通过表达GFP的成骨细胞小鼠颅骨分离法获取原代骨细胞

摘要

本方案描述了新生dmp1-topaz小鼠颅骨的解剖，以及通过细胞消化和分级分离方法获取表达绿色荧光蛋白的骨细胞，并制备用于荧光激活细胞分选（FACS）的骨细胞。

摘要

骨细胞曾被认为只是骨骼中一种被动存在的细胞，其功能仅限于在幕后感知机械负荷；如今，骨细胞已被推至研究前沿，被证实具有多种重要功能，例如主动修饰细胞外基质，并通过包裹其自身的陷窝-小管系统形成一个内分泌器官，向远端部位传递信号。得益于一系列研究方法的发展，从原代骨细胞的分离到类骨细胞系的建立，使得体外研究骨细胞成为可能，目前人们对骨细胞的兴趣显著增加，关于其结构与功能的知识也迅速积累。然而，骨细胞生物学及其与其他分子组分相互作用的诸多方面仍有待揭示。在本实验方案中，我们详细描述了一种高效分离原代骨细胞的方法：利用表达绿色荧光蛋白的dmp1-topaz新生小鼠颅骨骨细胞，通过细胞分馏结合荧光激活细胞分选技术（FACS）获得原代骨细胞培养物。

引言

骨细胞是由成骨前体细胞终末分化而来并包埋于其分泌基质中的细胞¹。在骨细胞群体中，骨细胞数量最多且寿命最长。它们位于骨陷窝内，具有典型的星状形态，其树突通过称为骨小管的通道延伸，与周围环境及骨表面形成广泛的通讯和代谢交换网络²。骨细胞协调成骨细胞和破骨细胞在骨重建中的作用，是主要的机械感受细胞，介导骨骼对机械负荷的适应性反应³，参与磷酸盐稳态⁴和骨基质矿化过程⁵，并与陷窝-小管系统共同作为内分泌器官向远端组织传递信号⁶。

骨细胞位于矿化的基质中，这种环境限制了其可及性，使得分离过程具有挑战性，从而阻碍了体外研究。最早描述的分离方法之一是利用骨细胞特异性的单克隆抗体（OB7.3）⁷从鸡颅骨中分离骨细胞，该抗体后来被确认为PHEX（X染色体上与内肽酶同源的磷酸盐调节基因）的禽类变体⁸。其他研究人员采用连续消化大鼠⁹或小鼠¹⁰长骨的方法，获得富含骨细胞的组分，据报道其中骨细胞纯度约为70%

方案

所有动物实验操作和动物护理均按照东北大学的规定和要求进行。

1. 新生 dmp1-topaz 小鼠颅盖骨的解剖

1. 本实验方案使用出生6‒7天的C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J小鼠幼崽。通过吸入5%异氟烷处死小鼠，随后将幼崽转移至70%乙醇中。
2. 将已处死的幼崽转移至未经处理的培养皿中。
3. 使用剪刀和镊子，在颅骨基部抓住皮肤并做一切口。
4. 以第一个切口为起点，沿耳前颅骨两侧剪开，去除皮肤，暴露颅顶骨。
5. 从鼻梁处握住头部，沿人字缝剪开颅顶骨。沿顶骨的侧缘剪切，并向前延伸至额部。
6. 将颅顶骨与下方脑组织分离。
   注意：为确保获得干净且软组织残留最少的骨性颅顶骨，切勿深入骨组织内部；作为参考，应能观察到剪刀在骨片下方形成的阴影。
7. 将颅顶骨转移至磷酸盐缓冲液（PBS，整个实验过程中pH保持7.4）。确保其凹面朝上。

2. 新生小鼠颅盖骨的分级分离

1. 将最多5个颅盖骨转移至含有5 mL 2 mg/mL胶原酶溶液的50 mL锥形管中。使用使用前新鲜配制的胶原酶溶液。
   1. 配制新鲜胶原酶溶液时，将胶原酶粉末加入分离缓冲液（70 mM NaCl、10 mM NaHCO₃、60 mM山梨醇、3 ....

结果

本实验方案的目的是通过使用胶原酶降解胶原基质、EDTA螯合钙离子的分步分离方法，从dmp1-topaz新生小鼠颅骨中获取原代骨细胞培养物，随后对细胞进行FACS制备，以将骨细胞与其他细胞群体分离。

从新生小鼠颅骨中分离原代骨细胞的方法通常描述使用第1至第8组分进行分选²³。为了检验该方法的效率，我们比较了从一只dmp1-topaz小鼠颅骨中获得的骨细胞产量，起始材料涵盖第1至第8组分。将第1至第8组分分别分选，以确定每个组分中骨细胞的比例和产量。分选后，我们将骨细胞在96孔板上培养24小时，以比较接种细胞的密度。结果显示，第2至第5组分中的骨细胞密度高于第1组分，而第6、7和8组分中的骨细胞密度显著下降（图1A）。

尽管在所有组分中获得的骨细胞比例在统计学上无显著差异（图1B），但骨细胞的密度存在显著差异。研究人员²⁰

讨论

首个分离出的骨细胞来自鸡颅骨⁷，通过使用（OB7.3）或禽类PHEX变体进行分离；然而，该方法受限于可用的有效抗体，因为必须制备既特异于骨细胞又具有物种特异性的抗体。研究人员采用了一种不同的序贯酶消化法改良方案，从小鼠和大鼠的长骨中获取骨细胞；据报道，这些培养物的纯度约为70%⁹。Cre小鼠模型的发展使得能够对骨细胞进行基因工程改造，使其在表面表达绿色荧光蛋白（GFP）。结合FACS技术，该小鼠模型被用于获得高纯度的原代骨细胞培养物²⁰。

我们省略了第1组分以及第6‒8组分的使用，因为在这些组分中仅有少量骨细胞被分离出来。采用第2‒5组分可在最短的处理时间内获得最佳的骨细胞得率；这缩短了骨细胞的操作时间，并有助于防止细胞在分步分离过程中因受到应激而发生死亡或细胞信号通路的潜在改变。我们还在分选前将骨细胞培养24小时，这一默认步骤可在分选制备过程中排除不贴壁的悬浮细胞（造血细胞）。这可最大程度地减少表达GFP

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD FACSDiva 软件	BD Biosciences		数据采集与分析
BD Falcon 管	BD Biosciences	352235	12 x 75 mm 带细胞滤网帽的试管，35 μm 尼龙滤网。
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich, MO, USA
胶原酶	Wako, Osaka, Japan	034-22363	0.2% (w/v)，来源于 C. histolyticum 的粗制胶原酶混合物。
EDTA	Dojindo, Kumamoto, Japan		用含 0.1% BSA 的溶液配制 5 mM EDTA
FACSAriaTM II	BD Biosciences
胎牛血清（FBS）	Biowest, Nuaillé, France
分离缓冲液			70 mM NaCl, 10 mM NaHCO, 60 mM 山梨醇, 3 mM K2HPO4, 1 mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) 葡萄糖和 25 mM HEPES
Millex 无菌滤器	Merck Millipore, Ireland	SLGV033RS	0.22μm
尼龙细胞滤网	FALCON, NY, USA		40μm
胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies, NY, USA		0.5% x10，用 PBS 稀释至 x1
α-MEM	Wako, Osaka, Japan		含 10% 胎牛血清、100 IU/ml 青霉素 G 和 100 μg/ml 链霉素