通过表达GFP的成骨细胞小鼠颅骨分离法获取原代骨细胞

摘要

本方案描述了新生dmp1-topaz小鼠颅骨的解剖，以及通过细胞消化和分级分离方法获取表达绿色荧光蛋白的骨细胞，并制备用于荧光激活细胞分选（FACS）的骨细胞。

摘要

骨细胞曾被认为只是骨骼中一种被动存在的细胞，其功能仅限于在幕后感知机械负荷；如今，骨细胞已被推至研究前沿，被证实具有多种重要功能，例如主动修饰细胞外基质，并通过包裹其自身的陷窝-小管系统形成一个内分泌器官，向远端部位传递信号。得益于一系列研究方法的发展，从原代骨细胞的分离到类骨细胞系的建立，使得体外研究骨细胞成为可能，目前人们对骨细胞的兴趣显著增加，关于其结构与功能的知识也迅速积累。然而，骨细胞生物学及其与其他分子组分相互作用的诸多方面仍有待揭示。在本实验方案中，我们详细描述了一种高效分离原代骨细胞的方法：利用表达绿色荧光蛋白的dmp1-topaz新生小鼠颅骨骨细胞，通过细胞分馏结合荧光激活细胞分选技术（FACS）获得原代骨细胞培养物。

引言

骨细胞是由成骨前体细胞终末分化而来并包埋于其分泌基质中的细胞¹。在骨细胞群体中，骨细胞数量最多且寿命最长。它们位于骨陷窝内，具有典型的星状形态，其树突通过称为骨小管的通道延伸，与周围环境及骨表面形成广泛的通讯和代谢交换网络²。骨细胞协调成骨细胞和破骨细胞在骨重建中的作用，是主要的机械感受细胞，介导骨骼对机械负荷的适应性反应³，参与磷酸盐稳态⁴和骨基质矿化过程⁵，并与陷窝-小管系统共同作为内分泌器官向远端组织传递信号⁶。

骨细胞位于矿化的基质中，这种环境限制了其可及性，使得分离过程具有挑战性，从而阻碍了体外研究。最早描述的分离方法之一是利用骨细胞特异性的单克隆抗体（OB7.3）⁷从鸡颅骨中分离骨细胞，该抗体后来被确认为PHEX（X染色体上与内肽酶同源的磷酸盐调节基因）的禽类变体⁸。其他研究人员采用连续消化大鼠⁹或小鼠¹⁰长骨的方法，获得富含骨细胞的组分，据报道其中骨细胞纯度约为70%⁹。该方法的局限性包括培养物纯度不够理想，存在除骨细胞外的其他细胞类型污染，以及由于骨细胞已丧失分裂能力，在培养过程中可能被其他增殖能力强的细胞过度生长而取代。这些挑战限制了长期培养体系的应用。

为了克服这些局限性，研究人员开发了不同的骨细胞系。其中，MLO-Y4细胞系¹¹和MLO-A5细胞系¹²是目前研究最为广泛的细胞系，适用于早期骨细胞阶段的研究；然而，由于它们表达的硬化素（sclerostin）和FGF23水平较低——而这两种分子均为成熟骨细胞的标志物——因此在研究成熟骨细胞信号传导方面作用有限¹³。其他一些细胞系，如IDG-SW3¹⁴和Ocy454¹⁵，能够高水平表达硬化素和FGF23，适用于晚期骨细胞阶段的研究。细胞系作为研究工具具有重要价值，但仍存在局限性，因其无法完全模拟原代细胞的生物学特性。不同的细胞系仅代表骨细胞成熟谱系中的不同发育阶段，且无法反映原代骨细胞的异质性^16,17。

为了获得纯化的原代骨细胞培养物，研究人员利用了Cre小鼠模型，其中8-kb的dmp1启动子用于驱动骨细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达^18,19。Paic等¹⁹建立的双转基因小鼠（pOB-Col 2.3-GFP-cyan和DMP1-GFP-topaz）以及Nakashima等²⁰建立的dmp1-topaz转基因小鼠已被用于获取骨细胞群体。这些研究通过连续消化和荧光激活细胞分选（FACS）分离表达GFP的骨细胞，从而获得原代骨细胞培养物^19,20。在10-kb dmp1报告小鼠Ai9中，Cre的方向可激活tdTomato蛋白，该蛋白在骨细胞、成骨细胞、肌肉以及骨髓内的细胞中均有表达。而8-kb dmp1启动子具有相似的表达模式，但仅有部分成骨细胞和骨髓细胞表达该蛋白，表明8-kb dmp1启动子具有更高的特异性²¹。尽管如此，使用8-kb dmp1启动子所得结果应谨慎解读，并应常规利用骨细胞与成骨细胞特异性标记物进行基因表达谱分析，以确保所获得的细胞群体具有足够高的纯度。

在造血细胞未耗竭与耗竭的骨细胞群体中均检测到破骨细胞标志物OSCAR和Dcstamp，该结果使作者得出结论：通过8-kb dmp1-topaz新生颅骨组织分馏及GFP分选所获得的细胞消化产物中存在造血细胞污染。通过收紧GFP分选门控可减轻造血细胞的污染，因为GFP阳性造血细胞的GFP荧光强度明显低于GFP阳性间充质细胞（骨细胞）²²。

体外研究骨细胞的方法为近年来骨细胞生物学领域的丰富信息积累做出了贡献。然而，骨细胞的分离仍然是一项劳动密集且耗时较长的操作，细胞得率较低。目前常用的骨组织消化方法是使用胶原酶和EDTA，通常需进行至第8次分离组分²³，整个过程持续数小时，对骨细胞的活力造成一定影响。已有研究报道使用第2至第5组分进行细胞分选²⁰，并证实与成骨细胞相比，骨细胞相关基因的表达谱分析结果可验证纯化骨细胞群体分离的成功²⁰。本文描述了获取第2至第5组分的具体流程，并对从第1至第8组分中各组分的骨细胞得率进行比较，以评估每组分中骨细胞的回收情况。此外，本文还介绍了新生dmp1-topaz小鼠颅盖骨的解剖、颅盖骨的胶原酶和乙二胺四乙酸（EDTA）消化处理，以及用于流式细胞分选（FACS）的细胞制备方法。

方案

所有动物实验操作和动物护理均按照东北大学的规定和要求进行。

1. 新生 dmp1-topaz 小鼠颅盖骨的解剖

1. 本实验方案使用出生6‒7天的C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J小鼠幼崽。通过吸入5%异氟烷处死小鼠，随后将幼崽转移至70%乙醇中。
2. 将已处死的幼崽转移至未经处理的培养皿中。
3. 使用剪刀和镊子，在颅骨基部抓住皮肤并做一切口。
4. 以第一个切口为起点，沿耳前颅骨两侧剪开，去除皮肤，暴露颅顶骨。
5. 从鼻梁处握住头部，沿人字缝剪开颅顶骨。沿顶骨的侧缘剪切，并向前延伸至额部。
6. 将颅顶骨与下方脑组织分离。
   注意：为确保获得干净且软组织残留最少的骨性颅顶骨，切勿深入骨组织内部；作为参考，应能观察到剪刀在骨片下方形成的阴影。
7. 将颅顶骨转移至磷酸盐缓冲液（PBS，整个实验过程中pH保持7.4）。确保其凹面朝上。

2. 新生小鼠颅盖骨的分级分离

1. 将最多5个颅盖骨转移至含有5 mL 2 mg/mL胶原酶溶液的50 mL锥形管中。使用使用前新鲜配制的胶原酶溶液。
   1. 配制新鲜胶原酶溶液时，将胶原酶粉末加入分离缓冲液（70 mM NaCl、10 mM NaHCO₃、60 mM山梨醇、3 mM K₂HPO₄、1 mM CaCl₂、1 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）、5 mg/mL葡萄糖和25 mM HEPES）中，使其终浓度为2 mg/mL，并在磁力搅拌器上溶解胶原酶粉末。
   2. 将胶原酶溶液通过0.22 μm无菌滤器过滤至50 mL离心管中，并在整个操作过程中置于冰上保存。
2. 将颅盖骨在37 °C、300 rpm振荡条件下孵育20分钟，以获得第1组分。
3. 弃去第1组分的消化液，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤颅盖骨，然后弃去洗涤液。
4. 将颅盖骨在5 mL含1 mg/mL BSA的5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）PBS溶液（pH 7.4）中，于37 °C、300 rpm振荡条件下孵育15分钟。
5. 将消化液收集至50 mL锥形管中。用5 mL PBS洗涤颅盖骨，并将洗涤液加入消化液中。
   注意：每次收集消化液和洗涤时，均应使用移液器反复吹打骨组织及其溶液，以使细胞从骨组织上脱落，并防止细胞双联体和细胞聚集体形成。
6. 为获得第2组分，将消化液在4 °C下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于8 mL α-最低必需培养基（MEM）中，该培养基含有10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素G和100 μg/mL链霉素。接种至10 cm培养皿中。将第2组分在37 °C、5% CO₂条件下孵育。
7. 将颅盖骨在5 mL胶原酶溶液中，于37 °C、300 rpm振荡条件下孵育20分钟。
8. 为收集第3组分，重复步骤2.5–2.6。将第3组分在37 °C、5% CO₂条件下孵育。
   注意：此时骨组织会变小并碎裂成片段。为防止骨碎片意外被吸入消化液中导致细胞损失，收集消化液时应使用小头移液器（1000–200 μL枪头）。
9. 将颅盖骨在5 mL胶原酶溶液中，于37 °C、300 rpm振荡条件下孵育20分钟。
10. 为收集第4组分，重复步骤2.5–2.6。将第4组分在37 °C、5% CO₂条件下孵育。
11. 将颅盖骨在5 mL含1 mg/mL BSA的5 mM EDTA PBS溶液（pH 7.4）中，于37 °C、300 rpm振荡条件下孵育15分钟。
12. 为收集第5组分，重复步骤2.5–2.6。将第5组分在37 °C、5% CO₂条件下孵育。骨细胞可在当天进行分选，或在分选前培养最多24小时。

3. 荧光激活细胞分选用骨细胞的制备

1. 吸弃每种细胞组分的培养基，并用 10 mL PBS 轻柔洗涤两次。
2. 加入 5 mL 含 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 的 PBS，于 37 °C 孵育 5 分钟。加入 5 mL 含 10% FBS 的 α-MEM，用移液器轻柔吹打使细胞脱落。通过 40 μm 细胞筛过滤，将各组分的细胞收集至 50 mL 圆锥形离心管中。
3. 用 10 mL PBS 洗涤细胞，并通过 40 μm 细胞筛过滤收集至 50 mL 圆锥形离心管中。在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。
4. 吸弃上清液，向细胞沉淀中加入含 10% FBS 的 α-MEM。将细胞浓度调整至约 1 × 10⁷ 个细胞/mL。
5. 将细胞通过带盖的 35 μm 尼龙滤网管过滤。此时细胞已准备好进行流式细胞分选（FACS）。
6. 本实验方案使用 100 μm 喷嘴。收集液应为含 10% FBS 的 α-MEM。分选过程中，尽可能将待分选样品保持在振荡状态并置于 4 °C 环境中。
7. 分选前，通过调节侧向散射（SSC）面积和前向散射（FSC）面积优化门控以去除杂质和非目标细胞。通过调节 SSC-宽度 vs SSC-高度以及 FSC-面积 vs FSC-宽度排除双联体。应使用 GFP 阴性的骨细胞作为对照，以调整分选仪器的参数。
8. 细胞收集完成后，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟。用 PBS 洗涤细胞，再在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。
9. 重新悬浮细胞，并使用含 10% FBS 的 α-MEM 将细胞数量调整至所需浓度。

结果

本实验方案的目的是通过使用胶原酶降解胶原基质、EDTA螯合钙离子的分步分离方法，从dmp1-topaz新生小鼠颅骨中获取原代骨细胞培养物，随后对细胞进行FACS制备，以将骨细胞与其他细胞群体分离。

从新生小鼠颅骨中分离原代骨细胞的方法通常描述使用第1至第8组分进行分选²³。为了检验该方法的效率，我们比较了从一只dmp1-topaz小鼠颅骨中获得的骨细胞产量，起始材料涵盖第1至第8组分。将第1至第8组分分别分选，以确定每个组分中骨细胞的比例和产量。分选后，我们将骨细胞在96孔板上培养24小时，以比较接种细胞的密度。结果显示，第2至第5组分中的骨细胞密度高于第1组分，而第6、7和8组分中的骨细胞密度显著下降（图1A）。

尽管在所有组分中获得的骨细胞比例在统计学上无显著差异（图1B），但骨细胞的密度存在显著差异。研究人员²⁰

讨论

首个分离出的骨细胞来自鸡颅骨⁷，通过使用（OB7.3）或禽类PHEX变体进行分离；然而，该方法受限于可用的有效抗体，因为必须制备既特异于骨细胞又具有物种特异性的抗体。研究人员采用了一种不同的序贯酶消化法改良方案，从小鼠和大鼠的长骨中获取骨细胞；据报道，这些培养物的纯度约为70%⁹。Cre小鼠模型的发展使得能够对骨细胞进行基因工程改造，使其在表面表达绿色荧光蛋白（GFP）。结合FACS技术，该小鼠模型被用于获得高纯度的原代骨细胞培养物²⁰。

我们省略了第1组分以及第6‒8组分的使用，因为在这些组分中仅有少量骨细胞被分离出来。采用第2‒5组分可在最短的处理时间内获得最佳的骨细胞得率；这缩短了骨细胞的操作时间，并有助于防止细胞在分步分离过程中因受到应激而发生死亡或细胞信号通路的潜在改变。我们还在分选前将骨细胞培养24小时，这一默认步骤可在分选制备过程中排除不贴壁的悬浮细胞（造血细胞）。这可最大程度地减少表达GFP

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD FACSDiva 软件	BD Biosciences		数据采集与分析
BD Falcon 管	BD Biosciences	352235	12 x 75 mm 带细胞滤网帽的试管，35 μm 尼龙滤网。
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich, MO, USA
胶原酶	Wako, Osaka, Japan	034-22363	0.2% (w/v)，来源于 C. histolyticum 的粗制胶原酶混合物。
EDTA	Dojindo, Kumamoto, Japan		用含 0.1% BSA 的溶液配制 5 mM EDTA
FACSAriaTM II	BD Biosciences
胎牛血清（FBS）	Biowest, Nuaillé, France
分离缓冲液			70 mM NaCl, 10 mM NaHCO, 60 mM 山梨醇, 3 mM K2HPO4, 1 mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) 葡萄糖和 25 mM HEPES
Millex 无菌滤器	Merck Millipore, Ireland	SLGV033RS	0.22μm
尼龙细胞滤网	FALCON, NY, USA		40μm
胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies, NY, USA		0.5% x10，用 PBS 稀释至 x1
α-MEM	Wako, Osaka, Japan		含 10% 胎牛血清、100 IU/ml 青霉素 G 和 100 μg/ml 链霉素