激光捕获显微切割结合RNA测序用于植物时空特异性组织基因表达分析

摘要

本文介绍了一种植物组织激光显微切割（LCM）的实验方案。LCM是一种用于无污染地分离特定组织区域的显微技术。该操作流程包括组织固定、石蜡包埋、切片、激光显微切割以及RNA提取。所获得的RNA可用于后续组织特异性、时间分辨的转录组分析。

摘要

复杂多细胞生物体的发育由具有不同转录谱的特定细胞类型所调控。为了鉴定调控发育过程的转录调控网络，有必要测量这些单个细胞类型在空间和时间上的基因表达谱。因此，深入了解基因表达的时空控制对于理解生物和发育过程的调控机制至关重要。本文介绍了一种激光捕获显微切割（LCM）方法，用于在萌发过程中不同时间点从大麦胚的三个器官中分离少量细胞，并进行转录谱分析。该方法包括组织固定、组织处理、石蜡包埋、切片、激光捕获显微切割以及RNA提取，随后进行实时PCR或RNA测序（RNA-seq）。该方法使我们能够从不同数量的细胞（数十至数百个）中获得种子器官转录组的时空表达谱，其组织特异性显著高于常规的整体组织分析。基于这些数据，我们得以定义并比较不同组织的转录调控网络，并预测各组织中潜在的调控性转录因子。该方法经过极少优化后应可适用于其他植物组织。

引言

植物的发育和生长涉及存在于复杂细胞环境中的不同细胞内转录调控网络的协同作用。为了理解这些调控网络的活性，我们需要了解在发育阶段中不同细胞类型内基因表达的空间和时间特异性。然而，由于分离和分析少量细胞在技术上具有挑战性，基因表达的分析通常在整体器官或大量组织样本中进行。本文所述方法通过将激光显微切割（LCM）与RNA测序（RNA-seq）相结合，实现了对特定组织在空间和时间上的转录组分析。

激光显微切割技术（LCM）由 Emmert-Buck 及其同事在二十年前开发¹。该技术使研究人员能够通过显微镜直接观察，并利用窄束激光对来自其原始环境的单个细胞或细胞簇进行精确分离¹。自那时以来，该方法已广泛应用于癌症生物学和病理学研究^2,3。许多植物研究团队也已将 LCM 技术应用于不同植物物种和不同组织类型的研究中^{4,5,6,7,8,9,10,11}。最近，多篇研究论文还利用 LCM 对双子叶和单子叶植物种子进行分析，以研究种子发育和萌发过程中的胚、胚乳及其他种子结构^10,12,13。目前其他常用的单细胞分离方法，如微量移液、细胞分选、磁性分离和微流控平台，通常依赖酶解或机械均质化来解离细胞，这可能干扰基因表达，引入技术性假象，从而影响数据解读^14,15。这些方法还需要事先了解每种细胞类型的标记基因，以便将解离后的细胞与其原始空间位置及真实细胞类型相对应。另一类技术则依赖于亚细胞结构的亲和性分离而非完整细胞，例如 INTACT（细胞类型特异性标记核分离）和 TRAP（翻译核糖体亲和纯化）^16,17。然而，在缺乏成熟遗传转化体系的植物物种中，对细胞核或核糖体进行亲和标记和纯化在技术上具有挑战性。LCM 则利用快速组织固定来保持转录本水平，并结合传统组织学方法，通过直接观察细胞在其正常组织/器官环境中的形态特征进行识别，从而可在短时间内实现特定细胞的分离^18,19。

本文介绍了一种优化的实验方案，用于从小麦类谷物种子的组织切片中分离特定细胞或细胞类型，该方法可适用于大多数可通过组织学鉴定的细胞。激光显微切割（LCM）提供了一种非接触式的细胞分离方法，显著降低了污染风险，并提高了所提取RNA的完整性。此外，该方法展示了LCM技术在以少量生物材料起始的大规模全基因组研究中的强大能力。我们还描述了RNA的线性扩增方法，以获得足够的起始材料用于后续的转录本/转录组分析。

本LCM RNA-seq方案共包含十个主要步骤，用于获取时空特异性的组织转录组，包括组织样本固定、脱水、石蜡浸润、包埋、切片、激光显微切割（LCM）、RNA提取、RNA扩增、RNA定量以及qRT-PCR和/或RNA测序（图1）。

图1：激光显微切割（LCM）后接RNA-seq或qRT-PCR的流程图。激光显微切割（LCM）是一种空间定位精确且非接触的技术，可在显微镜下利用激光束从固定组织切片中收集特定细胞。该过程首先对组织样本进行固定，随后使用梯度浓度的乙醇和二甲苯进行脱水，最后完成石蜡浸润。此过程可通过组织处理仪实现完全自动化。当组织完成石蜡浸润后，使用包埋仪将其置于熔融石蜡的模具中进行包埋。使用切片机将包埋块切成所需厚度的切片。制备载玻片后，立即进行激光显微切割，以便随后从捕获的细胞中提取RNA。RNA提取后，需直接进行两轮RNA扩增，然后用于qRT-PCR和/或RNA-seq分析。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

由于最终产物是RNA，操作时需注意避免RNase污染。必须佩戴手套。使用经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水、缓冲液等。缓冲液需高压灭菌，玻璃器皿使用前应进行干烤。

1. 组织固定

1. 根据物种和组织类型选择合适的固定液；对于大麦种子，使用 Farmer 固定液（75% 乙醇，25% 冰醋酸（v/v））。
2. 在采集组织前，将固定液置于冰上预冷。
3. 采集目标植物材料，如有需要，将其切割成适合放入所选包埋模具的大小。对于大麦种子，沿纵轴将种子切成两半，以促进固定液渗透并适配包埋模具。
4. 将组织浸入至少 10 倍体积的冰冻固定液中。对于大麦种子，将切开的半粒种子浸入固定液中。
5. 使用真空渗透法加速固定液的渗透。固定液经真空渗透后，组织应完全沉降。对于大麦种子，进行 30 分钟的真空渗透。
6. 更换固定液，并在 4 °C 下孵育，使固定液充分渗透组织。对于大麦种子，将样品孵育过夜（约 12–16 小时）。
   注意：由于固定液在较薄或较小组织中的扩散速率更高，所需固定时间更短。
7. 从固定液中取出组织，转移至组织包埋盒中，随后开始组织处理流程。
   注意：对于较小或脆弱的组织（如叶片组织），可在固定过程中将其放入包埋盒内，以避免损伤。在组织固定和组织处理过程中，可使用活检袋、垫片或包裹材料将组织牢固固定在包埋盒内。

2. 组织处理

1. 在步骤2中使用自动组织处理机，该处理机至少应配备10个溶液室和2个加热石蜡室（参见材料表）。
2. 检查每个室中的溶液是否充足；每使用组织处理机数次后，应更换各室中的溶液。
3. 将含有组织的包埋盒放入金属篮中。将金属篮固定在第1室上方的支架上。支架会旋转，按照预设程序将包埋盒依次浸入各室中进行“浸入与提起”操作。
4. 通过点击组织处理机控制面板上的按钮来设置程序，设定每个室的处理时间。
5. 按下“开始”按钮以启动处理程序。以下程序专为大麦种子设计，运行过夜（约18小时）：
   1. 进行脱水处理：将包埋盒依次浸入梯度乙醇溶液中，每种浓度处理1小时30分钟（75%、85%、100%、100%和100%（v/v）乙醇）。
   2. 进行透明处理：使用乙醇-二甲苯梯度溶液，每种比例处理1小时30分钟（75:25、50:50、25:75（乙醇:二甲苯%，v/v）），随后将包埋盒分别浸入100%二甲苯中两次，每次1小时30分钟。
   3. 在55–60 °C条件下，将包埋盒浸入熔融石蜡中两次，每次1小时30分钟，以完成石蜡浸透。
      注：石蜡加热室的温度可在组织处理机背面进行设定。
6. 次日早晨，从组织处理机中取出包埋盒，进行石蜡包埋。
   注：不同组织类型的程序时间可能有所不同。在组织处理过程中，可通过按下控制面板上的“V”和/或“振荡”按钮，启用真空和/或振荡功能，以加速特定溶液的浸透过程。

3. 石蜡包埋

1. 此步骤使用包埋机（参见材料表）。
2. 包埋前至少提前数小时启动包埋机，以确保储液槽中的石蜡完全熔化。
3. 开始操作前，提前开启冷台。
4. 用精细镊子固定样品位置，将熔融石蜡注入模具中进行包埋。根据不同的实验目的确保样品的正确方向。对于大麦种子，应将其沿切割方向纵向放置，以获得纵切面。
   注意：包埋模具具有不同尺寸，应选择合适大小的模具，以确保样品能够正确放置和包埋。样品的方向应根据实验需求进行调整。若需制备纵切面，样品应沿切割方向纵向排列；若需横切面，则样品应与切割方向平行放置。
5. 将干净的包埋盒置于模具上，并加入足量石蜡，确保完全覆盖整个包埋盒，使样品牢固附着于包埋盒上。
6. 将模具置于冷台上，待石蜡完全凝固（10–20 分钟）后，再将蜡块从模具中取出。
7. 继续进行切片操作，或将蜡块转移至 4 °C 保存。
   注意：本方案可在此处暂停。包埋后的蜡块可在 4 °C 下保存长达三个月。

4. 聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜玻片的制备

1. 将PEN膜载玻片浸入RNase去活化溶液中3秒，随后用DEPC处理的水短暂清洗两次，以去除载玻片上的RNase。将载玻片置于37 °C培养箱中干燥，以除去残留溶液。
2. 在超净工作台中使用紫外灯对载玻片进行30分钟的紫外处理，以增强其亲水性，从而改善石蜡的黏附性。

5. 切片

1. 在切片步骤中使用切片机（参见 材料表）。
2. 将新刀片装入刀架中，并在不进行切片操作时始终竖起刀片防护罩。
   警告：切片机刀片极为锋利，操作不当可能造成严重伤害。
   注意：切片机上有两个锁定装置，一个位于机器侧面，另一个位于手轮手柄处。在不进行切片操作时，必须同时启用这两个锁定装置。
3. 调整刀座，使其尽可能靠近样品但不接触。确保切片机臂永远不会完全接触到刀座，否则将对切片机造成严重的结构损坏。
4. 在开始前打开冷台。切片前将石蜡包埋块置于冷台上，并在切片过程中必要时重新冷却包埋块，以防止包埋块软化。
5. 在开始前用水浴锅盛装经DEPC处理的水，并加热至42 °C。
6. 修块至目标深度（即所需切片的位置），然后使用切片机以设定厚度（6–10 µm）对石蜡包埋块进行切片；切片良好的包埋块会在刀片边缘形成“带状”切片。对于大麦种子，采用8 µm厚度进行切片。
7. 使用细毛笔或精细镊子，小心地将带状切片从切片机转移至水浴中，确保切片平展地漂浮在水面上。
8. 以45°角持载玻片，通过向上移动的方式将带状切片从水中提起并贴附到载玻片上，并用无绒纸巾小心吸除多余水分。
9. 在37 °C下干燥载玻片30分钟，以彻底去除石蜡下方残留的水分。
10. 脱蜡后立即进行后续操作，或将载玻片置于4 °C密闭容器内并在干燥条件下保存（数天内使用）。
11. 通过以下步骤去除石蜡：将载玻片在二甲苯中洗涤3次，每次20秒；随后在100% (v/v) 乙醇中洗涤2次，每次30秒；再在70% (v/v) 乙醇中洗涤2次，每次30秒。
12. 脱蜡后应立即进行激光显微切割。
    注意：冷冻切片是一种可成功与激光显微切割联用的替代方法。冷冻切片的样品制备步骤将有所不同。

6. 激光捕获显微切割

1. 使用激光捕获显微切割显微镜（参见材料表）对脱蜡并干燥的组织切片中的细胞进行显微切割。
2. 将载玻片放入三个可用的插槽中。 
3. 使用收集管的特殊粘附帽来收集捕获的样本。在无液体条件下（“干”收集）进行捕获可最大限度地减少RNase活性。将收集管装入可用的插槽中。
4. 移动载物台以定位需要切割的样本区域。此操作可通过LCM仪器的鼠标、操纵杆或键盘上的方向键完成。
5. 为优化切割速度、切割能量和聚焦，以及激光压力弹射（LPC）能量和聚焦，首先在膜载玻片上无组织的空白区域进行试切。以大麦种子为例，在10倍放大倍数下，切割速度 = 18，CutEnergy = 52，CutFocus = 63，LPCEnergy = 78，LPC focus = 61。
   注意：切割聚焦和能量需根据不同载玻片、不同组织类型及捕获区域进行调整，但一般原则是弹射功率高于切割功率，且激光在弹射时需散焦。物镜放大倍数越高，激光聚焦点越小，能量越高。
6. 使用绘图工具通过勾画目标区域来选择细胞。
7. 从功能工具栏中选择RoboLPC功能，根据上述在空白膜区域试切所优化的参数，将细胞弹射至粘附帽中。
   注意：LCM参数因组织类型、切片厚度、组织硬度及物镜的不同而有所差异。因此，在切割实际样本前，最好先在无组织样本的空白膜区域对每张载玻片进行参数优化。
8. 使用标记工具标记感兴趣区域，以便通过从元素列表中选择相应标记快速定位。
9. 点击“CapCheck”按钮检查粘附帽，确认样本已被成功捕获。通常，每个帽需收集10–15个切片（约200个细胞）方可用于RNA提取。
10. 将捕获的样本置于冰上，并立即进行RNA提取，以避免RNA降解。
    注意：部分LCM显微镜配备荧光光源，可用于捕获带有荧光标记的细胞。

7. RNA 提取

1. 在激光显微切割（LCM）后，使用低输入量RNA提取试剂盒（参见材料表）进行RNA提取。此类试剂盒专为从少于十个细胞中稳定回收高质量的总RNA而设计。
2. 根据制造商说明书，从捕获的细胞类型中提取总RNA，包括柱上DNase处理步骤。
   注意：RNA提取的第一步需颠倒离心管并轻弹管壁，此操作至关重要，可确保附着在管盖上的捕获样本与所加入的裂解缓冲液充分接触。

8. RNA 扩增

1. 使用反义RNA（aRNA）扩增试剂盒 （参见材料表），通过体外转录对提取的RNA进行aRNA扩增，以获得足量的aRNA用于RNA-seq文库构建。
2. 根据试剂盒生产商的说明，使用aRNA扩增试剂盒进行两轮扩增。
   注意：必须将热循环仪及其盖预热至试剂盒（参见 材料表）生产商指定的温度。除RNA扩增外，另一种替代方法是使用低起始量文库制备试剂盒，直接从提取的RNA合成文库。

9. RNA 定量

1. 使用自动化电泳系统对aRNA进行定量和质控（参见材料表）。
   注意：推荐使用自动化电泳系统，因其所需样本量较少（1–2 µL），并可为每个样本提供类似凝胶的图像和电泳图谱。

10. qRT-PCR 和/或 RNA-seq

1. 使用标准RNA-seq文库试剂盒，从aRNA合成cDNA用于qRT-PCR或构建RNA-seq文库。

结果

我们利用激光显微切割结合RNA测序（LCM RNA-seq）技术，对大麦种子在萌发过程中不同时间和组织特异性的转录组进行了空间和时间上的分析¹⁰。该研究在种子萌发的48小时时间序列中（0–48小时，共7个时间点），每隔8小时对胚的三个器官（胚芽、胚根尖端和盾片）中的少量细胞应用LCM RNA-seq技术进行分析（图2A,B）。

图 2：通过激光显微切割（LCM）从大麦种子中收集的细胞。（A）大麦种子的...

讨论

许多组织特异性的基因表达研究受限于手工解剖样本，这种方法耗时耗力，污染风险高，且只能利用人类操作者能够灵巧获取的样本。激光显微切割（LCM）是一种精确且非接触的技术，可在显微镜下通过机械控制的激光束从固定组织切片中收集细胞。

良好的样品制备对于激光显微切割（LCM）至关重要。该过程依赖于样品的适当固定和包埋，以在组织形态学与RNA完整性之间保持良好平衡。本文提供的方案针对大麦种子优化了固定和包埋步骤，包括延长固定时间以及固定剂的真空渗透。不同组织或物种的分析需要对条件进行优化，因为这些条件通常因组织而异。本方案的另一个重要环节是RNA扩增步骤，可确保生成足量的RNA用于RNA-seq文库构建。我们发现，RNA扩增能够产生高质量的文库，但也可选用低起始量RNA的文库制备方法²⁵。靶细胞的组织学鉴定是本方法中的关键步骤，对于稀有或特征不明确的细胞类型可能带来挑战。可通过在预处理步骤中使用传统组织学染色或免疫荧光染色，或使用表达荧光标记的细胞特异性标志物的转基因品系，来提高靶细胞的识别效率²⁶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸 100 % ACS/R.	AnalaR NORMAPUR（BioStrategies）	VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 不透光型	Zeiss	415190-9181-000
透明底模 8 X 10	Leica	3803015
焦碳酸二乙酯	Sigma-Aldrich	40718-25ML
高灵敏度 RNA ScreenTape	安捷伦	5067-5579
低­profile disp. blades DB80LS	Leica	14035843489
MembraneSlide 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000
MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒	Ambion（ThermoFisher）	AMB17515
柱上DNase I消化试剂盒	Sigma-Aldrich	DNASE70
Ovation RNA-Seq System V2	NuGen（整合科学）	7102-08
石蜡（Surgipath Paraplast）	Leica	39601006
PicoPure RNA 提取试剂盒	ABI（ThermoFisher）	KIT0214
RNaseZap RNase 去污染溶液	Ambion（ThermoFisher）	AM9780
二甲苯	AnalaR NORMAPUR（BioStrategies）	VWRC28975.360
Leica 台式组织处理机	Leica Biosystems	TP1020
Leica 加热型石蜡包埋模块	徕卡生物系统公司	EG1150H
Leica 冷却板	Leica Biosystems	EG1150C
Safemate 2级生物安全柜	LAF Technologies Pty Ltd	Safemate 1.5
Leica 全自动轮转式切片机	Leica Biosystems	RM2265	使用 PALMRobo v 4.6 软件
蔡司PALM显微切割系统	蔡司显微镜
TapeStation	安捷伦	TapeStation 2200