本文介绍了一种植物组织激光显微切割（LCM）的实验方案。LCM是一种用于无污染地分离特定组织区域的显微技术。该操作流程包括组织固定、石蜡包埋、切片、激光显微切割以及RNA提取。所获得的RNA可用于后续组织特异性、时间分辨的转录组分析。
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本文内容
摘要
摘要
复杂多细胞生物体的发育由具有不同转录谱的特定细胞类型所调控。为了鉴定调控发育过程的转录调控网络，有必要测量这些单个细胞类型在空间和时间上的基因表达谱。因此，深入了解基因表达的时空控制对于理解生物和发育过程的调控机制至关重要。本文介绍了一种激光捕获显微切割（LCM）方法，用于在萌发过程中不同时间点从大麦胚的三个器官中分离少量细胞，并进行转录谱分析。该方法包括组织固定、组织处理、石蜡包埋、切片、激光捕获显微切割以及RNA提取，随后进行实时PCR或RNA测序（RNA-seq）。该方法使我们能够从不同数量的细胞（数十至数百个）中获得种子器官转录组的时空表达谱，其组织特异性显著高于常规的整体组织分析。基于这些数据，我们得以定义并比较不同组织的转录调控网络，并预测各组织中潜在的调控性转录因子。该方法经过极少优化后应可适用于其他植物组织。
引言
植物的发育和生长涉及存在于复杂细胞环境中的不同细胞内转录调控网络的协同作用。为了理解这些调控网络的活性，我们需要了解在不同发育阶段多种细胞类型中基因表达的空间和时间特异性。然而，由于分离和分析少量细胞存在技术上的挑战，基因表达分析通常在完整器官或大量组织样本中进行。本文所述方法通过将激光显微切割（LCM）与RNA测序（RNA-seq）相结合，实现了对特定组织在空间和时间上的转录组分析。
激光显微切割技术（LCM）由 Emmert-Buck 及其同事在二十年前开发1。该技术使研究人员能够通过显微镜直接观察并利用窄束激光进行操作，从而精确地从组织环境中分离单个细胞或细胞簇1。自那时以来，该方法已广泛应用于癌症生物学和病理学研究2,3。许多植物研究团队也已将 LCM 技术应用于不同植物物种和不同组织类型的研究中4,5,6,7,8,
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方案
由于最终产物是RNA，操作时需注意避免RNase污染。必须佩戴手套。使用经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水、缓冲液等。缓冲液需高压灭菌，玻璃器皿使用前应进行干烤。
1. 组织固定
- 根据物种和组织类型选择合适的固定液；对于大麦种子，使用 Farmer 固定液（75% 乙醇，25% 冰醋酸（v/v））。
- 在采集组织前，将固定液置于冰上预冷。
- 采集目标植物材料，如有需要，将其切割成适合放入所选包埋模具的大小。对于大麦种子，沿纵轴将种子切成两半，以促进固定液渗透并适配包埋模具。
- 将组织浸入至少 10 倍体积的冰冻固定液中。对于大麦种子，将切开的半粒种子浸入固定液中。
- 使用真空渗透法加速固定液的渗透。固定液经真空渗透后，组织应完全沉降。对于大麦种子，进行 30 分钟的真空渗透。
- 更换固定液，并在 4 °C 下孵育，使固定液充分渗透组织。对于大麦种子，将样品孵育过夜（约 12–16 小时）。
注意：由于固定液在较薄或较小组织中的扩散速率更高，所需固定时间更短。 - 从固定液中取出组织，转移至组织包埋盒中，随后开始组织处理流程。
注意：对于较小或脆弱的组织（如叶片组织），可在固定过程中将其放入包埋盒内，以避免损伤。在组织固定和组织处理过程中，可使用活检袋、垫片或包裹材料将组织牢固固定在包埋盒内。
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结果
我们利用激光显微切割结合RNA测序（LCM RNA-seq）技术，对大麦种子在萌发过程中不同时间和组织特异性的转录组进行了分析10。该研究在种子萌发的48小时时间序列（0–48小时，共7个时间点）中，每隔8小时对胚的三个器官（胚芽、胚根尖端和盾片）的少量细胞进行LCM RNA-seq分析（图2A,B）。
图 2：通过激光显微切割（LCM）从大麦种子中收集的细胞。（A）大麦种子的纵切面图，插图为放大示意图，显.......
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讨论
许多组织特异性的基因表达研究受限于手工解剖样本，这种方法耗时耗力，污染风险高，且只能利用人类操作者能够灵巧获取的样本。激光显微切割（LCM）是一种精确且非接触的技术，可在显微镜下通过机械控制的激光束从固定组织切片中收集细胞。
良好的样品制备对于激光显微切割（LCM）至关重要。该过程依赖于样品的适当固定和包埋，以在组织形态学与RNA完整性之间保持良好平衡。本文提供的方案针对大麦种子优化了固定和包埋步骤，包括延长固定时间以及固定剂的真空渗透。不同组织或物种的分析需要对条件进行优化，因为这些条件通常因组织而异。本方案的另一个重要环节是RNA扩增步骤，可确保生成足量的RNA用于RNA-seq文库构建。我们发现，RNA扩增能够产生高质量的文库，但也可选用低起始量RNA的文库制备方法25。靶细胞的组织学鉴定是本方法中的关键步骤，对于稀有或特征不明确的细胞类型可能带来挑战。可通过在预处理步骤中使用传统组织学染色或免疫荧光染色，或使用表达荧光标记的细胞特异性标志物的转基因品系，来提高靶细胞的识别效率26.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得了澳大利亚研究理事会植物能量生物学卓越中心（CE140100008）对JW的资助。M.G.L.获得了拉筹伯大学启动基金的支持。我们感谢拉筹伯基因组学平台在高通量测序和数据分析方面提供的支持。我们感谢副高级研究员Matthew Tucker博士在本实验室建立激光显微切割技术（LCM）过程中提供的专业指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR（BioStrategies） | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 不透光型 | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| 透明底模 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| 高灵敏度 RNA ScreenTape | 安捷伦 | 5067-5579 | |
| 低profile disp. blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒 | Ambion（ThermoFisher） | AMB17515 | |
| 柱上DNase I消化试剂盒 | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen（整合科学） | 7102-08 | |
| 石蜡（Surgipath Paraplast） | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA 提取试剂盒 | ABI（ThermoFisher） | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase 去污染溶液 | Ambion（ThermoFisher） | AM9780 | |
| 二甲苯 | AnalaR NORMAPUR（BioStrategies） | VWRC28975.360 | |
| Leica 台式组织处理机 | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica 加热型石蜡包埋模块 | 徕卡生物系统公司 | EG1150H | |
| Leica 冷却板 | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate 2级生物安全柜 | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica 全自动轮转式切片机 | Leica Biosystems | RM2265 | 使用 PALMRobo v 4.6 软件 |
| 蔡司PALM显微切割系统 | 蔡司显微镜 | ||
| TapeStation | 安捷伦 | TapeStation 2200 |
参考文献
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20
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重印与许可
