利用浊度和血栓成形术进行补充血栓表征

Summary

纤维蛋白负责血栓形成期间血栓和血栓形成。浊度测定和血栓（TEG）可作为协同工具，提供血栓的补充评估。这两种技术可以更深入地了解凝血条件如何影响纤维蛋白凝块的形成。

Abstract

血栓形成是全世界的主要死因。纤维蛋白（原体）是主要负责凝块形成或血栓形成的蛋白质。因此，血栓形成特征有利于血栓形成的研究。浊度和血栓成形术（TEG）在体外测定中被广泛用于监测血块的形成。浊度通过光谱仪通过纤维蛋白血块结构动态测量光透光，并常用于研究实验室。TEG 是一种专门性粘弹性技术，可直接测量血栓强度，主要用于临床环境评估患者的血栓。在这两种工具的帮助下，本研究描述了一种使用简化的纤维蛋白/血栓表图来描述体外纤维蛋白血块的方法。比较了两种技术在各种凝血条件下的数据趋势。在这项研究中，由于牛凝血因子在临床和研究环境中经常被用作人类凝血因子的替代品，因此人类纤维蛋白血块是并排形成的。结果表明，TEG和浊度通过两种不同的方法跟踪凝块的形成，并结合使用，可跨不同的凝块条件提供互补的血块强度和纤维结构信息。

Introduction

血栓形成是体内血块的病理形成，它阻止血液循环，导致全球发病率和死亡率高。每年每1000人有1至2例静脉血栓栓塞，每千人有2至3例血栓引起的血管^1,疾病。这里介绍的方法是利用血栓成形术（TEG）和浊度监测各种凝块条件下的凝块形成。纤维蛋白（原生）是导致体内凝块形成的主要蛋白质。在凝固级联的最后步骤中，纤维蛋白肽通过血栓从纤维蛋白原中切开，随着血块^{的发育，,}开始聚合不溶性纤维蛋白单^体。为了了解病理血栓形成中的血栓形成，有必要对多种凝血环境下的纤维蛋白形成进行表征。利用多种血块监测测定方法研究体外纤维蛋白血块的形成。蛋白素时间（PT/INR）和激活部分血栓铂时间（aPTT）是测量特定凝血通路完整性的两种常见临床检测方法。然而，他们使用时间作为唯一的变量，没有给出物理凝块属性⁵的指示。电子显微镜允许可视化完全形成的纤维蛋白血块的微观结构，但没有提供有关血块形成过程本身^{的信息6。}在所有测定中，浊度测定和 TEG 能够动态跟踪凝块特性。这些技术能够测量全面的凝血剖面，因此，与其他纤维蛋白凝块特性工具具有一些益处。

具体来说，浊度测定（或凝块浊度测定）由于其简单化实施和在研究实验室中广泛可访问的光谱仪，被广泛用于研究和临床应用。此测定允许通过形成块进行动态测量，以定义的波长（最常见的波长在 350 ~ 700 nm）⁷中进行单独的重复读数。也可以调整读取室中的温度。随着纤维蛋白凝胶的形成，通过蛋白质网络的光量会减少，从而随时间增加吸收度。同样，当血块网络退化时，吸光度会降低。使用多孔板格式可以轻松进行浊度测定，以便对 96 孔和 384 孔板进行高通量样品筛选。有几个凝块特征可以从浊度跟踪曲线（随着时间的推移测量的吸收度）中得出，其中包括:最大浊度、最大浊度时间、凝块发作时间以及血块形成率（Vmax）。纤维蛋白纤维质量/长度比也可以从原始浊度数据中得出，以估计纤维素纤维厚度^{8,8，9，10。,10}

TEG主要用于临床环境，以评估患者的血栓和血块解。它也常用于外科应用，以确定何时应施用抗纤维化药物或止血性血液制品^{11，12。11,}在检测开始之前，在 TEG 杯内发生凝块形成，所有凝块成分被添加到杯中。杯子，随着血块的不断演变，物理旋转对插入其中心的针脚和机电躯干传感器测量增加的粘弹性强度的血块。这种测定通常在37°C的生理温度下进行;但是，可以手动调整仪器上的温度。最大振幅 （MA）、反应速率 （R）、动力学时间 （K）、α 角度 （角度） 和最大振幅时间 （TMA） 由 TEG 软件从动态 TEG 跟踪中提取。这些值通常与临床正常范围进行比较，以评估患者的凝固状态。虽然TEG不是一个粘度计，因为它测量凝块强度以毫米单位，它确实提供了重要的粘弹性凝块数据和功能作为一个有价值的临床决策工具，医生决定管理特定的血液制品和调整治疗剂量^13。当 TEG 和浊度测定同时使用时，它们提供互补的凝块特性信息，因为凝块强度和动力学很容易从 TEG 中提取，而纤维蛋白纤维厚度可通过光学浊度测量获得。

由于纤维蛋白是血块的关键成分，在不同血块形成条件下的纤维蛋白血块表征可以提供有价值的见解，了解特定变量如何有助于血块形成过程和最终血块特性。了解这一点可以为血栓形成诊断和治疗的发展提供指导。为了获得更具代表性的纤维蛋白血块表征，可以替代等离子体来监测血块的形成，因为它与简化的纤维蛋白原/血栓模型系统更类似于体内凝血条件。然而，由于凝固级联的复杂性，使用等离子体形成的凝块增加了复杂性，使得分离单个因素的影响更加困难。利用简化的纤维蛋白原/血栓模型可防止启动整个凝血级联，从而隔离最终的纤维蛋白形成步骤。通过包括两个主要的纤维蛋白形成成分（纤维蛋白原和血栓，此设置创造了一个高度控制的凝块形成条件。还必须注意，虽然此处使用简化的凝块模型，但该协议也可用于通过包括其他凝块因子来描述更复杂的凝块。在这项研究中，使用浊度和TEG进行纤维蛋白凝块表征，通过不同的纤维蛋白原和血栓基浓度、离子强度、pH和凝血溶液中的总蛋白浓度进行，以模拟体内凝血情况^14。有关协议这些变体的详细信息已列入第 5 节。

Protocol

1. 磷酸盐缓冲液盐水（PBS）的制备

注:PBS在整个研究中被使用，因为所述的测定不需要添加钙。需要注意的是，在添加钙（通常用于重新钙化血液制品）时，应避免使用PBS，因为钙在磷酸盐缓冲液中沉淀。

1. 在 DI 水中混合 137 mM 氯化钠、1.8 mM 磷酸钾单基、10 mM 磷酸钠二基和 2.7 mM 氯化钾，制成 0.01 M、pH 7.4 PBS 缓冲液。
2. 使用 pH 探头验证缓冲 pH 值，并根据需要使用氢氧化钠或盐酸调整 pH 值。
3. 使用此 PBS 制备纤维蛋白原和凝血测定（除非另有说明）。
   注:建议缓冲液重组纤维蛋白原粉，因为DI水中的补液即使在37°C时也会导致纤维蛋白原沉淀。

2. 蛋白质的制备和储存

注:在整个协议中，蛋白质库存浓度以不同的浓度为浊度和TEG进行，以允许最终凝血溶液中盐、DI水、PBS和其他残余因子的一致比。

1. 纤维蛋白原的制备和储存
   注:市售纤维蛋白原中的污染物包括大量因子XIII、其他凝血因子的残留量、储存缓冲液和盐。在钙的存在，因子十三是众所周知的交联纤维蛋白血块网络。这种效应有助于加强血块结构和增强的血块强度，影响纤维蛋白表征。商用活动套件可用于确定活性因子 XIIA 水平。为了尽量减少因子XIIIa引起的变异性，在设计实验时应排除钙或采取其他步骤去除因子XIIIa，应将其纳入本协议。此外，应评估蛋白质储存盐和缓冲液类型，如有必要，可以进行透析，以转移到首选的测定工作缓冲液。
   1. 在2 mL管中称重和等异的冻干纤维蛋白原粉（牛或人），每管20毫克蛋白质，在-20°C下储存等分，长达6个月。
   2. 在实验当天，允许纤维素异种适应RT（室温）10分钟。在使用前20分钟将600μL的PBS添加到等值中，重新构成纤维蛋白原。
   3. 服用 10 μL 的纤维素原，在 UV 透明 96 井板或蛋黄酱中用 190 μL PBS 稀释。通过商业光谱仪及其软件，在 280 nm 的吸光度下确定纤维蛋白原浓度。
   4. 使用啤酒定律计算纤维蛋白原浓度（mg/mL）。通过 PBS 进一步稀释（除非另有说明），准备 12 mg/mL（用于浊度测定）和 3.2 mg/mL（用于 TEG）纤维蛋白原库存溶液。
      注:根据啤酒定律，纤维蛋白原浓度测定（mg/mL） :
      
      摩尔消光系数:ɛ513，400 L mol^-1 ɛ ^cm-1，280 nm;路径长 （L）;稀释系数（D）;分子量 （MW） = 340，000 Da. ɛ通过乘以 E^0.1% = 1.51 （280 nm（由供应商给出的灭绝系数）与 MW 派生。
2. 血栓的制备和储存
   1. 在200μL的脱化（DI）水中重组冻干血栓（牛或人，1000U库存），使200μL的5000 U/mL血栓蛋白存量溶液。
   2. 使溶液的 5 μL （20 U/管） 等分，并保持在 +20 °C 时冷冻等分。
   3. 在实验当天，在RT下解冻血栓分等同，15分钟，通过稀释至20 U/mL进行浊度测定和18 U/mL用于TEG与DI水（除非另有说明），使血栓箱工作溶液得到稀释。
      注:应采取预防措施，以保持酶活性，这可以通过在解冻和使用过程中在冰上保持酶来完成;然而，在RT解冻后直接使用血栓发生时，没有观察到血栓发生性活性的降低。

3. 浊度

1. 使用任何具有 350 - 700 nm 的吸光度范围的商业可用光谱仪和相应的软件来监测凝固浊度。参见 材料表）。
2. 打开光谱仪并打开相应的分析软件。
3. 选择 板 1 和打开板设置选项卡。单击 ABS 模式 和动能 来监视一段时间中的动态吸收读数。
4. 在波长选项卡中选择 550 nm（或 350 ~ 700 nm 范围内的任何值），并在计时选项卡中将总运行时间调整为 60 分钟，间隔为 30 秒。通过突出显示井，选择感兴趣的井进行读取。如果需要，请调整其他设置。
   注:选择范围下端（约 350 nm）的波长可带来更好的灵敏度，但吸光度也可能超过光谱仪的检测限制。在文献中，最常用的浊度测量波长为405 nm;但是，此协议使用 550 nm 来确保所有实验的动态浊度值都在检测限制内。所选的读取间隔应尽可能短，以达到最高的检测灵敏度水平。这取决于光谱仪和给定检测期间读取的井数。
5. 拿一个紫外线透明96井板。在选择用于读取的井中移液器 140 μL PBS。在井中加入并混合 10 μL 的血栓（20 U/mL）。
   注:请勿使用高结合检测板，以尽量减少与井面的非特异性蛋白质结合。这可能会影响溶液中的蛋白质分散，并导致高测定变异性。
6. 在井中加入50μL纤维蛋白原（12mg/mL），立即启动凝血，获得200μL凝血溶液，最终浓度为3mg/mL纤维蛋白原和1 U/mL血栓。通过上下移液五次混合井中的内容，注意避免在溶液中产生气泡，因为它们会通过散射光影响吸收。
   注:在同一盘上运行多个血块样品时，使用多通道移液器。记录井之间的时差和仪器第一次读取之前的时间段，以抵消凝血时间。
7. 将 96 井板放在支架中，然后单击 软件中的" 开始"以在 RT 处开始浊度读数。
   注:如果在高温下进行检测，则在开始凝块之前，必须将光谱仪、板和试剂全部保持在所需的温度。
8. 完成后，检索浊度数据，通过绘制绘图软件中随着时间的推移而变化的浊度跟踪曲线。
9. 通过一^{段时间获取} 曲线的最大吸收度值，派生 Turb Max（指示纤维纤维厚度和纤维蛋白网络密度的最大浊度）。
   注:菲布林纤维质量/长度比可以使用以下手稿8中提供的方程从浊度^值中计算。
10. 通过将浊度最大值乘以 90%^来计算 90% 的最大浊度。通过计算^从血 块启动到 90% 最大浊度的时间来推导 Turb 时间。
    注:到 90% 最大浊度的时间是比绝对最大浊度时间更可靠的指标，因为它通过消除高度可变的最终凝块形成周期更好地表示凝块时间。还可以从浊度跟踪曲线中提取其他凝块参数，如凝块开始时间（从测试开始到吸收度开始增加的时间）和凝块形成率（Vmax，浊度跟踪曲线中线性区域的最大斜率）。

4. 血栓成形术（TEG）

1. 打开血栓成形仪分析仪，等待温度稳定在 37 °C。
2. 打开 TEG - 软件。登录后，在 ID 部分下创建实验名称。
3. 按照屏幕上的软件提示对所有通道进行电子测试。完成所有检查后，将操纵杆放回负载位置。
   注:需要进行 TEG 电子测试，每次使用仪器时都应进行。在用于临床样品的常规制造商建议间隔内，需要采用 TEG 凝血控制测定（使用 TEG 1 级和 2 级对照）。
4. 单击 TEG 选项卡，输入要使用的通道的示例信息。将透明未涂覆的 TEG 杯放在相应的通道中。将托架滑到顶部，然后按杯底部 5 次，将销贴在齿轮杆上。放下托架，向下将杯压入托架底座，直到其"咔嗒"。
5. 将 20 μL 的血栓溶液 （18 U/mL） 移入 TEG 杯。通过向 TEG 杯中加入 340 μL 纤维蛋白原（3.2 mg/mL），立即启动凝血，以获得最终浓度为 3 mg/mL 纤维蛋白原和 1 U/mL 血栓的 360 μL 凝血溶液。通过上下移液五次混合内容物。
   注:在步骤中，应添加潜在的凝血因子或其他感兴趣的成分，小心在 TEG 杯中始终保持 360 μL 的最终体积。
6. 向上滑动杯托架，将操纵杆移动到读取位置 ，然后单击软件 中的"开始"以启动 TEG 读数。
7. 一旦 TEG 完成（大约一小时后），检索 TEG 参数，并在绘图软件中通过绘制一段时间的振幅来获取 TEG 跟踪曲线。
8. 从软件收集 MA^作为 TEG 最大值（最大振幅表示血块强度）和^TMA 作为 TEG 时间（到最大振幅的时间）。
   注:MA 由软件计算为振幅在 3 分钟内小于 5% 偏差时的最大振幅。TMA 确定为从最大血栓生成速率（靠近分割点）到 MA 的时间。执行血块分析时，其他参数可能还可用于评估。这些参数的一些示例包括:R 时间（从测试开始到振幅达到 2 mm 时的时间）、K（从 R 结束到振幅达到 20 mm 时的时间）、alpha（R 和 K 之间的线斜率）和 CLT（曲线解结时间）。

5. 不同凝血条件下的纤维素表征

注:通过调节凝血溶液中的特定变量（如:纤维蛋白原和血栓剂浓度、离子强度、pH值和总蛋白质浓度）进行纤维蛋白表征实验。本节介绍了这些示例变量的实验准备;然而，其他凝血因素和利益条件也可以替代。仔细选择合适的缓冲系统，考虑每个独特的测定要求。对于浊度和 TEG 测定，仅包含一个缓冲区控制，以确保在分析这些变量的效果时进行准确的背景减法。

1. 纤维蛋白原浓度变化（1、2、3、4、5毫克/mL）
   1. 调整步骤2.1.4，以准备不同浓度的纤维蛋白原存量（4、8、12、16、20毫克/mL用于浊度测定和1.1、2.1、3.2、4.2、5.3毫克/mL）。。
   2. 将步骤 3.6 调整为"将 50 μL 纤维蛋白原（4、8、12、16、20 mg/mL）添加到 96 井板的多个孔中"，进行浊度测定。
   3. 将步骤 4.5 调整为"将 340 μL 纤维蛋白原（1.1、2.1、3.2、4.2、5.3 mg/mL）加入透明 TEG 杯"，用于 TEG。
2. 改变血栓浓度（0.1、0.3、0.6、0.8、1、2.5、5、10 U/mL）
   1. 调整步骤 2.2.3 以在不同浓度下准备血栓存量 （2， 浊度测定的 6、12、16、20、50、100、200 U/mL 和 1.8、5.4、10.8、14.4、18、45、90、180 U/mL 表示 TEG）。
   2. 将步骤 3.5 调整为"将 10 μL 血栓（2、6、12、16、20、50、100、200 U/mL）添加到 96 井板的多个孔中"，进行浊度测定。
   3. 将步骤 4.5 调整为"移液器 20 μL 血栓（1.8、5.4、10.8、14.4、18、45、90、180 U/mL）"，放入透明 TEG 杯中。"
3. 变化离子强度（0.05、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17 和 0.3 M）
   1. 在 DI 水中溶解氯化钠（21、101、111、121、131、141 和 271 mM），同时溶解 1.8 mM 磷酸钾单基、10 mM 磷酸钠二基和 2.7 M 氯化钾，使 0.01 M PBS 溶液具有不同的离子强度。
   2. 调整步骤1.3，使用不同离子强度的PBS，为浊度和TEG测定准备纤维蛋白原和凝血解决方案。
4. 变化 pH（5.8、6.6、7.3、7.4、7.5 和 8.0）
   1. 溶解磷酸钠二基（0.7、3.2、7.7、8.1、8.4、9.5 mM）和磷酸钾单基（8.2、6.0、 2.0、1.7、1.4、0.5 mM）以及 2.7 mM 氯化钾和氯化钠（153、147、138、137、136、134 mM），以制成 0.01 M PBS 溶液，PH变化，最终离子强度为 0.165 M。
   2. 通过 pH 探头验证缓冲 pH 值，并根据需要调整 pH 值。
   3. 调整步骤1.3以使用不同pH下制造的PBS，为浊度和TEG测定准备纤维蛋白原和凝血溶液。
5. 不同的白素浓度（0，20，40，50，60，80，100毫克/mL）
   1. 在实验当天，在RT的500μLPBS中溶解2克冻干白化白化素20分钟。
   2. 使用步骤 2.1.3 和 2.1.4 中提及的相同程序确定白化素浓度，白杨素的摩尔消光系数为 43，800 L mol^±1 厘米^±1 厘米 （在 280 nm） 。
   3. 以不同浓度准备白林库存。
   4. 将步骤 3.5 调整为"选择用于读取并添加 10 μL 血栓 （20 U/mL）的井中的管道 40 μL PBS"。将步骤 3.6 调整为"通过添加 50 μL 纤维蛋白原 （12 mg/mL） 与 100 μL 白蛋白 （0， 40、80、100、120、160、200 mg/mL）进入多个井中，最终浓度为3mg/mL纤维蛋白原、1 U/mL血栓和0、20、40、50、60、80、100毫克/mL白蛋白。
   5. 将步骤 4.5 调整为"通过添加 200 μL 白素的混合物立即启动凝血 （36， 72、 90、 108、 144、 180 mg/mL） 和 140 μL 7.7 mg/mL 纤维蛋白原进入 TEG 杯，获得 360 μL 凝血溶液，最终浓度为 3 mg/mL 纤维素原、1 U/mL 血红蛋白和 0， 20、40、50、60、80、100毫克/mL 白林在TEG杯中。

Results

图 1所示的实验是不同 纤维蛋白水平的人类和牛纤维蛋白血块的代表性浊度跟踪曲线。图2显示了不同纤维蛋白原水平纤维蛋白凝块形成的代表性TEG 跟踪曲线。两种跟踪曲线都表明，在血块启动后一段滞后期后，血块浊度或血块振幅会随着时间的推移而增加，并在血块形成结束时关闭水平。最大凝块形成的终点值和每次测定的最大凝块形成时间用于评估完全形成的凝块的特征和整体凝块过程。最大浊度（浊度^最大值）和最大浊度（^浊度时间）是从浊度派生的两个参数，而最大振幅（TEG^最大值）和最大振幅时间（TEG^时间）则来自 TEG。

此外，Turb^Max是血块结构的光学测量，它表示纤维纤维厚度和纤维蛋白网络密度。TEG^Max是一种反映绝对血块强度的机械测量。它们代表了血块的不同方面，根据我们先前的发现，这些血块可以^{相互独立地变化}...

Discussion

该协议演示了使用两种不同的凝块特性工具，使用商用组件测试简化的纤维蛋白原/血栓块模型。TEG 和浊度测定都易于进行。它们不仅提供端点血块检查，如最大血块形成（Turb^Max和 TEG^Max）和血块形成时间（Turb^时间和 TEG^时间），还评估动态血块形成过程。这使得TEG和浊度有价值的工具，凝块表征添加到替代方法，如:SEM，PT，APTT，或血栓流变，可以有复杂的实验程序或只专注于测试单个血块方面。浊度和 TEG 结果一起提供了更完整的凝血变量如何影响凝块特性的概况。

除了本协议中详述的凝血变量外，还可以利用这些技术研究许多其他变量。该协议可以通过调整:温度，钙水平，凝血因子水平，加入凝块活化剂或抑制剂，或添加药物剂，例如几例。这些变量可能同时使用简化的纤维蛋白原/血栓模型系统或使用等离子体来研究。研究凝血因子需要仔细考虑和设置，以确保提供适当的上游凝块活化启动凝固途径。浊度和 TEG 也是用于监测血块消化的有效工具。该协议可以修改，以描述纤维蛋白凝块的形成和裂解存在抗凝血剂或血栓解剂。需要注...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 孔透明平底紫外透明微孔板	康宁	3635	未经处理的丙烯酸共聚物，
来自人血清	Millipore Sigma	A1653&ge	;96%，冻干粉
Arium Mini Plus 超纯水系统	Sartorius	NA	DI 水源
牛血清白蛋白	Millipore Sigma	A2153	≥96%，冻干粉
用于 TEG 5000 的一次性杯子和针（透明）	Haemonetics	REF 6211
纤维蛋白原，牛血浆	Millipore Sigma	341573	含有超过 95% 的可凝固蛋白
纤维蛋白原、纤溶蛋白原耗尽、人血浆	Millipore Sigma	341578	含有 & 95% 的可凝固蛋白。
磷酸盐缓冲盐水	Millipore Sigma	P3813	粉末，pH 7.4，用于制备 1 L 溶液
氯化钾	Millipore Sigma	60130	≥99.5% 纯度
磷酸钾二元	Millipore Sigma	P9791	≥98% 纯度
SevenEasy pH 计	Mettler Toledo	S20
氯化钠	Millipore Sigma	71378	≥99.5% 纯度
磷酸氢二钠	Millipore Sigma	71636	≥99.5% 纯度
SpectraMax M5 多检测微孔板检测仪系统	Molecular Devices	M5
TEG 5000 血栓弹性成像仪止血分析仪系统	血液	07-022
血栓、牛	Millipore Sigma	605157
血栓、人血浆、高活性	Millipore Sigma	605195