纤维蛋白在止血和血栓形成过程中负责凝块的形成。浊度测定和血栓弹力图（TEG）可作为协同工具，对凝块提供互补性评估。这两种技术结合使用，能够更深入地揭示凝血条件如何影响纤维蛋白凝块的形成。
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摘要
摘要
血栓形成是全球主要的致死原因之一。纤维蛋白原（fibrinogen）及其转化产物纤维蛋白（fibrin）是介导血凝块形成或 血栓形成的主要蛋白质。因此，对纤维蛋白凝块形成的特征进行表征有助于血栓形成的研究。浊度测定法和血栓弹力图（thromboelastography, TEG）均为广泛使用的体外检测方法，用于监测凝血过程。浊度法通过分光光度计动态测量光穿过纤维蛋白凝块结构时的透光率，常用于科研实验室。TEG 是一种专门的黏弹性检测技术，可直接测量血液凝块的强度，主要应用于临床环境中评估患者的止血功能。借助这两种技术，本研究描述了一种利用简化的纤维蛋白原/凝血酶凝块模型对体外纤维蛋白凝块进行表征的方法。在多种凝血条件下，比较了两种技术所得数据的变化趋势。本研究中并行制备了人源和牛源纤维蛋白凝块，因为在临床和科研实践中，牛源凝血因子常被用作人源凝血因子的替代品。结果表明，TEG 与浊度法通过两种不同的机制追踪凝块形成过程，联合使用时可在不同的凝血条件下提供互补的凝块强度与纤维结构信息。
引言
血栓形成是指体内病理性形成血凝块，阻断血液循环，导致全球范围内高发病率和高死亡率。每年每千人中约有1至2例静脉血栓栓塞，以及2至3例由血栓引发的血管疾病1,2。本文介绍一种利用血栓弹力图（TEG） 和浊度法在不同凝血条件下监测凝块形成的方法。纤维蛋白原（fibrinogen）是体内介导凝块形成的主要蛋白质。在凝血级联反应的最后阶段，凝血酶切割纤维蛋白原释放纤维蛋白肽，启动不溶性纤维蛋白单体的聚合，从而形成血凝块3,4。为了理解病理性血栓中的凝块形成过程，有必要在多种凝血条件下对纤维蛋白的形成进行表征。已有多种凝块监测分析方法被用于体外研究纤维蛋白凝块的形成。凝血酶原时间（PT/INR）和活化部分凝血活酶时间（aPTT）是两种常见的临床检测方法，用于评估特定凝血通路的完整性。然而，它们仅以时间为唯一变量，无法反映凝块的物理特性5。电子显微镜可观察完全形成的纤维蛋白凝块的微观结构，但无法提供关于凝块形成过程本身的信息6。在所有检测方法中，浊度法和TEG能够动态地随时间追踪凝块特性的变化。这些技术可测量全面的凝血谱，因此相较于其他纤维蛋白凝块表征工具具有一定优势。
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方案
1. 磷酸盐缓冲液（PBS）的制备
注意：本研究中全程使用PBS，因为所描述的实验不需要添加钙。需要注意的是，在需要添加钙（通常用于使枸橼酸抗凝的血液制品再钙化）时，应避免使用PBS，因为钙在磷酸盐缓冲液中易发生沉淀。
- 通过将137 mM氯化钠、1.8 mM一碱磷酸钾、10 mM二碱磷酸钠和2.7 mM氯化钾溶于去离子水中，配制0.01 M、pH 7.4的PBS缓冲液。
- 使用pH探针验证缓冲液的pH值，并根据需要使用氢氧化钠或盐酸调节pH值。
- 使用该PBS缓冲液配制纤维蛋白原溶液及进行凝血检测（除非另有说明）。
注意：建议使用缓冲液复溶纤维蛋白原粉末，因为在去离子水中重悬可能导致纤维蛋白原沉淀，即使在37 °C条件下也会发生。
2. 蛋白质的制备与保存
注意：在整个实验方案中，为在最终凝血溶液中保持盐、去离子水、PBS 及其他残留因素的一致比例，蛋白储备液的浓度需根据浊度和 TEG 实验的不同要求配制为不同浓度。
- 纤维蛋白原的制备与保存
注意：市售纤维蛋白原中可能含有大量因子 XIII、其他凝血因子的残留物、保存缓冲液及盐类。在钙离子存在的情况下，因子 XIII 可交联纤维蛋白凝块网络，导致凝块结构更加致密，增强凝块强度，从而影响纤维蛋白的表征结....
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结果
所示实验 图1 分别代表不同纤维蛋白原水平下人和牛纤维蛋白凝块的浊度追踪曲线。不同纤维蛋白原水平下纤维蛋白凝块形成的代表性血栓弹力图（TEG）追踪曲线如图所示。 图2两条曲线均显示，在凝块形成初期经历一段滞后期后，凝块浊度或凝块振幅随时间逐渐增加，并在凝块形成结束时趋于平稳。每次检测所获得的最大凝块形成值及达到最大凝块形成所需的时间被用于评估完全形成凝块的特征及整体凝血过程。最大浊度（Turbidity）Max) 和达到最大浊度所需时间（Turb时间）是根据浊度测定得出的两个参数，而最大振幅（TEGMax) 和达到最大振幅的时间（TEG时间) 源自血栓弹力图（TEG）。
此外，TurbMax 是一种反映凝块结构的光学指标，可表征纤维蛋白纤维的粗细程度及纤维蛋白网络的密度。TEGMax 是一种反映凝块绝对强度的力学指标。根据我们先前的研.......
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讨论
本方案展示了利用两种不同的凝块表征工具，通过市售组分测试简化的纤维蛋白原/凝血酶凝块模型。TEG和浊度分析均易于操作，不仅能提供终点凝块检测指标，如最大凝块形成（TurbMax 和 TEGMax）和凝块形成时间（TurbTime 和 TEGTime），还可评估凝块形成的动态过程。这使得TEG和浊度分析成为凝块表征的有力工具，可补充其他方法，如扫描电镜（SEM）、凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（aPTT）或凝块流变学，这些方法可能实验步骤复杂，或仅聚焦于凝块某一单一特性的检测。浊度分析与TEG结果结合，还能更全面地揭示凝血变量对凝块特性的影响。
除了本方案中详述的凝血相关变量外，还可利用这些技术研究许多其他变量。本方案可通过调整以下因素进行修改：温度、钙离子水平、凝血因子水平、添加凝血激活剂或抑制剂，或添加药物制剂等。这些变量可能通过简化的纤维蛋白原/凝血酶模型系统或血浆系统进行研究。研究凝血因子时需仔细考虑实验设计和设置，确保提供适当的上游凝血激活以启动凝血通路。浊度测定和血栓弹力图.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔透明平底紫外透光微孔板 | Corning | 3635 | 未经处理的丙烯酸共聚物，非无菌 |
| 人血清白蛋白 | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%，冻干粉末 |
| Arium Mini Plus 超纯水系统 | Sartorius | NA | 去离子水水源 |
| 牛血清白蛋白 | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%，冻干粉末 |
| TEG 5000 一次性杯杯盖组件（透明） | Haemonetics | REF 6211 | |
| 牛血浆纤维蛋白原 | Millipore Sigma | 341573 | 含有超过95%可凝固蛋白 |
| 人血浆纤维蛋白原（去纤溶酶原） | Millipore Sigma | 341578 | 含有 ≥ 95% 可凝固蛋白 |
| 磷酸盐缓冲液 | Millipore Sigma | P3813 | 粉末，pH 7.4，用于配制1 L溶液 |
| 氯化钾 | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% 纯度 |
| 磷酸二氢钾 | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% 纯度 |
| SevenEasy pH计 | Mettler Toledo | S20 | |
| 氯化钠 | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% 纯度 |
| 磷酸氢二钠 | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% 纯度 |
| SpectraMax M5 多功能微孔板检测系统 | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 血栓弹力图止血分析系统 | Haemonetics | 07-022 | |
| 牛凝血酶 | Millipore Sigma | 605157 | |
| 人血浆凝血酶（高活性） | Millipore Sigma | 605195 |
参考文献
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379
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