钟。
  10. 使用分光光度计在 490 nm 波长处测定吸光度19。

结果

此处的代表性结果涉及牙科生物材料的研究。该提取方法可用于获取牙科材料暴露后细胞的毒性特征及细胞功能，包括对代谢活性（图2）、细胞活力、细胞死亡特征及细胞形态（图3）以及特定蛋白表达（图4）的影响。

MTT 法可用于简便快速地评估材料的细胞毒性。可对两种或多种材料进行比较（图2）；即使在低浓度（6.25%）和中等浓度（50%）下，若代谢活性显著降低，则表明材料毒性较高（图2a）。同时，细胞毒性较小的材料则仅表现出轻微或无代谢活性降低（图2b）。通过比较不同时间点的结果，可判断细胞毒性效应是即时发生还是出现在后期阶段。

细胞活力的变化提供了有关活细胞减少的重要信息，这种减少可能损害组织在受到损伤后恢复的能力。通过测定活细胞百分比，可比较不同材料的细胞毒性；在相同浓度下，细胞毒性更强的材料会诱导更高的细胞死亡率（图3a 和 3b）。当细胞活力降低超过30%时，即被视为关键阈值，表明该材料可能存在生物相容性差的风险（图3a）。此信息需结合细胞死亡模式进行综合判断（图3a 和 3b）。在代表性结果中，细胞毒性较强的材料表现为细胞活力显著下降，并呈现晚期凋亡和坏死为主的细胞死亡模式（图3a）；而细胞毒性较弱的材料则表现为细胞死亡较少，且以早期凋亡和晚期凋亡为主的死亡模式（图3b）。

通过细胞形态学评估获得的信息（图3c）可补充细胞活力评估结果。细胞典型形态的改变可能提示细胞出现凋亡或坏死特征16。此外，本实验方案还可提供其他信息，例如可观察到材料颗粒（红色箭头，图3C）。

可通过多种技术评估提取物暴露后影响的细胞功能相关特异性标志物，例如免疫组织化学、PCR、流式细胞术、印迹法或比色法检测（表1）。暴露于提取物后DSP表达的代表性结果如图4a所示，可见某些材料（硅酸三钙类水门汀）可刺激细胞增加蛋白表达；而另一些材料（氢氧化钙类水门汀）则导致蛋白表达显著下降，且该效应与细胞活力的损失无关。在这两种情况下，提取物的浓度均直接影响蛋白表达水平。

在成牙本质细胞表型的 MDPC-23 细胞系中，矿化沉积物的形成是其特征性表现。矿化沉积物的鉴定与定量分析方案可用于评估此类特化细胞的特定功能。在本例中观察到，硅酸三钙水泥除细胞毒性较低外，还能促进细胞功能，表现为矿化沉积物增加（图4b）。相反，细胞毒性较高的氢氧化钙水泥则因细胞功能受损及死亡，导致矿化沉积减少（图4b）。除定性评估外，还可进行定量测定（图4c）。

氢氧化钙和三硅酸钙在不同时间的代谢活性比较图表。
图 2：代谢活性。 MDPC-23 细胞经氢氧化钙水泥 [a] 和三硅酸钙水泥 [b] 可溶性提取物处理 24、72 和 120 小时后的代谢活性。结果以对照组细胞培养为基准进行归一化，设定为 100%。显著性差异用 * 表示，其中 * 表示 p<0.05，** 表示 p<0.01，*** 表示 p<0.001。该图部分内容经出版方许可，改编自先前发表的文献20。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞活力与凋亡分析；柱状图与显微图像；氢氧化钙、硅酸三钙的作用。
图3：细胞活力、死亡特征及细胞形态。MDPC-23细胞经氢氧化钙和硅酸三钙生物材料处理后，在6.25%和50%浓度下暴露120小时后的细胞活力、细胞死亡特征及细胞形态。a) 和 b) 结果以活细胞、凋亡、晚期凋亡或坏死以及坏死细胞的百分比表示。与对照组或不同处理条件之间的显著差异以*表示，其中*表示 p <0.05，**表示 p <0.01，***表示 p <0.001。c) 细胞经生物材料可溶性提取物50%浓度处理后，使用May-Grünwald Giemsa染色。对照组为在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养的细胞。左侧列图像的放大倍数为100倍，右侧列图像的放大倍数为500倍。图中比例尺代表100 µm。本图部分内容经出版方许可，改编自先前发表的文献20。 请点击此处查看此图的放大版本。

氢氧化钙、三硅酸钙细胞培养；吸光度图；浓度效应。
图4：DSP表达及矿化结节形成。a) MDPC-23细胞经免疫细胞化学标记以检测DSP表达，细胞在孵育96小时后接受50%和6.25%浓度的氢氧化钙和三硅酸钙处理。b) MDPC-23细胞经茜素红S染色后的图像，细胞在孵育120小时后接受50%和6.25%浓度的氢氧化钙和三硅酸钙生物材料处理。所有照片的放大倍数均为100倍。图中两个比例尺均代表150µm。c) MDPC-23细胞在暴露于氢氧化钙和三硅酸钙120小时后钙沉积物的形成。结果为样品与对照组吸光度的比值。显著性差异以*表示，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。本图部分内容经出版方许可改编自先前发表的文献20。 请点击此处查看此图的放大版本。

表1：成牙本质细胞分化/功能标志物列表47-79。 本表列出了成牙本质细胞的标志物及其检测方法；其中部分标志物亦可在其他组织中表达。

基因或蛋白方法参考文献
碱性磷酸酶（ALP）比色法47 48
免疫细胞化学20 49
Northern 印迹50
RT-PCR51 52
核心蛋白聚糖（DCN）比色法 ELISA53
免疫细胞化学54 55
RT-PCR53 56
牙本质基质蛋白 1（DMP-1）流式细胞术57
免疫细胞化学58 59
Northern 印迹50 60
RT-PCR47 49
Western 印迹50 60
牙本质基质蛋白 2（DMP-2）免疫细胞化学60 61
RT-PCR50 62
Northern 印迹60
Western 印迹62
牙本质磷蛋白（DPP）免疫细胞化学63
Northern 印迹63
牙本质涎蛋白（DSP）*免疫细胞化学20 60
Northern 印迹60 63
RT-PCR50
Western 印迹64 65
牙本质涎磷蛋白（DSPP）流式细胞术57
免疫细胞化学66 54
RT-PCR47 49
Northern 印迹67 68
Western 印迹64 62
釉蛋白酶/基质金属蛋白酶-20（MMP-20）Northern 印迹68
RT-PCR49 68
巢蛋白（Nestin）免疫细胞化学54 69
RT-PCR70 71
Western 印迹72
骨粘连蛋白（OSAD）免疫细胞化学73 74
Northern 印迹73
RT-PCR75
Western 印迹73 74
骨桥蛋白（OPN）免疫细胞化学76
Northern 印迹50
RT-PCR66 51
Western 印迹77
骨钙素（OCN）免疫细胞化学52
Northern 印迹50
RT-PCR51 52
Western 印迹77 78
Osterix（OSX）/转录因子 Sp7（Sp7）免疫细胞化学54 58
RT-PCR78
Western 印迹78 79
X染色体上与内肽酶同源的磷酸盐调节基因（Phex）Northern 印迹68
RT-PCR49 68
Western 印迹79
Runt相关转录因子 2（Runx2）免疫细胞化学66 52
RT-PCR66 70
Western 印迹62 77
*DPP 和 DSP 是 DSPP 的裂解产物。

讨论

本方案的设计参考了ISO 10993-5标准，该标准涉及与组织接触的生物材料体外细胞毒性的评价，旨在评估材料的生物相容性，并有助于研究的可重复性21这是一个在科学界日益受到关注的问题，许多作者在实验设计中已开始遵循这些建议 体外 研究15,22,23,24,25,26,27,28.

所选方法旨在筛选细胞生物学中最相关的方面。因此，本方案超越了常规建议，提供了一种全面的细胞毒性评估方法，不仅包含常用的检测手段，还结合了从细胞表型到功能等多个细胞参数的补充性评价。这种补充性评价对于真正评估生物材料的影响至关重要，因为细胞活力可能无法反映基因和蛋白质表达水平、细胞周期或分泌组等方面的改变。

提取物具有优势，特别是在贴壁细胞系中，因为其不会干扰细胞对基质的贴附以及最佳培养条件，而某些直接接触方法则需将材料置于培养板表面，可能产生干扰22,28。

此外，提取物可使细胞暴露于不同浓度的物质中29，模拟物质在组织中的扩散过程，从而反映其在体内经历的清除过程，尤其是在与高度灌注组织接触应用时。直接接触试验可能无法准确评估不同浓度的影响，而间接接触试验则可能在非扩散、膜扩散不完全或与琼脂发生反应等方面存在潜在困难。

优先选择能够提供定量评估的试验，细胞活力降低超过30%被视为具有细胞毒性11,30。在新型生物材料的研发过程中，若出现此类降低，则需决定是否重新配方或放弃该材料。若获得令人鼓舞的结果，应进一步开展旨在进行体内评价的研究29,31。

体外试验应模拟或放大临床条件，因此确定合适的表面积与体积比对于浸提液的制备至关重要。表面积与体积比的范围为1.25–6 cm2/mL 被建议用于具有表面不规则性的材料，如泡沫材料，其用量为 0.1–0.2 g/mL 或 6 cm2/mL 是一个起始点15,20,2。该 比率 250 毫米2 每 本方案及其他研究中所用的代表性结果均使用了 mL 培养基15,20.

即使在临床中未以这种方式使用，样品也必须通过不改变其特性的方法进行灭菌。紫外线照射通常是较好的选择。这对于防止细胞培养中的微生物污染至关重要11,24,32。

提取介质包括含或不含血清的细胞培养基、生理盐水溶液、二甲基亚砜或纯化水，应根据生物材料的化学特性进行选择11,33。若目标为细胞培养研究，优先使用细胞培养基，以避免额外的处理步骤。提取条件应根据实验模型进行调整。在本方案所示的代表性结果中，采用添加胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，在37 ± 1 °C条件下孵育24 ± 2小时。

某些生物材料可能会在提取介质中残留，从而对细胞培养产生不利影响。尽管应避免过滤和离心操作，但可在使用前让颗粒自然沉降。另一个问题是提取后pH可能发生改变。由于不建议进行后续pH调节11，因此必须测量并记录提取物的pH值，并在实验设计中根据需要增加用于分离pH效应的额外对照组。

尽管本方案是针对贴壁细胞培养描述的，但经过简单修改后也可用于悬浮细胞培养。同样，除了使用固体生物材料外，还可以对本方案（主要是提取步骤）进行调整，以研究液体、凝胶或泡沫材料34,35,36,37。

细胞培养物的密度制备至关重要，尤其是对于增殖速率较高的细胞培养物31。根据所用细胞推荐的接种密度范围，若计划进行长时间培养，则必须降低初始接种密度，以避免因过度汇合而引发的问题。此外，高细胞毒性的材料可能需要更高的初始接种密度。

除了提取方法学的优势外，对于需要评估细胞黏附性的材料而言，该方法并非最佳选择。在这种情况下，必须进行直接接触实验38,39,40,41。尽管这是一种全面的评估方法，但需要注意的是，这是一种体外评估，不能完全反映体内环境条件42。

生物材料不仅不应损伤组织，还应促进某些抗炎和免疫调节过程43,44,45,46。因此，本方案进一步包含了对细胞机制的评估，包括细胞活力和细胞死亡特征，以及其他蛋白质合成机制。所进行的评估应能够得出生物材料在活体组织中的生物活性结论，而不仅限于细胞毒性。

随着用于医学领域的新材料迅猛发展，不仅限于牙科，还包括骨科、外科、眼科、心脏病学等，应系统地进行初步筛选。本方案可能成为致力于开发和表征新型生物材料的研究人员的重要工具。

披露

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

感谢以下机构的支持：GAI 2013（科英布拉大学医学院）；CIBB 由葡萄牙科学技术基金会（FCT，科学技术基金会）通过战略项目 UIDB/04539/2020 和 UIDP/04539/2020 提供资助。感谢密歇根大学牙科学院 Jacques Nör 提供 MDPC-23 细胞系。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇默克密理博100983
AccutaseGibcoA1110501StemPro Accutase 细胞解离试剂
ALDH 抗体Santa Cruz BiotechnologySC166362
Annexin V FITCBD 生物科学556547
抗生素-抗真菌溶液SigmaA5955
BCA 法赛默飞世尔科技23225Pierce BCA 蛋白检测试剂盒
牛血清白蛋白SigmaA9418
CaCl2Sigma10035-04-8
CD133抗体美天旎生物技术293C3-APC别藻蓝蛋白（APC）
CD24 抗体BD 生物科学658331别藻青蛋白-H7（APC-H7）
CD44抗体Biolegend103020太平洋蓝（PB）
细胞筛BD Falcon35234040 µM
胶原酶 IV 型Gibco17104-019
cOmplete Mini罗氏118 361 700 0
DAB + 染色剂DakoK3468
二硫苏糖醇Sigma43815
DMEM-F12SigmaD8900
DNA酶I罗氏11284932001
DSP（M-20）抗体，1:100Santa Cruz BiotechnologyLS-C20939
ECC-1ATCCCRL-2923人子宫内膜腺癌细胞系
表皮生长因子SigmaE9644
Hepes 0.01 MSigmaMFCD00006158
碱性成纤维细胞生长因子SigmaF0291
改良吉姆萨染色液，GS-500SigmaMFCD00081642
甘油DakoC0563
血细胞计数板VWRHERE1080339
HCC1806ATCCCRL-2335人乳腺鳞状细胞癌细胞系
胰岛素、转铁蛋白、硒溶液Gibco41400045
梅-格雷夫斯病ünwald Stain MG500SigmaMFCD00131580
MCF7ATCCHTB-22人乳腺腺癌细胞系
甲基纤维素AlfaAesar45490
NaClJMGS37040005002212
辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊免疫球蛋白多克隆抗体，1:100DakoG-21234
聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)SigmaP3932
腐胺SigmaP7505
RL95-2ATCCCRL-1671人子宫内膜癌细胞系
脱氧胆酸钠JMSEINECS 206-132-7
十二烷基硫酸钠Sigma436143
底物缓冲液Dako926605
TrisJMGS20360000BP152112
Triton-X 100默克108603
台盼蓝SigmaT8154
胰蛋白酶-EDTASigmaT4049
<强>β-肌动蛋白抗体SigmaA5316

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