我们展示了与自动化成像和分析兼容的人诱导多能干细胞（hiPSC）培养及神经元分化的自动化流程。
方法文章
人诱导多能干细胞来源的皮层神经元和多巴胺能神经元的自动化生产及整合活细胞监测
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
人类诱导多能干细胞（hiPSC）的手动培养与分化方案难以标准化，变异程度高，且容易自发分化为非预期的细胞类型。这些方法劳动强度大，难以适用于大规模实验。为克服这些局限，我们开发了一套自动化细胞培养系统，并将其与高通量成像系统相结合，建立了可并行维持多种hiPSC细胞系及进行神经分化的操作流程。本文描述了利用神经原性基因-2（Neurogenin-2, NGN2）过表达实现短期分化方案的自动化，可在6‒8天内获得hiPSC来源的皮层神经元；同时介绍了长期分化方案的实施，可在65天内生成hiPSC来源的中脑多巴胺能（mDA）神经元。此外，我们将NGN2方法应用于小分子诱导的神经前体细胞（smNPC） （该细胞经GFP慢病毒转导），并建立了活细胞自动化神经突生长检测方法。我们提出了一套适用于常规hiPSC培养及向皮层神经元和多巴胺能神经元分化的自动化系统。该平台适用于长期免手动干预的培养，以及基于hiPSC的高内涵/高通量化合物筛选、RNAi和CRISPR/Cas9筛选，可用于发现新的疾病机制和药物靶点。
引言
人类诱导多能干细胞（hiPSC）具有自我更新能力，几乎可以分化为任何成体细胞类型。这些特性使hiPSC成为基础研究和药物发现中疾病建模的有力工具1。人类iPSC保留了供体的遗传背景，因此能够获得在疾病进程中最受影响或起关键作用的疾病相关细胞类型，例如神经退行性疾病中的不同神经元亚型2,3。此外，hiPSC克服了动物模型和细胞过表达模型的一些局限性，可在人类生理背景下模拟疾病，并实现生理水平的蛋白质表达，已被证明在单基因病、复杂性疾病、表观遗传疾病以及迟发性疾病的建模中具有重要价值4。
尽管具有上述优势和机遇，hiPSC 仍存在若干局限性亟待解决。目前的 hiPSC 培养与分化方案成本较高，难以标准化，且劳动强度大。人工培养步骤可能导致细胞得率和表型出现较大差异，原因在于 hiPSC 的生长状态和自发分化程度存在差异。因此，需要通过采用更加标准化的操作技术并简化实验流程来减少实验者依赖性变异，而自动化技术的应用可实现这一目标5。建立自动化的 hiPSC 培养与分化方案将为学术界和工业界的研究项目设立通用标准，并有助于构建具有生物学意义的疾病模型，获得更可重复的实验结果。
先前的研究已尝试对 hiPSC 培养进行自动化6,7,8，但这些方案仅限于依赖特定系统的细胞培养板格式，缺乏对不同检测体系的适应性。此类系统在细胞扩增方面具有实用性，但可能不适用于特定细胞类型的自动化分化、疾病表型分析及筛选研究。此外，已有研究报道了一种用于成纤维细胞提取、hiPSC 生成与分化的大型自动化平台9，但其规模仅适用于致力于细胞系生产的高通量实验室，虽具吸引力，但对于许多学术实验室而言可能难以负担。
我们开发了一套完全自动化的细胞培养系统，该系统基于液体处理工作站，置于高效微粒空气（HEPA）过滤环境中，并结合大容量CO2培养箱、明场成像细胞仪以及用于板转运的机械臂。这些组件为稳定且可重复的hiPSC培养与分化提供了基础。我们还为系统配备了自动化的-20 °C储存系统，用于化合物或病毒的存储，并集成了一台高速旋转盘共聚焦活细胞成像仪。通过定制化协议，实现了细胞接种、换液、融合度检测、细胞扩增以及带样品处理和板成像的检测板制备等步骤的自动化，使系统适用于高内涵/高通量筛选。该自动化细胞培养与成像系统通过控制软件及定制的图形用户界面（GUI）进行操作。GUI允许用户导入包含方法执行所需细胞系特异性参数的CSV文件。此外，GUI还支持通过内置日历视图按任意顺序安排大量实验，从而精确控制每个方法的启动时间。
我们的自动化细胞培养系统采用标准化的移液速度、传代时间、汇合度阈值、接种密度和培养基体积，并可灵活地在多种孔板格式（96、48、24、12、6 或 1 孔板）中进行细胞培养。我们优化了一种近期发表的短期分化方案，可将人诱导性多能干细胞（hiPSC）转化为神经元，在6天内获得TUBB3阳性神经元10,11。此外，我们建立了小分子神经前体细胞（smNPC）向神经元分化的自动化分化与成像流程，其中smNPC在EF1a启动子驱动下持续表达GFP12；同时，我们也实现了hiPSC向中脑多巴胺能（mDA）神经元的自动化分化，该流程基于先前发表的双SMAD抑制方案13，可在65天内获得mDA神经元。
方案
1. 细胞培养与成像自动化的基础操作
- 装载新的培养板和移液枪头
- 打开图形用户界面（GUI），点击 资源/仪器流程视图 按钮。要运行任何资源/仪器流程，请选择相应的资源/仪器流程，然后点击 运行仪器流程 按钮。
- 运行资源流程 RunHepaHood 和 Reloading（参见步骤 1.1.1）。打开门，根据控制电脑上弹出图像所示的位置，将细胞培养板和一次性移液枪头放置到相应位置。
- 用 70% 乙醇擦拭门以进行去污，然后关闭。从图形用户界面（GUI）运行仪器流程 Decontamination（参见步骤 1.1.1）。系统将通过紫外线照射灭菌 30 分钟。
- 补充培养基和/或解离试剂
- 执行仪器步骤 RunHepahood（参见步骤 1.1.1）。打开液体处理站的前门。用 70% 乙醇对储液槽（含培养基、PBS 和/或解离试剂）进行去污，并将其放置在平台指定位置（如 cfg.csv 文件中所定义）。移除储液槽盖。
- 用 70% 乙醇对门进行去污并关闭。通过图形用户界面（GUI）运行资源/仪器流程“InitHepaHood”，关闭 HEPA 柜电源。
- 在图形用户界面（GUI）中创建新的“细胞系”和项目
- 创建/修改用户自定义的“细胞系”文件，包括配置文件（*.cfg.csv）、导入文件（*.imp.csv）、资源文件（*.rsv.csv）和工作流程文件（*.wfl.csv）。
- 打开图形用户界面（GUI），在“细胞系编辑器”视图中点击 添加细胞系 按钮。将弹出一个向导，需选择配置文件，并输入项目名称和简短描述。
- 使用绿色箭头在向导中逐步前进，并点击绿色对勾确认设置。点击 添加项目 按钮，为生成的“细胞系”创建新项目。
- 输入项目名称和描述，并定义将在图形用户界面（GUI）日历视图中显示的项目颜色。点击箭头进入向导的下一页。
- 点击 添加批次 按钮创建新批次，并在弹出窗口中输入简短名称和描述。选择所有流程步骤，并为每个步骤安排开始时间。点击 确定 关闭窗口。
- 使用图形用户界面（GUI）执行自动化方法
- 进入图形用户界面（GUI）的日历视图，点击 添加流程步骤 按钮。
- 选择 细胞系，进入向导的下一页后选择项目。勾选要使用的批次，然后点击向右的箭头。根据所用方法的不同，批次必须为空（用于接收新板），或包含培养板或检测板（其他所有流程）。
- 进入向导的下一页，选择要执行的流程步骤。进入向导的最后一页并安排实验时间。在“参数详情”部分可修改运行方法所需的变量。点击 确定 确认。
- 将培养板和检测板装入 CO2 培养箱
注：1 孔板被定义为培养板，因其常用于大量扩增细胞。所有多孔板均被定义为检测板。- 如步骤 1.1.1 所述，从图形用户界面（GUI）执行仪器流程“RunHepaHood”，并打开机械臂前方的门。
- 若检测板用于自动化成像，则需用 70% 乙醇和无尘纸擦拭板底。将培养板或检测板放置在左侧搁板上。确保板的方向正确：检测板的 A1 孔应朝向机械臂，而培养板的边缘应朝右。
- 用 70% 乙醇擦拭门以进行去污，然后关闭。
- 按照步骤 1.4 所述，执行“Loading Of Culture Plates”方法以导入 1 孔板，或执行“Loading Of Assay Plates”方法以导入多孔板。使用空批次运行这两个方法。如果该批次中已存在板条形码，请通过点击复选框取消选中。
- 使用机械臂将单个板从搁板运输至 CO2 培养箱平台。内置的板穿梭站将获取板并将其存储在 CO2 培养箱的任一托架中。细胞维持在 37 °C 和 5% CO2 条件下。
- 从 CO2 培养箱卸载板
- 执行“Unload plates”方法（参见步骤 1.4）。选择包含需导出板的批次。可通过条形码选择单个板。
- 使用机械臂将板从 CO2 培养箱运输至左侧搁板。
- 如步骤 1.1.1 所述，通过仪器流程“RunHepaHood”启动 HEPA 柜，并打开机械臂前方的门。取出板，在关闭门前用 70% 乙醇对门进行去污，然后关闭 HEPA 柜电源。
2. 自动化方案
- 从离心管中接种培养板
- 启动HEPA生物安全柜，执行仪器程序RunHepaHood（见步骤1.1.1）。打开液体处理工作站前方的门，放入装有细胞悬液的50 mL离心管，并移除管盖。
- 打开机械臂前方的门，将已包被的培养板放置于架子上以接收细胞。进行去污染处理并关闭两扇门。执行“从离心管中接种培养板”方法（见步骤1.4）。
- 使用明场成像细胞计数仪的直接细胞计数功能进行细胞计数。进行细胞计数时，在384孔板格式中使用16个孔作为重复。
- 通过转盘使用机械臂将384孔计数板从操作台转移至明场成像细胞计数仪，并启动成像过程。细胞计数仪将自动确定每毫升的细胞数量。使用机械臂将计数板送回其原始位置。
- 使用机械臂将已包被的培养板或检测板从架子转移至移液操作台。去除包被液，并以用户定义的细胞数量和适合板型的体积接种细胞（见表1）。将板转移至操作台内置振荡器，以500 rpm振荡10秒以促进细胞分布，随后转移至CO2培养箱。
- 自动汇合度评估
- 执行步骤1.4中所述的“检查汇合度”方法。选择包含至少一个培养板且不含检测板的批次。在“参数详情”部分输入“iPSCf_2020”作为图像采集和图像分析设置。
- 使用机械臂通过转盘将第一块板从CO2培养箱转移至明场成像细胞计数仪。
- 在明场成像细胞计数仪中对细胞进行成像，以检查hiPSC集落的汇合度。使用“汇合度”应用，对1孔板中的13个视野进行成像，并自动计算细胞占据的平均面积。
- 使用机械臂将板送回CO2培养箱。对剩余的板重复步骤2.2.2至2.2.4。
- 培养板或检测板的换液
- 执行步骤1.4中所述的“培养板换液”方法，并选择仅包含培养板的批次。在“参数详情”部分设置变量，以指示移液步骤中使用的是吸头还是针头。对于任何多孔板的换液，执行“检测板换液”方法，并选择包含检测板的批次。
- 使用机械臂将各板从CO2培养箱转移至操作台，并移除板盖。自动倾斜板面，吸除旧培养基并弃入废液收集模块。加入12 mL新鲜培养基。重新盖上板盖，并使用机械臂将板送回CO2培养箱。
- 传代培养
注意：如步骤1.1.1所述，通过图形用户界面执行仪器程序“RunHepaHood”，并打开液体处理工作站的前门。将培养基和解离试剂加载至指定位置（见步骤1.2）。如需补充吸头，请使用步骤1.1中所述的“重新加载”功能。准备一个50 mL离心管用于接收细胞悬液，并移除管盖。- 执行“贴壁细胞传代培养”方法（见步骤1.4），选择需要传代的培养板批次。
- 使用机械臂将板从CO2培养箱转移至操作台，并移除板盖。自动倾斜板面，移除旧培养基并弃入废液收集模块。用8 mL PBS洗涤细胞一次。加入8 mL 0.5 mM EDTA用于集落式传代。在操作台上孵育8分钟。
- 从板中移除EDTA溶液并弃入废液收集模块。加入12 mL新鲜培养基，并将板转移至振荡器。以2000 rpm振荡1分钟，使集落脱落。
- 通过移液吹打细胞悬液5个循环，将iPSC集落分散为较小尺寸（约50–80 µm）。将细胞悬液转移至操作台上的50 mL离心管中。按照步骤2.1.5所述自动接种细胞，传代比例为1:7。
注意：可选，单细胞传代。使用单细胞解离试剂制备单细胞悬液（见材料表）。在步骤2.4.2中，用8 mL单细胞解离试剂替代0.5 mM EDTA，并在37 °C孵育20分钟。将细胞悬液收集至50 mL离心管中，并加入等体积培养基。使用单细胞解离试剂进行解离时需手动离心收集细胞。在300 x g下离心3分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于12 mL所需培养基中，然后继续执行“从离心管中接种培养板”（见步骤2.1）。当使用hiPSC单细胞悬液接种时，需在接种当天在培养基中补充2 µM thiazovivin。
- 自动高内涵、高通量成像
注意：必须已配置测量设置（见 补充文件1：步骤1.1）。待成像的检测板已放置于培养箱中。- 执行“成像”方法（见步骤1.4）。选择包含至少一个检测板且不含培养板的批次。在“参数详情”部分输入板类型、板定义（对于标准96孔成像板：“Plate-96-20170918113842”）以及测量设置名称。
- 使用机械臂通过转盘将检测板转移至自动共聚焦显微镜以启动成像过程。成像结束后从显微镜回收板，并将其送回CO2培养箱。对批次中其余板重复该过程。
3. hiPSC 的自动化维持与扩增
- 自动化汇合度检测、换液与传代的步骤顺序
- 使用“从离心管接种培养板”方法（见步骤2.1）将细胞接种至单孔板中。或者，使用“培养板加载”方法（见步骤1.5）导入已手动接种的单孔板。
- 每日安排自动汇合度检测以进行监测 iPSC 培养第1天至第6天的集落生长情况（参见步骤2.2）。
- 每隔一天使用“培养板换液方法”更换培养基（参见步骤 2.3），每孔板使用 12 mL 培养基。
- 第6天，开始“传代”过程（参见步骤2.4）。
4. 自动化分化
- 人iPSC向皮层NGN2神经元的分化
注意：手动制备 hiPSC。该方案涉及使用慢病毒载体递送 Neurogenin-2（NGN2）的过表达。以 1:2 的比例将 hiPSC 与 NGN2 连同 rTTA3 慢病毒共转导> ~107 TU/mL）。随后用 0.5 进行一轮传代筛选 µg/mL 嘌呤霉素。生成稳定 hiPSC-NGN2 细胞系的详细方案见于 补充文件 1步骤 2。- 当 hiPSC 达到 70‒80% 汇合度时，按照步骤 2.4.4 注释中所述的单细胞解离试剂，进行“传代培养”操作。
- 移除上清液，并将细胞沉淀重悬于 12 mL NGN2 培养基中（材料表) 含 2.5 µg/mL 多西环素（dox）和 2 µM thiazovivin
- 使用“从离心管向培养板接种”开始分化” 方法（参见步骤2.1）。将iPSC的接种密度设定为30,000/cm²。2 （见表1）。将iPSC接种至预先包被的培养板中，包被液为0.1 mg/mL多聚-L-鸟氨酸（PLO）和5 µg/mL 层粘连蛋白
注：基于RNA和蛋白质组学的研究优先使用单孔板，而成像实验则优先采用96孔板。也可使用其他类型的检测板，如48孔、24孔、12孔或6孔板。 - 在分化第1天，使用NGN2培养基（补充2.5）对检测板进行换液（参见步骤2.3） µg/mL 多西环素和 10 µM N-[2S-(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）。每2‒3天更换一次培养基，直至达到预期的分化时间点（见步骤2.3）。
- 在分化第4天，使用添加了10 ng/mL 脑源性神经营养因子（BDNF）、10 ng/mL 胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和10 ng/mL 神经营养因子3（NT-3）的NGN2培养基进行另一次换液（参见步骤2.3），以促进细胞成熟。实验结束时，将培养板从系统中导出，用于后续实验（参见步骤1.6）。
- 小分子神经前体细胞（smNPC）向NGN2神经元的转化
注意：按照已发表方案的改良版本进行smNPC的诱导分化12 （参见 补充文件 1：步骤5）。用NGN2和rTTA3病毒修饰smNPC（参见 补充文件 1：步骤2）。一轮NGN2和rTTA转导足以获得稳定细胞群体。进一步使用pLVX-EF1a-AcGFP1-N1慢病毒修饰smNPC，以实现活细胞实时监测。GFP慢病毒转导时采用10的感染复数（MOI）。- 当smNPC达到汇合时，使用单细胞解离试剂按步骤2.4所述进行传代。注意。
- 使用自动细胞培养系统以每平方厘米50,000个细胞的密度接种细胞2 使用“从离心管接种培养板”方法（见步骤2.1）将细胞接种至预先包被有0.1 mg/mL PLO的培养板，并加入5 µNGN2 培养基中添加 2.5 g/mL 层粘连蛋白 µg/mL 多西环素
- 第3天，使用含有2.5的 fresh NGN2 培养基进行换液（见步骤1.3）。 µg/mL 多西环素和 10 µM DAPT。第3天后，每隔三天更换一次培养基，使用含有2.5的 fresh NGN2 培养基 µg/mL 多西环素，BDNF、GDNF 和 NT-3 各 10 ng/mL
- 每天使用成像系统对细胞进行成像 “自动化高内涵、高通量成像”方法（见步骤2.5），利用GFP作为轴突生长的检测信号来监测分化状态。将激光功率设置为80%，曝光时间为30 ms。使用20倍物镜采集大量视野（例如，25个视野）。
- 批量图像分析
- 使用图像分析软件1，结合 neurite outgrowth 模板进行图像分析。
- 打开软件，选择“Data”选项，浏览至成像数据文件夹，单击 ok 加载待分析数据。单击 开放 并从顶部菜单栏中选择 方案 并从应用程序菜单中选择 神经突生长. 进入“算法”界面，使用“488”通道定义细胞核、细胞体和神经突。为每一项调整阈值参数。
- 选择用于图像分析的孔。在右下角点击 链接 并选择要分析的特征，如平均细胞数、总骨架长度。依次进行“预分析”和“预览”。
- 检查预览设置是否可接受，然后以批处理模式开始分析。结果将保存在父文件夹下的“reports”目录中，格式为 .csv，可在 Excel 中打开。
注：图像分析脚本可根据要求提供。 - 绘制经细胞数量归一化的总 neurite 长度所得的平均 neurite 长度。
5. 将人诱导性多能干细胞（hiPSC）自动分化为中脑多巴胺能（mDA）神经元
- 人工 hiPSC 准备
- 使用单细胞解离试剂将 70–80% 汇合度的 hiPSC 解离为单细胞。简要步骤：在 37 °C 下用单细胞解离试剂（100 µL/cm2）孵育细胞 30 分钟，将细胞悬液收集至锥形管中，以 200 × g 离心 5 分钟，然后将细胞沉淀重悬于 iPSC 培养基中。
- 在包被有细胞外基质的 1 孔板中以 200,000 个细胞/cm2 的密度接种细胞，并加入含 10 µM Y-27632 的 iPSC 培养基。于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养过夜。
- 自动化分化：第一阶段
- 按照步骤 1.1–1.2 所述方法准备自动化培养系统。
- 将含有细胞的培养板装入自动化培养系统的 CO2 培养箱中（见步骤 1.5）。
- 准备 KSR 培养基（见材料表），并添加分化第 0 天所需的 小分子（见表 2）。仅使用新鲜配制的含小分子和生长因子的培养基。
- 在分化第 0 天和第 1 天，按照步骤 2.3 进行培养基更换，之后每两天更换一次，直至第 25 天。
- 从第 5 天起，逐步调整培养基配方 ，具体细节见表 3。
- 在第 11 天，加入补充有 CHIR（至第 13 天）、BDNF、AA1、GDNF、db-cAMP、TGFß3 和 DAPT 的中脑多巴胺能（mDA）神经元分化培养基（见材料表）。
- 在第 25 天，取出培养板（见步骤 1.6）。
- 人工重铺板 1
- 使用单细胞解离试剂将第 25 天的 mDA 前体细胞解离为单细胞。简要步骤：在 37 °C 下用单细胞解离试剂（100 µL/cm2）孵育细胞 40 分钟，将细胞悬液收集至锥形管中，以 200 × g 离心 5 分钟，然后将细胞沉淀重悬于 mDA 神经元分化培养基中。
- 在预先包被有 0.1 mg/mL 多聚赖氨酸（PLO）、10 µg/mL 层粘连蛋白和 2 μg/mL 纤维连接蛋白的 1 孔培养板中，以 400,000 个细胞/cm2 的密度接种细胞，使用含 10 µM Y-27632（至第 26 天）以及表 2中所述小分子和生长因子的 mDA 神经元分化培养基。于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养过夜。
- 自动化分化：第二阶段
- 按照步骤 1.5 所述方法，将含有 mDA 神经元的培养板装入自动化培养系统的 CO2 培养箱中。
- 准备 mDA 神经元分化培养基（见材料表），并添加从第 26 天起最终分化所需的小分子和生长因子（见表 2）。
- 在分化第 26 天，按照步骤 2.3 进行培养基更换，之后每 3–4 天更换一次，直至第 65 天。
注：为便于高通量成像，建议在分化第 32 天按照步骤 5.5 所述方法，将 mDA 神经元以低密度重铺至 96 孔板中。
- 人工重铺板 2
- 按照步骤 1.6 所述方法取出培养板。按照步骤 5.3.1 所述方法将第 32 天的 mDA 神经元解离为单细胞。
- 在预先包被有 0.1 mg/mL 多聚赖氨酸（PLO）、10 µg/mL 层粘连蛋白和 2 μg/mL 纤维连接蛋白的 96 孔板中，以 100,000 个细胞/cm2 的密度接种细胞，使用含 10 µM Y-27632（至第 33 天）以及小分子和生长因子（见表 2）的 mDA 神经元分化培养基。于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养过夜。
- 在第 33 天，更换为新鲜配制的多巴胺能（DA）神经元分化培养基（含小分子和生长因子，不含 Y-27632）。此后每 3–4 天手动更换一次培养基，直至第 65 天。
6. 免疫染色、自动化高通量图像采集与分析
- 荧光染色
- 按照补充文件1：步骤4中所述方法进行荧光免疫染色。
- 按照补充文件1：步骤1.2中所述方法对细胞进行成像。
- 将成像系统生成的图像文件上传至图像分析软件2（参见材料表），并按照步骤6.2中所述进行进一步的图像分析。
- 使用图像分析软件2进行图像分析
- 图像文件上传至图像分析软件2后，进入“图像分析”功能，通过下拉菜单构建分析算法。
- 使用“识别细胞核”任务选择细胞核，该任务可检测图像中属于细胞核的区域（此处用Hoechst染色）。通过设定细胞核面积或直径的阈值，排除死细胞的细胞核（固缩核）。
- 使用“识别细胞质”任务选择细胞质。该任务可检测细胞核周围属于细胞质的区域。仅保留分割良好的细胞，排除有丝分裂、凋亡及分割不良的细胞，并去除接触图像边界的细胞。
- 添加“计算形态学特征”和“计算荧光强度特征”任务。形态学参数包括对感兴趣区域的面积等形态特征的计算；强度参数包括对感兴趣区域（例如神经元细胞质）的平均荧光强度等强度特征的计算。
- 在输入群体（所有已选细胞质）中，使用一个或多个条件（形态学和/或强度）选择亚群（例如酪氨酸羟化酶阳性神经元）。
注：通常对神经元选择强度参数。根据阴性对照，可确定高于何种强度阈值的神经元被视为酪氨酸羟化酶阳性。 - 定义输出结果。这是每个分析流程的最后一个构建模块，用于定义培养板每孔的检测读数（每孔结果）。
- 运行批量分析并导出结果。将阳性细胞数归一化为总细胞核数，并以阳性细胞百分比表示数据。
7. 定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）
- 按照补充文件1中的步骤3进行qRT-PCR实验。
结果
我们的自动化细胞培养与成像系统旨在最大限度减少人为干预，从而实现人诱导多能干细胞（hiPSC）的标准化培养及其向不同细胞类型（如皮层神经元或中脑多巴胺能（mDA）神经元）的分化。图1展示了集成成像设备的自动化细胞培养系统的示意图。将细胞培养物初始引入该自动化系统时，可通过从50 mL离心管中自动接种细胞，或采用“培养板加载”或“检测板加载”方法导入培养板或检测板。我们系统的核心组件是液体处理工作站，所有液体转移操作（如换液或传代培养）均在此完成。液体处理仪定制的平台布局如图2所示。该液体处理工作站配备四个位置，最多可将四块培养板从培养箱转移至平台，从而实现并行换液操作。由于在传代培养过程中，亲代和子代培养板均需同时放置于平台上，因此可并行处理的培养板数量最多为两块。液体处理工作站的一个重要特性是在换液过程中可倾斜培养板，以确保完全移除细胞培养上清液。此外，液体处理工作站还配备振荡器，可在执行传代培养程序时促进细胞的酶解离。我们的自动化培养系统还配备了两种成像系统：明场成像细胞仪，用于进行细胞计数和融合度检测，从而实现对细胞生长过程的长期监测；以及双转盘共聚焦显微镜，用于对细胞进行快速、高通量、高分辨率的成像。
每日在明场成像细胞仪上监测hiPSC培养物的生长情况，并分析其汇合度百分比。左图面板为明场图像，右图面板为通过细胞仪获取的明场图像分析所得的绿色掩膜（图 3A）。观察到人诱导多能干细胞（hiPSC）在培养过程中呈现均一性生长，如平行培养并处理的两个人诱导多能干细胞系（n = 4 块培养板）的融合度百分比所示 从第1天到第6天进行汇合度检查（图3B）。达到设定阈值后，对hiPSC进行传代。细胞系通过手动（m）或自动化（a）系统培养，并至少连续观察两次传代过程中是否维持典型的干细胞形态，代表性明场图像（图 4A）。手动培养（未显示）或在自动化系统中培养的hiPSC均表现出典型的干细胞标志物OCT4（红色）和SSEA4（绿色），如免疫荧光检测所示图4B）。多能性标志物的表达 OCT4, NANOG 和 REX1 也通过qRT-PCR在mRNA水平上进行了检测（图4C）。相对定量分析使用来自同一细胞系的样本进行，该细胞系分别通过手动（m）和自动化培养系统（a）培养，并设置两个重复（重复1和重复2）。在自动化培养系统中培养的重复样本中，三个多能性标志物的表达水平与手动培养后的标志物表达水平相似。在第8天（D8），由hiPSC分化（Diff）而来的皮层神经元中，多能性标志物的表达消失。
自动化培养系统的一个重要应用是将hiPSC分化为不同类型的细胞，包括神经元。本文展示了利用NGN2策略将hiPSC分化为神经元的方法，该方法可在极短时间内（约6天）获得纯度较高的皮层神经元培养物。在自动化培养系统中分化的神经元（a）在形态学和神经元网络结构方面与手动培养的神经元（m）相似（图5A）。自动化分化的皮层神经元表达TUBB3（神经元特异性III类β-微管蛋白，红色）和BRN2（上层皮层标记物，绿色）（图5B），其表达水平与手动分化的神经元相当 （数据未显示）。在分化第8天（D8）时，神经元中微管相关蛋白2（MAP2）、神经细胞黏附分子（NCAM1）、突触素-1（SYN1）以及皮层神经元标记物BRN2和CUX1（上层皮层）的表达均显著富集（图5C）。这些标记物在hiPSC中几乎无表达或表达极低。相对定量分析基于一个细胞系分别在手动（m）和自动化培养系统（a）中培养的两组重复样本（重复1和2）进行。重复样本的表达水平显示，手动分化与自动化分化之间的变化趋势相似。
自动化培养系统集成的成像功能可实现对细胞培养状态的免手动数据采集，从而支持长期自动获取表型读数。通过将NGN2方法应用于经GFP慢病毒转导的小分子诱导神经前体细胞（smNPC）系，我们建立了一种活细胞自动化的神经突生长检测方法，在连续11天的分化过程中无需任何人工干预即可测量神经突长度。随着时间推移，神经突复杂性逐渐增加，这可通过第1、3、11天神经突所占据的面积、GFP表达情况以及分析所得的掩膜图像加以证明图6A，B）。通过量化分化第1天至第11天 neurite 长度的增加，结果显示不同孔之间的发育趋势相似。为简化起见，代表性图表中仅展示了来自96孔板的3列（每列6个孔）的数据，尽管实际分析了全部60个内孔图6C).
自动化培养系统在此展示的另一项应用是将hiPSC分化为中脑多巴胺能（mDA）神经元。该分化过程依据既定方案通过培养基更换实现，并在自动化培养系统上自第0天至第65天完成。自动化更换培养基未导致细胞脱落或任何其他可视觉检测到的分化异常。在第65天分化结束时，mDA神经元呈现出与手动分化相当的细胞结构和形态特征（圆形胞体、细长且具树突棘的树突），图7A，B在mRNA水平上，自动化培养系统中分化出的中脑多巴胺能神经元表现出神经元及中脑多巴胺能神经元标志物的表达， MAP2 和 TH （酪氨酸羟化酶），分别（图7C）。两种分化方法均产生了大量酪氨酸羟化酶（TH）和微管相关蛋白2（MAP2）阳性神经元（图7D).
图 1：自动化细胞培养与成像平台的示意图概览。
该系统采用聚碳酸酯外壳，并配备两个带有四根紫外灯的HEPA罩（A和B），以确保细胞培养应用的无菌环境。细胞培养板放置在机械臂前方的架子上，可通过前门（C）进入。这些培养板被送入可容纳456块培养板的CO2培养箱（D）中。在传代培养过程中，使用明场细胞计数仪（E）进行细胞融合度检测和细胞计数。液体处理工作站位于其中一个HEPA罩（B）下方，其工作台布局见图 2。液体处理工作站的移液臂配备一个96通道移液头、八个1 mL移液通道和四个5 mL移液通道。对于1 mL移液通道，可使用移液枪头或针头进行液体转移。为实现筛选目的，接种于检测板中的细胞可在第二培养箱（G）中解冻后，由自动化的-20 °C储存系统（F）提供储存于-20 °C的样品进行处理。高通量成像在自动化共聚焦显微镜（H）中进行，该显微镜可通过两个旋转圆盘以共聚焦模式或以落射荧光模式采集图像。集成于显微镜中的活细胞培养室可支持对培养细胞进行长期成像。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：液体处理工作站的甲板布局。
吸头位置分别用“50 µL”表示 50 µL 吸头，“standard”表示 300 µL 吸头，“high”表示 1 mL 吸头，以及“5 mL”表示 5 mL 吸头。甲板组件包括：（A）四个加热振荡位（最大转速：2500 rpm），可用于任何培养板或检测板格式。振荡位配备可夹紧的夹持器，用于在板转移至甲板后进行板对齐。此外，振荡位在液体转移步骤期间还可作为板盖的停放位置。为示意目的，所有振荡位均放置了 96 孔检测板。（B）顶部设有四个倾斜模块，可同时处理四个任意格式的板。最下方位置为培养板和检测板以及 96 通道移液头的废液收集腔。为示意目的，所有倾斜模块均放置了 96 孔检测板。（C）最上方位置放置用于细胞计数的 384 孔板。其下方为两个板位（为示意目的均放置 96 孔板）以及一个可容纳四个 50 mL 和四个 15 mL 管的管架。最下方位置放置 5 mL 吸头。（D）三条培养基管线，配有培养基储液槽位置。培养基管线配备液位传感器，可自动向储液槽中补充最多 250 mL 培养基。（E）两个带主动排水功能的液体废液模块位于上方，其下方为一个温控模块，内含一个容器位（白色），以及一个 5 mL 吸头架 位于此处。（F）五个 1 mL 吸头位。（G）两个温控模块位于底部，其上方设有一个用于停放其中一个模块盖子的位置。（H）顶部为两个 50 µL 嵌套式吸头架（NTR）位置，接着是两个用于单通道和 96 通道拾取 300 µL 吸头的位置，底部为一个 5 mL 吸头架。（I）顶部为一个 384 孔计数板堆栈器，接着是三个 300 µL NTR 位置，底部为一个 5 mL 吸头架。（J）用于三组共八个可重复使用的金属 1 mL 针头的储存与清洗站。（K）用于 1 mL 和 5 mL 移液通道以及空 NTR（灰色）的废料位，以及一个用于甲板上转移步骤的 1 mL 和 5 mL 通道夹持器块（白色）。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：hiPSC的自动汇合度检测。
（A）由细胞计数仪拍摄的hiPSC代表性明场（BF）图像（左图），以及经自动汇合度分析后的结果（右图），其中绿色区域表示细胞所占面积比例；（B）两个hiPSC细胞系（iPS #1 和 #2）在培养第1至第6天的汇合度百分比记录，每细胞系 n = 4 个单孔板。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：hiPSC的传代培养。
(A) 一种hiPSC细胞系经手动（左）和自动化培养系统（右）培养后的明场图像。图像拍摄于第二次传代后第6天；(B) hiPSC经多能性标志物OCT4和SSEA4染色的代表性图像，并用Hoechst 33342进行核复染（细胞核）；(C) 一种hiPSC细胞系在手动（m）和自动化培养系统（a）中平行培养（1和2）以及相应诱导分化的皮层神经元（Diff）在分化第8天（D8）时，多能性标志物OCT4、NANOG和REX1的qRT-PCR检测结果。数据以iPS_a_1为参照样本表示为相对定量（RQ）。误差线表示qRT-PCR技术重复三次的标准差（SD）。GAPDH、RPL13A1和RPLPO用作内参基因。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：人iPSC来源的皮层神经元。
（A）第6天手动（m）和自动化（a）分化获得的皮层神经元的明场图像，显示相似的神经元网络；（B）分化第8天细胞的代表性免疫荧光图像，染色标记物包括TUBB3（泛神经元标记）、BRN2（皮层神经元标记）和Hoechst 33342（细胞核）；（C）分化第8天（D8）皮层神经元标志基因（MAP2、BRN2、CUX2、NCAM1 和 SYN1）的qRT-PCR检测结果。数据以iPS_a_1为参照样本的相对表达量（RQ）表示。误差线表示qRT-PCR技术重复三次的标准差（SD）。GAPDH、RPL13A1 和 RPLPO 用作内参基因。比例尺：50 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
图6：神经突生长的高通量检测方法。
(A) 分化第1、3和11天表达GFP的细胞代表性图像；(B) 分化第1、3和11天神经突的代表性二值化图像。使用高内涵图像分析软件1对神经突生长进行定量，结果以神经突长度表示；(B) 图形显示了NPC来源的NGN2神经元中神经突长度的增加以及致密网络的形成。对三个96孔板中内侧60个孔的细胞进行成像。为简化起见，每个96孔板仅以三列孔为例展示，每列n = 6个孔。每个孔平均分析1308个细胞。误差线表示平均值的标准误（S.E.M.）。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7：人iPSC来源的中脑多巴胺能（mDA）神经元。
通过手动（m）和自动化（a）培养系统分化得到的中脑多巴胺能神经元。（A、B）mDA神经元的代表性荧光图像，染色标记为酪氨酸羟化酶（TH，mDA神经元标志物；绿色）、MAP2（神经元标志物；红色）和Hoechst 33342（细胞核；蓝色）；（C）手动和自动化培养系统分化得到的mDA神经元标志基因的代表性qRT-PCR结果。TH 和 MAP2 的表达水平以相对于管家基因（OAZ1 和 GAPDH）的相对定量（RQ）表示；（D）手动和自动化分化产生的TH阳性与MAP2阳性神经元的百分比。误差线表示使用两个不同iPSC细胞系（#1和#2）进行的两次独立分化实验的标准差（SD）。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
| 细胞类型 | 目的 | 实验方案步骤 | 细胞密度 | 培养板规格 | 每孔细胞数量 |
| NGN2 分化 | |||||
| iPSC | NGN2 稳定细胞系构建 | S.2.3. | 30,000 cells/cm2 | 12孔板 | 1,17,000 |
| iPSC | NGN2 神经元分化 | 3.1.3. | 30,000 cells/cm2 | 1孔板 | 25,20,000 |
| iPSC | NGN2 神经元分化 | 3.1.3. | 30,000 cells/cm2 | 96孔板 | 9,600 |
| smNPC 生成 | |||||
| smNPC | 第12天和第16天传代 | S5.9. 和 S5.11. | 70,000 cells/cm2 | 6孔板 | 6,72,000 |
| smNPC | 第5代传代 | 5.11. | 50,000 cells/cm2 | 6孔板 | 4,80,000 |
| smNPC | smNPC 向 NGN2 神经元分化 | 3.2.2 | 50,000 cells/cm2 | 96孔板 | 16,000 |
| mDA 分化 | |||||
| iPSC | mDA 神经元分化 | 4.1.2. | 200,000 cells/cm2 | 1孔板 | 1,68,00,000 |
| DA 神经元 | 第25天传代 | 4.3.2. | 400,000 cells/cm2 | 1孔板 | 3,36,00,000 |
| DA 神经元 | 第25天传代 | 4.5.2. | 100,000 cells/cm2 | 96孔板 | 32,000 |
| 包被 | 目的 | 实验方案步骤 | 浓度/ 稀释倍数 | 培养板规格 | 包被细节 |
| iPS 培养 | |||||
| 细胞外基质 | iPSC、NGN2 细胞系、 mDA 神经元 | 1.5.7. 和 S2.3. | 1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12 | 1-/12孔板 | 8/0.5 mL/孔；室温孵育1 h |
| NGN2 分化 | |||||
| 多聚-L-鸟氨酸 | NGN2 神经元分化 | 3.1.3. 和 3.2.2. | 0.1 mg/mL；PBS | 1-/96孔板 | 8/0.1 mL/孔；37°C 孵育12 h； PBS 洗涤3次 |
| 层粘连蛋白 | NGN2 神经元分化 | 3.1.3. 和 3.2.2. | 5 μg/mL；PBS | 1-/96孔板 | 8/0.1 mL/孔；37°C 孵育4 h |
| smNPC 生成 | |||||
| 细胞外基质 | smNPC 生成与培养 | S5.6.、S5.9.、 S5.11. | 1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12 | 6孔板 | 1 mL；室温孵育2 h |
| mDA 分化 | |||||
| 细胞外基质 | mDA 分化 | 4.1.2. | 1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12 | 1孔板 | 12 mL；37°C 孵育12 h |
| 多聚-L-鸟氨酸 | mDA 分化 | 4.3.2. 和 4.5.2. | 0.1 mg/mL；PBS | 1-/96孔板 | 12/0.1 mL/孔； 37°C 孵育12 h；PBS 洗涤3次 |
| 层粘连蛋白 | mDA 分化 | 4.3.2. 和 4.5.2. | 10 μg/mL；PBS | 1-/96孔板 | 12/0.1 mL/孔；37°C 孵育12 h |
| 纤连蛋白 | mDA 分化 | 4.3.2. 和 4.5.2. | 2 μg/mL；PBS | 1-/96孔板 | 12/0.1 mL/孔；37°C 孵育12 h |
| *细胞外基质 aliquot 的定义依据该产品分析证书中注明的稀释倍数（以 µL 计）。 | |||||
表1：不同培养板规格对应的细胞接种密度及包被条件。
| 天数 | 试剂 | ||
| 第 0 - 1 天 | 100 nM LDN193189, 10 µM SB431542 | ||
| 第 1 - 3 天 | 100 nM LDN193189, 10 µM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100 ng/mL FGF-8b | ||
| 第 3 - 5 天 | 100 nM LDN193189, 10 µM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100 ng/mL FGF-8b, 3 µM CHIR99021 | ||
| 第 5 - 7 天 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100 ng/mL FGF-8b, 3 µM CHIR99021 | ||
| 第 7 - 9 天 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 µM CHIR99021 | ||
| 第 9 - 11 天 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 µM CHIR99021 | ||
| 第 11 - 13 天 | 3 µM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0.2 mM L-ascorbic acid (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 µM DAPT | ||
| 第 13 - 65 天 | 20 ng/mL BDNF, 0.2 mM L-ascorbic acid (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 µM DAPT | ||
表2：多巴胺能神经元分化过程中添加的小分子化合物。
| 天数 | KSR 培养基 | N2 培养基 | 分化培养基 |
| 第 0 - 1 天 | 100% | 0 | 0 |
| 第 1 - 3 天 | 100% | 0 | 0 |
| 第 3 - 5 天 | 100% | 0 | 0 |
| 第 5 - 7 天 | 75% | 25% | 0 |
| 第 7 - 9 天 | 50% | 50% | 0 |
| 第 9 - 11 天 | 25% | 75% | 0 |
| 第 11 - 13 天 | 0 | 0 | 100% |
| 第 13 - 65 天 | 0 | 0 | 100% |
表3：多巴胺能神经元分化的培养基梯度。
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讨论
我们推出一种集成了成像功能的自动化细胞培养系统，用于标准化人诱导多能干细胞（hiPSC）的培养与神经元分化。由于人为干预极少，实验变异程度低，可确保细胞在分化过程中细胞表型的高度可重复性。基于日程的日程调度器支持实验的组织与并行操作，允许在灵活的时间点开展实验。现有方法可轻松适配，且可不断扩展可用方法的范围。此外，系统兼容多种规格的检测板格式，进一步增强了灵活性。最小化系统由CO2培养箱、机械臂、明场细胞计数仪和液体处理工作站组成，构成进行hiPSC培养与分化所需的基本单元，其成本可被学术研究实验室所接受。将自动化细胞培养系统与用于储存化合物、RNAi文库或CRISPR/Cas9文库的自动化-20 °C存储系统相结合，并集成高内涵/高通量显微镜，可 实现表型筛选的自动化执行。
在本研究中，自动细胞培养系统使用一次性吸头，培养基需手动补充至储液槽中，因此限制了液体处理工作站用于换液及其他培养操作（尤其是过夜操作）的应用。为克服这一限制，可将方法调整为使用金属针头替代一次性吸头，并在安装连接培养基管路与存放在冰箱中的培养基袋之间的管路后，通过加热元件预热新鲜培养基，实现储液槽的自动补充。这将减少因手动更换吸头、补充培养基及交换储液槽所引起的人为干扰。
我们的自动化细胞培养系统具有多项优势。其一是条形码追踪系统。系统中加载的培养板通过唯一的条形码进行识别，该条形码由系统读取并保存，从而可在方法执行期间及之后追踪样本。另一优势是可创建用户特定的项目。在此，可将系统中加载的培养板分配至特定项目，并按批次分组。按批次进行组织可简化对同一批次中所有培养板执行相同操作的过程，因为无需单独选择每个培养板。此外，液体类型编辑器允许针对每次液体转移步骤调整移液速度和高度，以及吸液和分液参数。每个操作过程均记录在日志文件中，以便追溯针对特定培养板或检测板执行了哪些任务。
由人类诱导性多能干细胞（hiPSC）分化而来的神经元及其他细胞类型，是在体外研究特定患者群体中神经退行性疾病机制的有用工具（例如，帕金森病研究中的多巴胺能神经元），并为个性化药物筛选提供了可能。hiPSC的培养非常耗时，需要经过培训的专业人员执行复杂的分化方案，通常仅限于小规模生产。我们将无饲养层的hiPSC培养体系适配至自动化培养系统，并实现了两种神经元分化方案：一种是基于四环素诱导启动子（tet-on）驱动Neurogenin-2（NGN2）过表达的快速皮层神经元分化方案10,11，另一种是基于小分子的长期分化方案，用于生成中脑多巴胺能（mDA）神经元13。手动培养与分化方案在自动化系统中的直接转移与可重复性，使该自动化培养系统极具应用价值。在自动化细胞培养系统中培养的人hiPSC表现出稳定的干细胞形态，并一致表达关键的多能性标志物，且在不同独立实验间具有可重复性。此外，hiPSC培养方案的自动化有利于并行培养和扩增更多数量的细胞系。系统可安排在夜间自动进行汇合度检测，节省了时间，使白天的系统资源可用于用户在实验室期间执行的下游操作步骤（例如，细胞收获或手动重铺用于分化）。当细胞达到用户设定的汇合度阈值时，系统将自动传代并将细胞重铺至自动化细胞培养系统堆栈器中的细胞外基质包被板中。每次传代过程约需70分钟，由一个母板生成四个单孔板，相当于每天可完成20次传代操作。
NGN2 分化方案的自动化已成功实现，能够在不同传代过程中生成均一的神经元细胞群体，其效果与手动分化相当。此外，由于分化速度加快，涉及多个细胞系的大规模筛选研究或包含数千种测试条件/化合物的筛选实验的成本将得以降低。包括活细胞神经突生长测量在内的经济高效且高通量的检测方法可被轻松开发、实施并用作疾病建模的表型读出指标，此前已有研究展示过此类应用14,15,16。因此，我们进一步优化了 NGN2 协议，采用稳定过表达 GFP 的小分子诱导神经前体细胞（smNPC）。smNPC 细胞具有更多优势，包括培养基成本更低（仅为 iPSC 培养成本的三分之一）以及实验扩增所需时间更短。smNPC 的细胞产量比 iPSC 高出 7 至 10 倍。通过完全自动化的成像流程，成功对正在分化的神经元进行了连续数天的监测和成像，无需手动抗体染色或化学标记，从而节省了手动操作（包括成像本身）所需的时间和成本。目前，对 96 孔板中内侧 60 个孔进行成像（每孔拍摄 25 个视野）约需 16 分钟/板，这意味着基于成像的 1000 种化合物筛选实验的数据可在一天内完成采集与分析。未来，该检测方法可用于化合物筛选研究，以挽救神经突生长缺陷。
此外，我们还展示了将一种从诱导多能干细胞（iPSC）生成中脑多巴胺能（mDA）神经元的手动分化方案进行转移。该基于小分子的分化方案耗时65天，由于涉及多次重铺板步骤以及频繁的培养基更换（通常每2天一次），工作量较大，限制了同时生产mDA神经元的iPSC细胞系数量。自动化的mDA分化方案具有显著优势，可将分化规模扩大至数十个iPSC细胞系，最多可同时对30个细胞系进行平行分化。由于分化过程主要依赖于培养基更换，几乎整个分化过程均可 在无人工干预的情况下完成。利用自动化系统的基于日历的调度程序，我们可以根据分化步骤规划培养基更换时间。然而，在处理大量细胞系和培养板时存在一个局限性，即无法实现过夜培养基更换，主要原因在于我们的系统采用一次性吸头，并需人工补充培养基，这一操作需要实验人员在实验室现场完成。为简化培养基更换流程，系统中加载的培养板被分配至特定项目并分批处理，批次大小则根据可用的一次性吸头数量和培养基体积进行调整。如前所述，通过引入可重复使用/可清洗的针头以及实现培养基的自动补充，这一限制可轻易克服。如iPSC所示，细胞的自动传代/重铺板是本自动化细胞培养系统提供的便利功能之一。我们已在分化第25天测试了mDA神经元的自动重铺板。然而，mDA神经元的解离需要比iPSC（8分钟）更长时间（40分钟）的解离酶孵育，导致每个细胞系的自动重铺板过程延长至1小时以上。因此，同一天内完成30个细胞系的自动重铺板变得不可行。通过加快自动重铺板过程中的其他步骤（如板的运输、移液）并改进系统以支持针头和培养基管路的过夜运行，可解决此问题。尽管存在上述不足，我们仍成功将手动方案转移至自动化mDA神经元分化流程，获得了含有大量MAP2（神经元）和TH（mDA神经元）阳性细胞的培养物。
并行分化数十个诱导多能干细胞（iPSC）细胞系对于研究包括帕金森病在内的神经退行性疾病分子机制的项目具有重要意义。然而，如何更快、更少出错且以更低的成本完成任务仍是一个巨大挑战。由于本文所述方案（iPSC、smNPC 和 mDA 神经元）实现了自动化，我们能够在项目中加快进度、降低成本并提高可重复性。涉及数百个患者细胞系的 FOUNDIN-PD 项目（https://www.foundinpd.org/wp/）的发展表明，对自动化细胞培养与分化方案存在迫切需求。我们未来的目标是将手动的三维（3D）细胞培养模型转移至该自动化系统。通过对孔板定义设置进行微小调整并使用适配器，即可兼容适用于 3D 培养的商用或定制孔板以及微流控腔室。此外，引入自动化的无标记成像模型将使我们能够实时追踪神经元生长，并将神经突生长、神经元排列结构及细胞死亡的变化转化为对疾病机制的更深入理解。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者衷心感谢为本研究提供生物材料的患者及其家属。本研究使用的细胞系来自罗格斯大学的NINDS收藏库（ND41865，即iPS#1）以及Tilo Kunath博士的实验室（iPS#2）。本工作部分得到了NOMIS基金会（PH）、RiMod-FTD（欧盟神经退行性疾病研究联合计划，JPND）（PH）、德国神经退行性疾病中心I2A计划（AD）、PD-Strat项目（由ERA-Net ERACoSysMed资助）（PH）以及帕金森病基础数据倡议项目（FOUNDIN-PD）（PH, EB）的支持。FOUNDIN-PD是迈克尔·J·福克斯基金会PATH to PD计划的一部分。作者感谢Steven Finkbeiner和Melanie Cobb（格拉德斯通研究所）在建立手动mDA神经元分化方案方面的贡献，以及Mahomi Suzuki（横河电机株式会社）在神经突生长分析设置中提供的协助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 分销商 | 目录编号 | 稀释 |
| iPSC 多能性标志物 | |||
| 小鼠抗 SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 至 33 |
| 兔抗 Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 到 200 |
| NGN2神经元标志物 | |||
| 小鼠抗 TUBB3 | R &与 D | MAB1195 | 1 到 500 |
| 兔抗 BRN2 | NEB | 12137 | 1 到 1,000 |
| mDA 神经元标志物 | |||
| 鸡抗-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 至 750 |
| 小鼠抗 MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 至 750 |
| 二抗 | |||
| 山羊抗鸡 IgY，Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 至 2,000 |
| 山羊抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 至 2,000 |
| 山羊抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 到 2,000 |
| 山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 至 2,000 |
| 山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 到 2,000 |
| 山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 到 2,000 |
| 细胞核复染 | |||
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 至 8,000 |
| 仪器 | 分销商 | 目录编号 | 描述/应用 |
| 安捷伦 TapeStation 系统 | 安捷伦科技 | 4200 | 自动化电泳 用于DNA和RNA样品 |
| 自动化 -20 °C 储存系统 | Hamilton Storage 技术 | 样本获取管理器 (SAM -20C, 3200 系列) | 试剂储存 |
| 条形码读取器 | 霍尼韦尔 | 条形码读取器 Orbit | 条形码扫描仪 |
| 明场细胞自动培养系统 | Nexcelom | Celigo | 融合度检查和 细胞计数 |
| CellVoyager 7000 | 横河 | CellVoyager 7000 | 自动化共聚焦显微 显微镜 |
| Cytomat 细胞培养系统 | 赛默飞世尔科技 | Cytomat 24 C, CU | 12 层堆栈间距 28 mm， 12 个堆叠器，节距 23 mm （共 456 块培养板） |
| 用于解冻样本的Cytomat | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU （干燥单元） | 2个堆叠器间距28 mm （共42块板） |
| HEPA 过滤器 | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | 由 Hamilton 修改 机器人技术 |
| 液体处理工作站 | Hamilton Robotics | Microlab Star | 通道：8个1毫升，4个5毫升 和 96 通道 MPH |
| 培养基储液槽 | Hamilton Robotics | 188211APE | 培养基/试剂储液槽 |
| 纯水系统 | 威立雅水务 | ELGA PURELAB Classic | 提供纯水 针头清洗站 |
| QuantStudio 12K Flex 实时荧光定量PCR系统 PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | 实时荧光定量PCR仪 |
| 机械臂 | Hamilton Robotics | Rackrunner | 培养板的转运 |
| 转盘 | Hamilton Robotics | 转盘 | 调整培养板方向 |
| 不间断电源 | APC | Smart UPS RT 单元， 10000 VA 电源供应器 | 备用电源供应 |
| VIAFLO-移液器 | Integra | 4500 | 电子移液器 |
| ViiA 7 实时荧光定量 PCR 系统 | Applied Biosystems | 4453545 | 实时荧光定量PCR仪 |
| 材料 | 分销商 | 目录编号 | 注意事项 |
| 1孔培养板（84 cm²）2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
| 6 孔培养板（9.6 cm²）2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC 经氯胺酮处理 |
| 12孔培养板（3.9 cm）2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC 经布比卡因处理 |
| 96孔培养板（0.32 cm²）2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 黑色培养板 |
| 移液提示，50-µL | Hamilton Robotics | 235987 | 50 µL 吸头 |
| 提示，300-µL | Hamilton Robotics | 235985 | 300-µL型吸头 |
| 提示，1000-µL | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-µL型枪头 |
| 吸头，5 mL | Hamilton Robotics | 184022 | 5-mL 吸头 |
| 15 mL 离心管 | Greiner Bio-One | 188271 | 15 mL 离心管 |
| 50-mL 离心管 | Greiner Bio-One | 227261 | 50-mL 离心管 |
| Nalgene 冻存管 2.0 mL | Sigma Aldrich | V5007 | 冻存管 |
| 质粒 | 经销商 | 目录编号 | 注意事项 |
| pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Ron Weiss 惠赠 |
| pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Ron Weiss 惠赠 |
| pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 慢病毒 | Takara Bio | 631983 | |
| 引物 | 序列（正向） | 序列（反向） | 来源 |
| iPSC 多能性 | |||
| OCT4（ID 4505967a1） | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
| NANOG（ID 153945815c3） | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | 引物银行 |
| REX1（ID 89179322c1） | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | 引物银行 |
| NGN2神经元 | |||
| MAP2（货号 87578393c1） | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
| BRN2（ID 380254475c1） | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
| CUX2（编号 291045458c2） | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | 引物银行 |
| NCAM1（ID 336285437c3） | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | 引物银行 |
| SYNAPSIN1（ID 91984783c3） | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
| 中脑多巴胺能（mDA）神经元 | |||
| TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI 引物-BLAST |
| MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCTCA | NCBI 引物-BLAST |
| 管家基因 | |||
| GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI 引物-BLAST |
| OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI 引物-BLAST |
| RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI 引物-BLAST |
| RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC | NCBI 引物-BLAST |
| 培养基与试剂 | 分销商 | 目录编号 | 使用浓度 |
| 包被基质 | |||
| 细胞外基质（Matrigel） | 康宁 | 354277 | 10 μg/mL |
| 纤连蛋白 | 康宁 | 356008 | 2 μg/mL |
| 层粘连蛋白 | Sigma | L2020 | 5 - 10 μg/mL |
| 聚-L-鸟氨酸（PLO） | Sigma | P3655 | 0.1 mg/mL |
| 培养基 | |||
| iPSC 培养基 （Essential 8 Flex 培养基） | Gibco | A2858501 | |
| NGN2神经元 - NGN2培养基 | |||
| 2-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | 0.909 mL（50 µM) |
| B27 补充剂 | Gibco | 12587010 | 10 mL（1%） |
| DMEM/F-12，GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484.75 mL |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL（2 mM） |
| 胰岛素 | Sigma | I9278 | 0.25 mL（2.5 µg/mL |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | 5 mL（0.5%） |
| N2 补充剂 | Gibco | 17502048 | 5 mL（0.5%） |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| mDA 神经元 - SRM 培养基 | |||
| 2-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | 0.5 mL（55 µM) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL（2 mM） |
| Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409.5 mL |
| 敲除血清替代物 （血清替代物） | Gibco | 10828028 | 75 mL（15%） |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | 5 mL（1%） |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | 5 mL（1%） |
| mDA 神经元 - N2 培养基 | |||
| B27 补充剂 | Gibco | 12587010 | 10 mL（2%） |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL（2 mM） |
| N2 补充剂 | Gibco | 17502048 | 5 mL（1%） |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | 475 mL |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | 5 mL（1%） |
| mDA 神经元 - 分化培养基 | |||
| B27 补充剂 | Gibco | 12587010 | 10 mL（2%） |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | 5 mL（1%） |
| NGN2 神经元 - 补充剂 | |||
| 脑源性神经营养因子 (BDNF) | Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
| CHIR99021（CHIR） | R&研发 | 4423/10 | 2 μM |
| 多西环素（dox） | Sigma | D9891 | 2.5 μg/mL |
| 胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| L-抗坏血酸-2-磷酸 镁 (AA2) | Sigma | A8960 | 64 mg/L |
| 神经营养因子-3（NT-3） | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0.5 μM |
| 嘌呤霉素 | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μg/mL |
| Thiazovivin | 默克密理博 | 420220-10MG | 2 μM |
| mDA 神经元 - 补充剂 | |||
| 脑源性神经营养因子 (BDNF) | Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
| CHIR99021（CHIR） | R&研发 | 4423/10 | 3 μM |
| DAPT | Cayman | 13197 | 10 µM |
| 二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP） | Sigma | D0627 | 1 mM |
| 成纤维细胞生长因子8B（FGF-8b） | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
| 胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF) | Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
| L-抗坏血酸（AA1） | Sigma | A4403 | 0.2 mM |
| LDN193189（LDN） | Cayman | 11802 | 100 nM |
| Purmorphamine（Purm） | Cayman | 10009634 | 2 μM |
| 音猬因子/Shh (C24II) N端（SHH） | R&研发 | 1845-SH | 100 ng/mL |
| SB431542（SB） | Cayman | 13031 | 10 μM |
| 转化生长因子类型 ß3 （TGFß3) | R&研发 | 243-B3 | 1 ng/mL |
| Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µM |
| 解离试剂 | |||
| 单细胞解离试剂 （StemPro Accutase） | Gibco | A1110501 | 1x |
| UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Gibco | 11575020 | 0.5 mM |
| RNA提取与cDNA试剂盒 | |||
| RNA 提取试剂盒 | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
| RNA裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Trizol 裂解缓冲液（RNA 裂解缓冲液 |
| 逆转录酶（试剂盒） | 赛默飞世尔科技 | 18080-085 | SuperScript III 逆转录酶 逆转录酶 |
| 软件 | 公司 | 目录编号 | 描述/应用 |
| 细胞培养框架（CCF） （图形用户界面，GUI） | Hamilton Robotics | 定制 | 自动化系统的用户界面 |
| CellPathFinder 软件 （图像分析软件 1） | 横河 | CellPathfinder HCS 软件 | 图像分析工具 |
| CellVoyager 测量系统 | 横河 | 包含在内 CellVoyager 7000 | 显微镜控制 软件 |
| Columbus 软件 （图像分析软件 2） | Perkin Elmer | Columbus | 图像分析工具 |
| 基于云的 qPCR 应用程序 | 赛默飞世尔科技 | 赛默飞云 | 分析软件用于 qRT-PCR 数据 |
| Venus 软件 | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 软件 | 控制软件用于 自动化系统 |
参考文献
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- Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
- Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology. 9 (1), 180177(2019).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).
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- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific reports. 5, 16647(2015).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755(2015).
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