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方法文章

利用浊度和血栓弹力图进行互补性凝块表征

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DOI：

10.3791/61519

⸱

2020年6月4日

 ,  , 
1Emergency Medicine Department, Indiana University School of Medicine, 2Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University

本文内容

摘要

纤维蛋白在止血和血栓形成过程中负责凝块的形成。浊度测定和血栓弹力图（TEG）可作为协同工具，对凝块提供互补性评估。这两种技术结合使用，能够更深入地揭示凝血条件如何影响纤维蛋白凝块的形成。

摘要

血栓形成是全球主要的致死原因之一。纤维蛋白原（fibrinogen）及其转化产物纤维蛋白（fibrin）是介导血凝块形成或 血栓形成的主要蛋白质。因此，对纤维蛋白凝块形成的特征进行表征有助于血栓形成的研究。浊度测定法和血栓弹力图（thromboelastography, TEG）均为广泛使用的体外检测方法，用于监测凝血过程。浊度法通过分光光度计动态测量光穿过纤维蛋白凝块结构时的透光率，常用于科研实验室。TEG 是一种专门的黏弹性检测技术，可直接测量血液凝块的强度，主要应用于临床环境中评估患者的止血功能。借助这两种技术，本研究描述了一种利用简化的纤维蛋白原/凝血酶凝块模型对体外纤维蛋白凝块进行表征的方法。在多种凝血条件下，比较了两种技术所得数据的变化趋势。本研究中并行制备了人源和牛源纤维蛋白凝块，因为在临床和科研实践中，牛源凝血因子常被用作人源凝血因子的替代品。结果表明，TEG 与浊度法通过两种不同的机制追踪凝块形成过程，联合使用时可在不同的凝血条件下提供互补的凝块强度与纤维结构信息。

引言

血栓形成是指体内病理性形成血凝块，阻断血液循环，导致全球范围内高发病率和高死亡率。每年每千人中约有1至2例静脉血栓栓塞，以及2至3例由血栓引发的血管疾病1,2。本文介绍一种利用血栓弹力图（TEG） 和浊度法在不同凝血条件下监测凝块形成的方法。纤维蛋白原（fibrinogen）是体内介导凝块形成的主要蛋白质。在凝血级联反应的最后阶段，凝血酶切割纤维蛋白原释放纤维蛋白肽，启动不溶性纤维蛋白单体的聚合，从而形成血凝块3,4。为了理解病理性血栓中的凝块形成过程，有必要在多种凝血条件下对纤维蛋白的形成进行表征。已有多种凝块监测分析方法被用于体外研究纤维蛋白凝块的形成。凝血酶原时间（PT/INR）和活化部分凝血活酶时间（aPTT）是两种常见的临床检测方法，用于评估特定凝血通路的完整性。然而，它们仅以时间为唯一变量，无法反映凝块的物理特性5。电子显微镜可观察完全形成的纤维蛋白凝块的微观结构，但无法提供关于凝块形成过程本身的信息6。在所有检测方法中，浊度法和TEG能够动态地随时间追踪凝块特性的变化。这些技术可测量全面的凝血谱，因此相较于其他纤维蛋白凝块表征工具具有一定优势。

具体而言，浊度测定法（或称凝块浊度法）因其操作简便，且分光光度计在科研实验室中广泛可用，已被普遍应用于科研与临床领域。该方法可通过在特定波长（最常见为350–700 nm范围内）连续重复测定光通过正在形成的凝块时的透光率，实现对凝块形成过程的动态监测。7读取室内的温度也可进行调节。随着纤维蛋白凝胶的形成，透过蛋白质网络的光量减少，导致吸光度随时间增加； similarly，当凝块网络降解时，吸光度则下降。浊度测定可采用多孔板形式实现多重检测，便于在96孔板和384孔板中进行高通量样本筛选。通过浊度变化曲线（吸光度随时间变化的测定）可获得多种凝块特征参数，包括：最大浊度、达到最大浊度的时间、凝块起始时间以及凝块形成速率（Vmax）。此外，还可从原始浊度数据推导出纤维蛋白纤维质量/长度比，以估算纤维蛋白纤维的粗细程度8,9,10.

血栓弹力图（TEG）主要用于临床评估患者的止血功能和血块溶解情况。它也常用于外科手术中，以确定何时应使用抗纤溶药物或止血类血液制品11,12。血块形成发生在TEG杯中，所有参与凝血的组分均在检测开始前加入杯内。带有正在形成的血块的杯子围绕插入其中心的探针进行物理旋转，电磁扭力传感器则测量血块不断增长的黏弹性强度。该检测通常在37 °C的生理温度下进行，但仪器上的温度也可手动调节。TEG软件从动态TEG曲线中提取最大振幅（MA）、反应时间（R）、动力学时间（K）、α角（Angle）以及达到最大振幅的时间（TMA）。这些数值通常与临床正常参考范围进行比较，以评估患者的凝血状态。尽管TEG并不精确地属于黏度计（因其以毫米为单位测量血块强度），但它确实提供了重要的黏弹性血块数据，并作为临床决策的有用工具，帮助医生决定是否输注特定血液制品并调整治疗剂量13。当TEG与浊度检测联合使用时，二者 可 提供互补的血块特征信息：TEG易于获取血块强度和动力学参数，而纤维蛋白纤维的粗细则可通过光学浊度测量获得。

由于纤维蛋白是血凝块的关键组分，因此在不同凝块形成条件下对纤维蛋白凝块进行表征，有助于深入了解特定变量如何影响凝块形成过程及其最终的凝块特性。这种理解可为血栓形成的诊断以及治疗策略的开发提供指导。为了获得更具代表性的纤维蛋白凝块表征结果，可采用血浆替代简化模型来监测凝块形成，因为其更接近体内凝血条件，相较于简化的纤维蛋白原/凝血酶模型系统更具生理相关性。然而，由于凝血级联反应结构复杂，使用血浆进行凝块形成会增加实验复杂性，使得单独分析各因素的影响更加困难。采用简化的纤维蛋白原/凝血酶模型可避免启动整个凝血级联过程，从而实现对最终纤维蛋白形成步骤的独立研究。通过包含两种主要的纤维蛋白形成成分（纤维蛋白原和凝血酶），该实验体系可建立高度可控的凝块形成条件。还需注意的是，尽管本研究采用的是简化的凝块模型，但该方案也可通过添加其他凝血因子来表征更为复杂的凝块。本研究中，通过改变凝血溶液中的纤维蛋白原和凝血酶浓度、离子强度、pH值以及总蛋白浓度，模拟不同的体内凝血环境，并利用浊度法和血栓弹力图法（TEG）对纤维蛋白凝块进行表征14。有关本方案的这些变量调整的详细信息已在第5节中说明。

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方案

1. 磷酸盐缓冲液（PBS）的制备

注意：本研究中全程使用PBS，因为所描述的实验不需要添加钙。需要注意的是，在需要添加钙（通常用于使枸橼酸抗凝的血液制品再钙化）时，应避免使用PBS，因为钙在磷酸盐缓冲液中易发生沉淀。

  1. 通过将137 mM氯化钠、1.8 mM一碱磷酸钾、10 mM二碱磷酸钠和2.7 mM氯化钾溶于去离子水中，配制0.01 M、pH 7.4的PBS缓冲液。
  2. 使用pH探针验证缓冲液的pH值，并根据需要使用氢氧化钠或盐酸调节pH值。
  3. 使用该PBS缓冲液配制纤维蛋白原溶液及进行凝血检测（除非另有说明）。
    注意：建议使用缓冲液复溶纤维蛋白原粉末，因为在去离子水中重悬可能导致纤维蛋白原沉淀，即使在37 °C条件下也会发生。

2. 蛋白质的制备与保存

注意：在整个实验方案中，为在最终凝血溶液中保持盐、去离子水、PBS 及其他残留因素的一致比例，蛋白储备液的浓度需根据浊度和 TEG 实验的不同要求配制为不同浓度。

  1. 纤维蛋白原的制备与保存
    注意：市售纤维蛋白原中可能含有大量因子 XIII、其他凝血因子的残留物、保存缓冲液及盐类。在钙离子存在的情况下，因子 XIII 可交联纤维蛋白凝块网络，导致凝块结构更加致密，增强凝块强度，从而影响纤维蛋白的表征结果。可使用 commercially available 活性检测试剂盒测定活性因子 XIIIa 的水平。为减少因子 XIIIa 引起的实验变异性，实验设计中应避免使用钙离子，或在本方案中加入额外步骤以去除因子 XIIIa。此外，还应评估蛋白保存所用的盐类和缓冲液类型，必要时可通过透析将蛋白转移至理想的检测工作缓冲液中。
    1. 称取冻干的纤维蛋白原粉末（牛源或人源），按每管 20 mg 蛋白分装至 2 mL 离心管中，于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。
    2. 实验当天，将纤维蛋白原分装样品在室温（RT）下平衡 10 分钟。在使用前 20 分钟，向每管中加入 600 µL PBS 以重悬纤维蛋白原。
    3. 取 10 µL 纤维蛋白原样品，加入 190 µL PBS，在紫外透明的 96 孔板或比色皿中稀释。使用商用分光光度计及其配套软件，在 280 nm 处测定吸光度，以确定纤维蛋白原浓度。
    4. 利用比尔定律计算纤维蛋白原浓度（mg/mL）。通过 PBS 进一步稀释，配制 12 mg/mL（用于浊度测定）和 3.2 mg/mL（用于血栓弹力图，TEG）的纤维蛋白原储备液（除非另有说明）。
      注意：通过比尔定律测定纤维蛋白原浓度（mg/mL）：
      浓度计算公式，方程 C=D*(A/εL)*(Mw/1000)，化学分析。
      摩尔消光系数：ɛ = 513,400 L mol-1 cm-1（280 nm）；光程（L）；稀释倍数（D）；分子量（MW）= 340,000 Da。ɛ 由供应商提供的消光系数 E0.1% = 1.51（280 nm）与分子量相乘得出。
  2. 凝血酶的制备与保存
    1. 将冻干的凝血酶（牛源或人源，1000 U 储备液）用 200 µL 去离子水（DI 水）重悬，配制成 200 µL 的 5000 U/mL 凝血酶储备液。
    2. 将溶液分装为每管 5 µL（20 U/管），于 −20 °C 冷冻保存。
    3. 实验当天，在室温下解冻凝血酶分装样品 15 分钟，并用去离子水将其稀释至工作浓度：浊度测定使用 20 U/mL，TEG 使用 18 U/mL（除非另有说明）。
      注意：应采取措施保持酶活性，例如在解冻和使用过程中将酶置于冰上；然而，实验表明在室温解冻后直接使用，凝血酶活性未见明显下降。

3. 浊度

  1. 使用任何市售的、具有 350 - 700 nm 吸光度范围并配备相应软件的分光光度计，用于实时监测凝块浊度（参见材料表）。
  2. 打开分光光度计，并启动相应的分析软件。
  3. 选择plate 1，打开板设置选项卡。点击ABS模式和Kinetic，以实现对吸光度随时间变化的动态监测。
  4. 在波长选项卡中选择 550 nm（或 350 – 700 nm 范围内的任意值），在时间选项卡中将总运行时间设为 60 分钟，时间间隔设为 30 秒。通过高亮选择需要读取的孔位。根据需要调整其他设置。
    注意：选择波长范围较低端（约 350 nm）可提高灵敏度，但吸光度可能超出分光光度计的检测上限。文献中浊度测量最常用的波长为 405 nm；然而，本方案采用 550 nm，以确保所有实验中的动态浊度值均处于检测限范围内。读取间隔应尽可能短，以实现最高的检测灵敏度。具体间隔取决于分光光度计的性能以及单次检测中读取的孔数。
  5. 取一个紫外透明的 96 孔板。在选定用于读取的孔中加入 140 µL PBS。向孔中加入 10 µL 凝血酶（20 U/mL），并混匀。
    注意：请勿使用高结合力检测板，以尽量减少蛋白质在孔壁表面的非特异性结合。这可能影响溶液中蛋白质的分散性，导致检测变异度升高。
  6. 立即向孔中加入 50 µL 纤维蛋白原（12 mg/mL），启动凝血反应，最终形成 200 µL 的凝血体系，其中纤维蛋白原终浓度为 3 mg/mL，凝血酶终浓度为 1 U/mL。通过上下吹打五次混匀孔内液体，注意避免产生气泡，因为气泡会散射光线，影响吸光度读数。
    注意：当在同一块板上同时运行多个凝血样本时，建议使用多通道移液器。记录各孔之间的时间差异以及仪器首次读数前的时间间隔，以校正凝血起始时间。
  7. 将 96 孔板放入仪器托架中，在软件中点击Start，开始在室温下进行浊度读数。
    注意：若在较高温度下进行检测，则在启动凝血前，必须确保分光光度计、孔板及所有试剂均维持在目标温度。
  8. 检测完成后，提取浊度数据，并使用绘图软件绘制吸光度随时间变化的曲线，获得浊度变化轨迹。
  9. 通过取随时间变化曲线中的最大吸光度值，确定 TurbMax（最大浊度，反映纤维蛋白纤维厚度及纤维蛋白网络密度）。
    注意：可依据下述文献8中提供的公式，利用浊度值计算纤维蛋白质量/长度比。
  10. 将 TurbMax 乘以 90%，计算 90% 最大浊度。通过计算从凝血启动至达到 90% 最大浊度所需的时间，确定 TurbTime。
    注意：达到 90% 最大浊度的时间比达到绝对最大浊度的时间更具可靠性，因其可排除最终凝块形成阶段的高度变异性，更准确地反映凝血时间。此外，还可从浊度轨迹中提取其他凝血参数，如凝血起始时间（检测开始至吸光度开始上升的时间）和凝血形成速率（Vmax，浊度轨迹曲线线性区段的最大斜率）。

4. 血栓弹力图（TEG）

  1. 开启血栓弹力图仪，等待温度稳定在 37 °C。
  2. 打开 TEG 软件。登录后，在 ID 部分创建一个实验名称。
  3. 按照软件屏幕提示对所有通道执行 e-测试。所有检查完成后，将杠杆移回加载位置。
    注意：每次使用仪器时都必须进行 TEG e-测试。当用于临床样本时，应按照制造商建议的常规间隔进行 TEG 凝血对照检测（使用 TEG 1 级和 2 级对照品）。
  4. 点击 TEG 选项卡，输入将要使用的通道的样本信息。将一个透明未涂层的 TEG 杯放入对应的通道中。将载具向上滑动至顶部，按压杯底 5 次，使销钉固定到扭力杆上。将载具降下，并向下按压杯子直至其“咔哒”就位。
  5. 用移液器向 TEG 杯中加入 20 µL 凝血酶溶液（18 U/mL）。立即加入 340 µL 纤维蛋白原溶液（3.2 mg/mL）以启动凝固反应，最终在杯中形成总体积为 360 µL 的凝血溶液，其中纤维蛋白原终浓度为 3 mg/mL，凝血酶终浓度为 1 U/mL。通过上下吹打 5 次混合溶液。
    注意：在此步骤中应加入潜在的凝血因子或其他感兴趣的组分，注意始终保持 TEG 杯中的终体积为 360 µL。
  6. 将装有样品的杯载具向上滑动，将杠杆移至读取位置，然后在软件中点击 开始 以启动 TEG 检测。
  7. TEG 检测完成后（约一小时后），从软件中获取 TEG 参数，并通过绘图软件绘制振幅随时间变化的曲线，得到 TEG 图谱。
  8. 从软件中收集 MA 作为 TEGMax（最大振幅反映血凝块强度），TMA 作为 TEGTime（达到最大振幅的时间）。
    注意：软件将 MA 计算为在连续 3 分钟内振幅变化小于 5% 时的最大振幅值。TMA 定义为从最大血栓生成速率时间点（接近分叉点）到 MA 的时间。在进行凝块分析时，其他参数也可能具有评估价值。这些参数的示例包括：R 时间（从测试开始到振幅达到 2 mm 所需时间）、K 时间（从 R 时间结束到振幅达到 20 mm 所需时间）、α 角（R 与 K 之间连线的斜率）以及 CLT（血凝块溶解时间）。

5. 不同凝血条件下纤维蛋白的表征

注意：通过调节凝血溶液中的特定变量（如纤维蛋白原和凝血酶浓度、离子强度、pH 值以及总蛋白浓度）来进行纤维蛋白表征实验。本节描述了包含这些示例变量的实验制备方法；但也可根据需要替换其他凝血因子或实验条件。应根据每种检测的具体需求，仔细选择合适的缓冲体系。在浊度和血栓弹力图（TEG）检测中，需设置仅含缓冲液的对照组，以便在分析这些变量影响时进行准确的背景扣除。

  1. 不同纤维蛋白原浓度（1、2、3、4、5 mg/mL）
    1. 调整步骤 2.1.4，以制备不同浓度的纤维蛋白原储备液（浊度测定用 4、8、12、16、20 mg/mL，TEG 用 1.1、2.1、3.2、4.2、5.3 mg/mL）。
    2. 调整步骤 3.6，浊度测定时“向 96 孔板的多个孔中加入 50 µL 纤维蛋白原（4、8、12、16、20 mg/mL）”。
    3. 调整步骤 4.5，TEG 测定时“向透明 TEG 杯中加入 340 µL 纤维蛋白原（1.1、2.1、3.2、4.2、5.3 mg/mL）”。
  2. 不同凝血酶浓度（0.1、0.3、0.6、0.8、1、2.5、5、10 U/mL）
    1. 调整步骤 2.2.3，以制备不同浓度的凝血酶储备液（浊度测定用 2、6、12、16、20、50、100、200 U/mL，TEG 用 1.8、5.4、10.8、14.4、18、45、90、180 U/mL）。
    2. 调整步骤 3.5，浊度测定时“向 96 孔板的多个孔中加入 10 µL 凝血酶（2、6、12、16、20、50、100、200 U/mL）”。
    3. 调整步骤 4.5，TEG 测定时“用移液器向透明 TEG 杯中加入 20 µL 凝血酶（1.8、5.4、10.8、14.4、18、45、90、180 U/mL）”。
  3. 不同离子强度（0.05、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17 和 0.3 M）
    1. 将氯化钠（21、101、111、121、131、141 和 271 mM）、1.8 mM 磷酸二氢钾、10 mM 磷酸氢二钠和 2.7 mM 氯化钾溶于去离子水中，配制具有不同离子强度的 0.01 M PBS 溶液。
    2. 调整步骤 1.3，使用不同离子强度的 PBS 配制浊度测定和 TEG 实验所需的纤维蛋白原和凝血溶液。
  4. 不同 pH 值（5.8、6.6、7.3、7.4、7.5 和 8.0）
    1. 将磷酸氢二钠（0.7、3.2、7.7、8.1、8.4、9.5 mM）、磷酸二氢钾（8.2、6.0、2.0、1.7、1.4、0.5 mM）、2.7 mM 氯化钾和氯化钠（153、147、138、137、136、134 mM）溶解，配制 pH 不同且终离子强度为 0.165 M 的 0.01 M PBS 溶液。
    2. 使用 pH 探针验证缓冲液 pH 值，并在需要时进行调节。
    3. 调整步骤 1.3，使用不同 pH 的 PBS 配制浊度测定和 TEG 实验所需的纤维蛋白原和凝血溶液。
  5. 不同白蛋白浓度（0、20、40、50、60、80、100 mg/mL）
    1. 实验当天，在室温下将 2 g 冻干白蛋白溶于 500 µL PBS 中，持续 20 分钟。
    2. 采用步骤 2.1.3 和 2.1.4 中所述相同方法，利用白蛋白在 280 nm 处的摩尔消光系数 43,800 L mol−1 cm−1 测定白蛋白浓度。
    3. 配制不同浓度的白蛋白储备液。
    4. 调整步骤 3.5 为“在选定读数的孔中加入 40 µL PBS，再加入 10 µL 凝血酶（20 U/mL）”。调整步骤 3.6 为“立即通过向多个孔中加入 50 µL 纤维蛋白原（12 mg/mL）和 100 µL 白蛋白（0、40、80、100、120、160、200 mg/mL）启动凝血，使孔中终浓度为 3 mg/mL 纤维蛋白原、1 U/mL 凝血酶和 0、20、40、50、60、80、100 mg/mL 白蛋白”。
    5. 调整步骤 4.5 为“立即向 TEG 杯中加入 200 µL 白蛋白（36、72、90、108、144、180 mg/mL）和 140 µL 7.7 mg/mL 纤维蛋白原的混合液，得到 360 µL 凝血溶液，使 TEG 杯中终浓度为 3 mg/mL 纤维蛋白原、1 U/mL 凝血酶和 0、20、40、50、60、80、100 mg/mL 白蛋白”。

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结果

所示实验 图1 分别代表不同纤维蛋白原水平下人和牛纤维蛋白凝块的浊度追踪曲线。不同纤维蛋白原水平下纤维蛋白凝块形成的代表性血栓弹力图（TEG）追踪曲线如图所示。 图2两条曲线均显示，在凝块形成初期经历一段滞后期后，凝块浊度或凝块振幅随时间逐渐增加，并在凝块形成结束时趋于平稳。每次检测所获得的最大凝块形成值及达到最大凝块形成所需的时间被用于评估完全形成凝块的特征及整体凝血过程。最大浊度（Turbidity）Max) 和达到最大浊度所需时间（Turb时间）是根据浊度测定得出的两个参数，而最大振幅（TEGMax) 和达到最大振幅的时间（TEG时间) 源自血栓弹力图（TEG）。

此外，TurbMax 是一种反映凝块结构的光学指标，可表征纤维蛋白纤维的粗细程度及纤维蛋白网络的密度。TEGMax 是一种反映凝块绝对强度的力学指标。根据我们先前的研...

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讨论

本方案展示了利用两种不同的凝块表征工具，通过市售组分测试简化的纤维蛋白原/凝血酶凝块模型。TEG和浊度分析均易于操作，不仅能提供终点凝块检测指标，如最大凝块形成（TurbMax 和 TEGMax）和凝块形成时间（TurbTime 和 TEGTime），还可评估凝块形成的动态过程。这使得TEG和浊度分析成为凝块表征的有力工具，可补充其他方法，如扫描电镜（SEM）、凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（aPTT）或凝块流变学，这些方法可能实验步骤复杂，或仅聚焦于凝块某一单一特性的检测。浊度分析与TEG结果结合，还能更全面地揭示凝血变量对凝块特性的影响。

除了本方案中详述的凝血相关变量外，还可利用这些技术研究许多其他变量。本方案可通过调整以下因素进行修改：温度、钙离子水平、凝血因子水平、添加凝血激活剂或抑制剂，或添加药物制剂等。这些变量可能通过简化的纤维蛋白原/凝血酶模型系统或血浆系统进行研究。研究凝血因子时需仔细考虑实验设计和设置，确保提供适当的上游凝血激活以启动凝血通路。浊度测定和血栓弹力图...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔透明平底紫外透光微孔板Corning3635未经处理的丙烯酸共聚物，非无菌
人血清白蛋白Millipore SigmaA1653≥96%，冻干粉末
Arium Mini Plus 超纯水系统SartoriusNA去离子水水源
牛血清白蛋白Millipore SigmaA2153≥96%，冻干粉末
TEG 5000 一次性杯杯盖组件（透明）HaemoneticsREF 6211
牛血浆纤维蛋白原Millipore Sigma341573含有超过95%可凝固蛋白
人血浆纤维蛋白原（去纤溶酶原）Millipore Sigma341578含有 ≥ 95% 可凝固蛋白
磷酸盐缓冲液Millipore SigmaP3813粉末，pH 7.4，用于配制1 L溶液
氯化钾Millipore Sigma60130≥99.5% 纯度
磷酸二氢钾Millipore SigmaP9791≥98% 纯度
SevenEasy pH计Mettler ToledoS20
氯化钠Millipore Sigma71378≥99.5% 纯度
磷酸氢二钠Millipore Sigma71636≥99.5% 纯度
SpectraMax M5 多功能微孔板检测系统Molecular DevicesM5
TEG 5000 血栓弹力图止血分析系统Haemonetics07-022
牛凝血酶Millipore Sigma605157
人血浆凝血酶（高活性）Millipore Sigma605195

参考文献

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浊度测定纤维蛋白凝块形成分光光度计分析血栓弹力图分析凝块强度测量纤维结构分析凝固条件比较人与牛凝块
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