激光捕获微分块RNA-测序空间和时间组织特异性基因表达分析

Summary

这里介绍的是植物组织激光捕获微切除（LCM）的协议。LCM 是一种以无污染方式隔离组织区域的微观技术。该过程包括组织固定、石蜡嵌入、分切、LCM和RNA提取。RNA用于下游组织特异性，时间解析的转录组分析。

Abstract

复杂多细胞生物体的发育由具有不同转录特征的不同细胞类型控制。为了确定控制发育过程的转录调控网络，有必要测量这些单个细胞类型的空间和时间基因表达特征。因此，深入了解基因表达的时空控制对于了解生物发育过程如何被调节至关重要。在这里，我们描述了一种激光捕获微分裂（LCM）方法，在发芽过程中从三个大麦胚胎器官中分离出少量细胞，然后进行转录分析。该方法包括组织固定、组织处理、石蜡嵌入、分切、LCM和RNA提取，然后是实时PCR或RNA-seq。这种方法使我们能够从不同数量的细胞（十到数百个）获得种子器官转录组的空间和时间特征，提供比典型的大宗组织分析更大的组织特异性。根据这些数据，我们能够定义和比较转录调控网络，以及预测单个组织的候选调控转录因子。该方法应适用于其他植物组织，优化程度极小。

Introduction

植物的发育和生长涉及存在于复杂细胞环境中的不同细胞内的转录调节网络的协调作用。为了了解这些调控网络的活动，我们需要了解不同细胞类型中不同发育阶段的空间和时间基因表达。然而，由于隔离和分析少量细胞的技术挑战，基因表达分析更常见于整个器官或散装组织样本中。我们在此描述的方法允许通过将 LCM 与 RNA-seq 耦合获得空间和时间组织特异性转录组分析。

LCM是20年前由埃默特-巴克及其同事^1开发的。该技术使研究人员能够使用直接的微观可视化和利用窄束激光1将单个细胞或细胞群从环境中精确^分离。此后，该方法已广泛应用于癌症生物学和病理学^,2、3。2许多植物研究小组还将LCM用于不同的植物种类和不同的组织类型^{4、5、6、7、8、9、10、11。5,6,7,8,9,10,114}最近，几篇论文还利用LCM对欧迪科特和单体种子研究胚胎、内分体和其他种子结构，在种子发育和发芽过程中^{，10、12、13。,1310,}大多数其他常用的单细胞分离方法，如微移液、细胞分选、磁分离和微流体平台，都依赖于酶消化或机械均质来分离细胞。这可能干扰基因表达，引入技术人工制品，混淆数据解释^{14，15。14,}这些方法还要求以前对每种细胞类型的标记基因的了解，以将分离的细胞与其空间位置和真实细胞类型联系起来。另一组技术依赖于基于亲和力的亚细胞结构隔离，而不是整个细胞，例如，INTACT（细胞类型中标记的核分离）和 TRAP（翻译核糖体亲和力纯化^{）16，17,17}。然而，在没有成熟转化协议的植物物种中，核或核糖体的相关性标记和纯化在技术上具有挑战性。LCM利用快速组织固定，以保持转录水平和传统的组织学识别，直接可视化细胞在其正常组织/器官范围内，这允许离散细胞在短时间内^{分离18，19。,19}

此处提出的协议是将特定细胞或细胞类型从谷类种子的组织部分分离的优化方法，可应用于大多数可组织学识别的细胞。LCM提供一种无接触细胞分离方法，大大减少污染，提高回收RNA的完整性。此外，该方法还说明了 LCM 在从少量生物材料开始的大规模基因组广泛研究中的力量。我们还描述了RNA的线性扩增，用于生成足够的输入材料，用于下游转录/转录组分析。

此 LCM RNA-seq 协议中，空间和时间组织特异性转录组有十个主要步骤，包括组织样本固定、脱水、石蜡渗透、嵌入、分切、LCM、RNA 提取、RNA扩增、RNA定量和 qRT-PCR 和/或RNA-seq（图 1）。

图1:LCM的流程图，后跟RNA-seq或qRT-PCR。LCM 是一种空间精确且无接触的技术，利用微显可视化下的激光束从固定组织部分采集细胞。这个过程从固定组织样品开始，然后使用乙醇和二甲苯的梯度系列进行脱水，最后以石蜡渗透完成。通过使用组织处理器，该过程可以完全自动化。一旦组织与石蜡渗透，它就被嵌入一个模子中，使用嵌入站与熔融石蜡一起嵌入。使用设置为所需厚度的微切进行。在从捕获的细胞中提取RNA之前，立即准备幻灯片并进行LCM。RNA提取后，直接进行两轮RNA扩增，然后进行qRT-PCR和/或RNA-seq。 请单击此处查看此图的较大版本。

Protocol

由于最终产品是RNA，注意避免污染使用RNAs的工作。戴手套是必须的。使用二乙基热碳酸盐 （DEPC） 处理的水、缓冲液等。使用前，可以进行自动保存缓冲器和烘焙玻璃器皿。

1. 组织固定

1. 根据物种和组织类型准备选择的固定性;对于大麦种子，使用农民的固定剂（75%乙醇，25%的冰川醋酸（v/v）。。
2. 在收获组织之前，将固定器冷却在冰上。
3. 收集感兴趣的植物材料，如有必要，将其分解成适当大小的碎片，以适合所选的嵌入模具。对于大麦种子，将种子纵向切成半，以帮助渗透固定溶液，并融入嵌入模具。
4. 将组织淹没成至少10倍体积的冰冷固定。对于大麦种子，将种子切成一半，放入固定体中。
5. 使用真空渗透加速固定装置的渗透。固定装置的真空渗入后，组织应下沉。对于大麦种子，使用30分钟的真空渗透。
6. 在4°C下更换固定和孵育，使固定器完全穿透组织。对于大麦种子，孵育样品过夜（+12-16小时）。
   注:由于固定剂扩散率较高，更薄或小的组织需要更短的固定时间。
7. 从固定剂中去除组织，将组织转移到盒式磁带中，然后开始组织处理。
   注:小或易碎的组织，如叶组织，可以放入盒式磁带中固定，以确保在固定过程中不会损坏。活检袋、垫片或包装可用于在组织固定和组织处理步骤期间将组织牢固地固定在盒式磁带内。

2. 组织加工

1. 在步骤 2 中使用自动组织处理器，至少有 10 个溶液室和 2 个加热石蜡室（ 参见材料表）。
2. 检查每个腔室中是否有足够的溶液;每隔几次使用组织处理器后更换溶液。
3. 将带纸巾的盒式磁带放入金属篮中。将金属篮连接到其支架 1 上方的支架上。支架将旋转和"浸"盒到房间，按照指定的程序。
4. 通过对组织处理器的控制面板执行按钮单击来设置程序，这涉及到为每个腔室设置时间长度。
5. 按"开始"按钮启动处理程序。以下程序专为大麦种子设计，并运行过夜 （+18 小时）
   1. 在乙醇梯度系列（75%、85%、100%、100%和100%（v/v）乙醇）中，将盒式磁带浸入1小时30分钟，进行脱水。
   2. 使用乙醇进行清除:在 75:25、50:50、25:75（乙醇:二甲苯%，v/v）各1小时30分钟（乙醇:二甲苯、v/v）进行清除。然后将盒式磁带浸入 1 小时 30 分钟，每盒 100% 二甲苯，然后浸入 100% 二甲苯。
   3. 在55-60°C下进行石蜡渗透，在熔融石蜡中两次进行1小时30分钟。
      注:石蜡加热器室的温度可以设置在组织处理器的背面。
6. 第二天早上，从组织处理器上取下盒式磁带，然后进行石蜡嵌入。
   注:程序时间可能因组织类型而异。真空和/或搅拌可用于组织处理过程中，通过按下组织处理器控制面板上的"V"和/或"搅拌"按钮来加速所选溶液的渗透。

3. 石蜡嵌入

1. 在此步骤中使用嵌入计算机（请参阅 材料表）。
2. 预设嵌入机，在嵌入前至少几个小时打开，以便让储液罐中的石蜡完全熔化。
3. 启动前打开冷盘。
4. 使用细钳将样品保持到位，并将熔融石蜡分配到模具中，将样品嵌入模具中。确保每个实验目的的样品方向正确。对于大麦种子，将种子纵向定向到切割方向，以获得纵向部分。
   注:嵌入模具有不同的尺寸。选择适当的大小，以便正确定位和嵌入样品。应根据实验需要考虑样品的方向。如果需要纵向截面，样品应纵向定位到切削方向，而对于横向截面，样品应平行于切削方向。
5. 将干净的盒式磁带放在模具上，确保有足够的石蜡完全覆盖整个盒式磁带，将样品放在盒式磁带上。
6. 将模具放在冷板上，让石蜡完全设置（10-20 分钟），然后从模具中释放块。
7. 继续分段或将块转移到 4°C 进行存储。
   注意:可以在这里暂停协议。嵌入式块可以在4°C下储存长达三个月。

4. 制备聚乙烯气酸酯（PEN）膜片

1. 将 PEN 膜在 RNase 停用溶液中潜水 3 s，随后在 DEPC 处理的水中进行两次短暂清洗，以去除滑梯上的 RNases。在 37°C 培养箱中干燥幻灯片，以去除左侧溶液。
2. 使用层压流柜中的 UV 灯对幻灯片进行 30 分钟的紫外线处理，以增强亲水性，提高石蜡粘附性。

5. 分段

1. 在剖面步骤中使用微原子（ 参见材料表）。
2. 将新刀片放入刀架中，在不主动切割时始终保持刀护
   注意:微切刀片非常锋利，如果处理不当，可能会造成重大伤害。
   注:微原子上有两个锁定机构，一个在机器的侧面，另一个在车轮的手柄上。两者都是在不积极分段时参与的。
3. 调整刀块以尽可能靠近样品，无需接触。确保微切臂永远不会与刀块完全接触，因为这将对微切管造成灾难性的结构损坏。
4. 启动前打开冷盘。在切块之前，在冷板上保留石蜡块，必要时在切块时重新冷却块，以防止块软化。
5. 在开始之前，将经过 DEPC 处理的水和热量加注到 42°C 的水浴。
6. 使用微原子将块修剪到所需深度（您感兴趣的部分）和节段石蜡块，达到所需的厚度（6-10 μm）;剖面方块将在刀片边缘形成"带状"。对于大麦种子，厚度为8 μm的部分。
7. 使用精细的油漆刷或细钳将丝带从微管轻轻转移到水浴，确保丝带平放在水面上。
8. 使用向上运动以 45° 角度握住幻灯片，将带状从水中提起到幻灯片上，并使用无绒组织小心地去除多余的水。
9. 在 37 °C 下干燥滑梯 30 分钟，以消除石蜡下剩余的水。
10. 在脱水条件下（几天内使用），在4°C下继续去除石蜡或存放在封闭的盒子里。
11. 用二甲苯将石蜡洗净3x，每张20 s，然后用100%（v/v）乙醇洗2次30s，用70%（v/v）乙醇洗30s2次。
12. 去除石蜡后，立即进行激光捕获微切除。
    注: 冷冻是一种与 LCM 成功耦合的替代方法。冷冻的样品制备会有所不同。

6. 激光捕获微分

1. 使用激光捕获显微解剖显微镜（ 参见材料表）从去石蜡和干燥组织部分进行显微解细胞。
2. 在三个可用插槽上加载幻灯片。
3. 使用收集管的特殊粘合盖收集采集的样品。无需液体捕获（"干"集合）可最大限度地减少 RNase 活动。将收集管加载到可用插槽中。
4. 移动舞台以定位需要切割的样本区域。这可以使用 LCM 机器的鼠标或操纵杆或键盘上的箭头键完成。
5. 为了优化切割速度、切割能量和焦点、激光压力弹射 （LPC） 能量和焦点，首先在膜幻灯片上无组织的空白段上切割。对于大麦种子，切割速度 = 18，切割能量 = 52 切焦 = 63，LPCEnergy = 78，LPC 焦点 = 61 在 10 倍放大倍率下。
   注:切割焦点和能量必须调整为不同的幻灯片，不同的组织和捕获的区域，但一般规则是弹射功率高于切割功率和激光必须去聚焦弹射。客观透镜的放大率越高，激光的焦点越小，能量越高。
6. 使用 绘图工具 通过勾勒出感兴趣的区域来选择单元格。
7. 从 功能工具栏中选择 RoboLPC 函数，根据通过在上面的黑色段上切割获得的优化参数将电池弹射到粘合盖中。
   注:LCM参数因组织类型以及截面厚度、组织硬度和物镜而异。因此，在切割实际样品之前，最好在没有组织试样的情况下优化普通膜区域的每一张幻灯片。
8. 使用 "标志" 工具标记感兴趣的区域，以便通过从元素列表中选择该标志来立即找到它们。
9. 通过[CapCheck]按钮检查胶粘盖，确认样品被捕获。通常，RNA提取需要每盖10-15个节（+200个细胞）的LCM。
10. 将捕获的样品放在冰上。立即进行RNA提取，避免RNA降解。
    注:一些 LCM 显微镜配有荧光灯，可以捕获标有荧光标记的细胞。

7. RNA提取

1. 使用低输入RNA分离（参见 材料表）试剂盒进行LCM后RNA提取。此类试剂盒旨在从不到十个细胞中一致地回收高质量的总RNA。
2. 根据制造商的说明（包括列DNase治疗）将总RNA从捕获的细胞类型中分离。
   注:在管倒置和轻拂的RNA提取的第一步对于确保盖子上捕获的样品与添加的萃取缓冲液接触至关重要。

8. RNA扩增

1. 使用反义RNA（aRNA）扩增试剂 盒（ 见材料表）从体外转录中提取的RNA扩增，以产生足够的RNA，用于RNA-seq库合成。
2. 根据制造商的说明使用 aRNA 扩增套件执行两轮扩增。
   注:将热循环器和盖子预热至套件指示的温度（参见材料 表）制造商非常重要。替代RNA扩增的替代方法是使用低输入库制备套件直接从提取的RNA中合成库。

9. RNA定量

1. 使用自动电泳系统量化和限定 aRNA（参见 材料表）。
   注:自动电泳系统是首选，因为它需要的样品更少（1-2 μL），并且每个样品都提供凝胶状图像和电图。

10. qRT-PCR 和/或RNA-seq

1. 从 aRNA 合成 cDNA，用于 qRT-PCR 或使用标准 RNA-seq 库试剂盒制作 RNA-seq 库。

Results

我们使用LCM RNA-seq协议10在萌芽期间从大麦种子中生成空间和时间组织特异性^转录组。这项研究通过将 LCM RNA-seq 应用于三个胚胎器官的少量细胞（梅花、乳囊尖端、囊泡），在萌芽期间 48 小时的时间过程中每 8 小时（0-48 小时，7 个时间点）（图 2A，B）。

图2:LCM从大麦种子中收集的细胞。（A） 大麦种子的纵向横截面，并插入放大的卡通，指示从中捕获细胞的区域。蓝色 = 羽毛， 品红色 = 弧线， 绿色 = 斯库特拉姆。（B） 李子、花柱和花柱的 LCM .顶部面板，激光压力弹射前组织...

Discussion

许多组织特异性基因表达研究受到样品手工解剖的有限，这种解剖耗时，劳动密集型，具有很高的污染风险，只能利用人体操作者足够灵巧的样品来收获。LCM 是一种精确且无接触的技术，用于在微观可视化下使用机械操作的激光束从固定组织部分采集细胞。

良好的样品制备对于 LCM 至关重要。这个过程依赖于样品的正确固定和嵌入，以保持组织形态和RNA完整性之间的良好平衡。此处介绍的协议为大麦种子提供了优化的固定和嵌入步骤，包括更长的固定时间和固定材料的真空渗透。分析不同的组织或物种将需要优化的条件，因为这些通常不同的组织。该协议的另一个重要方面是RNA扩增步骤，确保为RNA-seq库结构生成足够数量的RNA。我们发现RNA扩增导致高质量的库，但替代低输入库制备方法可能采用^25。目标细胞的组织学识别是我们方法中的关键步骤，可能为罕见或特征较差的细胞类型提供挑战。目标细胞识别可以通过使用传统的组织学污渍或免疫荧光染色作为预处理步骤的一部分，或者，通过使用表达荧光标记细胞特异性标记^{26，27的转基因线来<...}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
乙酸 100% ACS/R。	AnalaR NORMAPUR （BioStrategies）	VWRC20104.323
胶粘剂帽 200 不透明	蔡	415190-9181-000
透明基模 8 X 10	徕卡	3803015
焦碳酸二乙酯	Sigma-Aldrich	40718-25ML
高灵敏度 RNA ScreenTape	安捷伦	5067-5579
低&害羞;剖面 disp.blades DB80LS	Leica	14035843489
MembraneSlide 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000
MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒	Ambion （ThermoFisher）	AMB17515
柱上 DNase I 消化套装	Sigma-Aldrich	DNASE70
Ovation RNA-Seq 系统 V2	NuGen（集成科学）	7102-08
石蜡 （Surgipath Paraplast）	Leica	39601006
PicoPure RNA 分离试剂盒	ABI （ThermoFisher）	KIT0214
RNaseZap RNase 去污溶液	Ambion （ThermoFisher）	AM9780
二甲苯	AnalaR NORMAPUR （BioStrategies）	VWRC28975.360
Leica 台式组织脱水机	Leica Biosystems	TP1020
徕卡加热石蜡包埋模块	徕卡生物系统	EG1150H
徕卡冷板	徕卡病理系统	EG1150C
Safemate 2 级生物安全柜	LAF Technologies Pty Ltd	Safemate 1.5
徕卡全自动轮转切片机	徕卡生物系统	RM2265	配备 PALMRobo v 4.6 软件
蔡司 PALM MicroBeam LCM 系统	蔡司 miscroscopy
TapeStation Agilent		TapeStation 2200