大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的分离与培养

摘要

本文介绍了一种结合全骨髓贴壁法与流式细胞术分选的方法，用于分离、培养、分选和鉴定大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞。

摘要

本文介绍了一种高效分离和体外培养下颌骨骨髓间充质干细胞（mBMSCs）的方法，可快速获得大量高质量细胞以满足实验需求。由于mBMSCs具有优异的自我更新能力和多向分化潜能，未来有望作为组织工程细胞广泛应用于颅面疾病治疗及颅颌面组织再生。因此，大量获取mBMSCs具有重要意义。

本研究中，从下颌骨冲洗获取骨髓，并通过全骨髓贴壁培养法分离原代小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）。进一步通过荧光细胞分选技术纯化获得CD29⁺CD90⁺CD45⁻表型的mBMSCs。实验采用纯化后的第二代mBMSCs进行后续研究，该细胞具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的潜能。利用该体外模型，可获得大量具有增殖能力的mBMSCs，有助于研究mBMSCs的生物学特性、对微环境的响应及其他相关应用。

引言

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一类来源于骨髓的非造血干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能^1,2,3,4。自发现以来，BMSCs 一直被认为是骨组织工程与再生医学的理想候选细胞。多年来，髂嵴或胫骨、股骨等长骨一直是颅颌面再生研究中最常用的 BMSCs 来源。然而，口腔颌面部的 BMSCs（如下颌骨 BMSCs，mBMSCs）与长骨来源的 BMSCs 存在一些差异，例如胚胎起源和发展模式不同。下颌骨起源于外胚层神经嵴细胞，并经历膜内成骨过程；而中轴骨和附肢骨骼则起源于中胚层，经历软骨内成骨过程。此外，临床观察和动物实验研究持续表明，口腔颌面部 BMSCs 与髂嵴 BMSCs 在功能上存在差异^5,6,7,8。已有报道显示，来源于颅颌面骨（如下颌骨、上颌骨和牙槽骨）的 BMSCs 在增殖能力、生命周期和分化潜能方面优于中轴骨和附肢骨骼来源的 BMSCs⁹。因此，mBMSCs 被认为是未来治疗 cherubism（天使样面容综合征）、颌骨肿瘤、颌骨骨质疏松及牙周组织缺损等颅颌面疾病更理想的细胞资源^10,11,12。为了在临床前实验中充分评估其治疗潜力，建立一种快速体外分离与培养 mBMSCs 的方法至关重要。

本研究旨在通过全骨髓贴壁法结合流式细胞术分选，获得纯化的下颌骨骨髓间充质干细胞（mBMSCs）。通过显微计算机断层扫描（Micro-CT）和组织学切片清晰观察到大鼠下颌骨的解剖形态，结果显示下颌骨松质骨位于切牙髓腔与牙槽骨之间。通过冲洗松质骨获取下颌骨骨髓细胞，但以此方法培养的细胞并非纯化的mBMSCs，可能包含多种潜能未明、谱系多样的细胞类型，如下颌骨来源细胞、脂肪细胞和内皮细胞^13,14。因此，后续的细胞纯化步骤尤为重要。流式细胞术通过识别细胞表面蛋白组合对细胞进行筛选，已被广泛应用于间充质干细胞的富集。该方法的主要优势在于可获得高度均一的细胞群体，但其无法判断细胞活性，且可能导致细胞得率较低。本研究中，将通过全骨髓贴壁法获得的P0代mBMSCs进一步进行流式细胞术分选，以获得高纯度、强增殖能力的mBMSCs。

本研究介绍了一种利用全骨髓贴壁法结合流式细胞术分选来分离、培养和诱导大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的可重复且可靠的实验方案。该方法简便可靠，可供相关领域的研究人员使用。

方案

本文中所有动物实验程序均经上海交通大学医学院附属第九人民医院动物护理委员会批准。

1. 准备

1. 实验使用两只5周龄的雄性Sprague Dawley大鼠。
2. 将所有器械（包括持针器、镊子和剪刀）在高温下灭菌，或浸入75%乙醇中10分钟进行消毒。
   注意：乙醇浸泡时间不宜过长，以免造成细胞损伤。
3. 提前配制培养基，其成分见表1。按以下说明为每种培养基添加补充成分。
   1. α-MEM培养基（含10% FBS）的配制：在最低必需培养基α（α-MEM）中加入10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。
   2. 成骨分化培养基的配制：在成骨分化基础培养基中加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、0.20%抗坏血酸、1% β-甘油磷酸钠和0.01%地塞米松。
   3. 成骨诱导培养基的配制：将70%的α-MEM培养基（含10% FBS）与30%的成骨分化培养基混合。
   4. 脂肪分化培养基A的配制：在脂肪分化基础培养基中加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、0.20%胰岛素、0.10%异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）、0.10%罗格列酮和0.01%地塞米松。
   5. 脂肪分化培养基B的配制：在脂肪分化基础培养基中加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和0.20%胰岛素。
   6. 软骨分化培养基的配制：在软骨分化基础培养基中加入0.01%地塞米松、0.30%抗坏血酸、1% ITS、0.10%丙酮酸钠、0.10%脯氨酸和1% TGF-β3。
      注意：成骨分化培养基配置后必须在一个月内用完。配置后的软骨分化培养基有效时间为12小时。

2. 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

注意：所有实验操作应尽可能在冰上进行，以保持细胞活性。

1. 大鼠下颌骨的采集
   1. 通过 CO₂ 窒息法处死两只5周龄雄性Sprague Dawley大鼠。在继续实验前，确保动物呼吸已完全停止。
   2. 将大鼠放入盛有75%乙醇的烧杯中冲洗3分钟。
   3. 将大鼠置于洁净的生物安全柜中以采集下颌骨。
      注意：使用前需用紫外线照射生物安全柜30分钟进行灭菌。
   4. 将大鼠仰卧放置。从双侧口角沿下颌骨后缘切开皮肤及颊肌，下颌骨是唯一带有下门齿的可动骨骼。
      注意：建议在口角两侧各做2 cm切口，以获得清晰的操作视野。
   5. 用双侧拇指分别将上颌和下颌门齿向相反方向推压，以张开大鼠口腔，暴露附着于下颌骨的下颌牙齿。
   6. 完全分离附着于喙突及下颌骨下缘的颊肌和肌腱。
      注意：此步骤中由于肌肉张力消失，可观察到下颌骨活动度增加。
   7. 按压下颌后牙并向后下方旋转，直至双侧髁突清晰暴露。
      注意：此步骤旨在人为最大程度地张开大鼠口腔，使髁突脱位。下颌骨通过双侧髁突与颅骨相连，因此暴露髁突即可实现下颌骨与颅骨的分离。
   8. 将下颌骨体从颅骨上分离。
   9. 用湿润纱布清除骨表面附着的软组织。
   10. 将骨骼置于盛有预冷的最低必需培养基-α（α-MEM）或磷酸盐缓冲液（PBS）的10 cm无菌玻璃皿中，并置于冰上以维持细胞活性。
2. mBMSCs的分离与培养
   1. 从下颌骨体上沿第一磨牙近中缘切除前段骨组织，再沿第三磨牙远中缘去除包含喙突和髁突的下颌支，以暴露骨髓腔。
   2. 在10 cm无菌玻璃皿中加入10 mL α-MEM（含10% FBS）。
   3. 用1 mL注射器吸取α-MEM培养基，将针头插入骨髓腔，反复冲洗骨髓至玻璃皿中。分别从骨的近中和远中两侧至少各冲洗3次，直至骨骼变白。
      注意：此为最关键步骤，因大鼠下颌骨骨髓腔不如长骨明显，针头插入位置需凭经验确定。所有上述样品均应置于冰上以维持细胞活性，操作时间不得超过2小时。
   4. 将含有冲洗细胞的培养基转移至15 mL离心管中，在4 °C条件下以800 x g离心5分钟，弃去上清液。
   5. 用3 mL α-MEM（含10% FBS）重悬细胞，接种至新的10 cm培养皿中，并在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育。
   6. 在培养第3天观察细胞形态变化及生长情况，去除含有非贴壁细胞和组织碎片的培养基，轻柔加入10 mL新鲜α-MEM（含10% FBS）。
   7. 培养7天后，P0代mBMSCs达到70%至80%融合度。
3. 流式细胞分选
   注意：P0代mBMSCs通过流式细胞分选进行表型鉴定和初步纯化。
   1. 吸除并弃去培养基，用PBS洗涤培养皿，随后弃去PBS。
   2. 向培养皿中加入1 mL含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶，于37 °C消化5分钟，然后加入2 mL α-MEM（含10% FBS）终止反应。
   3. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，以800 x g离心5分钟。
   4. 离心后用120 μL PBS（含10% FBS）重悬细胞。
   5. 在4 °C条件下，用1 μL抗CD16/CD32抗体封闭细胞悬液15分钟。
   6. 将100 µL细胞悬液转移至新的微量离心管中，在避光条件下于4 °C用PE标记的抗CD45抗体、FITC标记的抗CD90抗体以及APC标记的抗CD29抗体染色1小时^13,15。本实验所用抗体浓度见表2。另取20 µL细胞悬液作为未染色阴性对照。
   7. 随后以800 x g离心5分钟，弃去上清液，用0.5 mL PBS（含10% FBS）重悬细胞。
   8. 分析前加入10 μL浓度为0.01 mg/mL的DAPI染色10分钟。
   9. 使用置于离心管上的40 nm滤器过滤细胞。
   10. 在荧光激活细胞分选仪上分析细胞。设门策略如下：首先通过圈选DAPI^-细胞排除死细胞，然后在活细胞中圈选CD29⁺CD90⁺CD45^-细胞作为目标mBMSCs。
   11. 将分选出的CD29⁺CD90⁺CD45^-细胞收集至预先加入3 mL α-MEM（含10% FBS）的15 mL离心管中。
   12. 以800 x g离心5分钟，弃去收集液，加入1 mL新鲜α-MEM（含10% FBS）重悬细胞，随后接种至6 cm培养皿中。

3. 克隆形成能力

注意：此步骤用于检测 mBMSCs 的分裂能力。¹⁵

1. 选择第二代mBMSCs（P2）用于本实验。当细胞融合度达到80%至90%时，将细胞以系列梯度浓度重新接种于6孔板中，以评估其克隆增殖能力。
   注：建议每孔接种细胞数梯度设置为1 × 10² 至 1 × 10³ 个，但不同人源或动物来源细胞系的最终稀释比例需根据经验确定。
2. 将细胞在α-MEM（含10% FBS）培养基中培养约两周，直至在光学显微镜下可观察到较多的集落形成单位。每3天更换一次培养基。
3. 吸去并弃除培养基，用PBS洗涤孔板两次，每次5分钟。随后向每孔加入4%多聚甲醛溶液，固定至少10分钟。
4. 去除多聚甲醛溶液，用PBS冲洗孔板两次。
5. 用结晶紫染色液对细胞进行染色，并在37 °C孵育约10分钟。
   注：染色时间可根据所需染色深浅适当调整，直至达到理想着色效果。
6. 移除染色液，用蒸馏水洗涤样本以终止反应。
7. 在体视显微镜下成像，并计数由至少50个细胞组成的分散细胞集落。

4. 小鼠骨髓间充质干细胞的多向分化

注意：除非另有说明，后续实验均使用第2代mBMSCs。

1. 小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）的成骨诱导
   1. 按照上述方法消化 mBMSCs。以 2.5 × 10⁵/cm² 的密度将细胞接种于 12 孔板中，每孔加入 1 mL α-MEM（含 10% FBS）。
   2. 当细胞融合度达到 60–70% 时，更换为 30% 成骨诱导培养基。以 α-MEM（含 10% FBS）培养的细胞作为阴性对照，每 2 天更换一次培养基。
      注：在成骨过程中出现大量钙结节后，建议改为每 2 天更换一半体积的培养基，以防止成骨细胞脱落。
   3. 培养 7 天后，通过碱性磷酸酶染色评估这些细胞的钙化情况^16,17。
   4. 弃去培养基，用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟。每孔加入 1 mL PBS 洗涤 3 分钟，重复两次。
   5. 随后加入碱性磷酸酶染色液对细胞进行染色，并在 37 °C 孵育 10–30 分钟。
      注：若需获得理想显色效果，可在室温下孵育过夜。
   6. 用蒸馏水洗涤各孔以终止反应。在光学显微镜下拍照观察。红色颗粒代表碱性磷酸酶（ALP）活性。
   7. 将剩余细胞继续培养 7 天后，进行茜素红染色以评估细胞的矿化能力。
   8. 细胞固定 10 分钟后，用 0.5% 茜素红染色液染色^16,18。染色 3–5 分钟后用蒸馏水终止显色反应。
      注：可根据显色情况适当延长反应时间。
   9. 最后将培养板置于光学显微镜下观察成骨染色效果；红色结节表示细胞中的钙盐沉积。
2. 小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）的成脂诱导
   1. 按照上述方法将第 2 代（P2）mBMSCs 接种于 12 孔板中。
   2. 当细胞融合度达到 90% 时，使用成脂分化培养基 A 进行培养。以 α-MEM 培养基（含 10% FBS）培养的细胞作为阴性对照。
   3. 诱导 2 天后，吸弃孔内培养基 A，每孔加入 1 mL 成脂分化培养基 B。
   4. 1 天后，移除培养基 B，并重新加入培养基 A 开始下一轮循环。交替使用培养基 A 和 B 进行培养。
   5. 交替使用分化培养基 A 和 B 共 3 个循环后，通过油红 O 染色检测这些细胞的成脂分化情况^16,18。
      注：额外使用分化培养基 B 培养 2 至 3 天后，可观察到大量圆形且较大的脂滴。
   6. 弃去培养基，用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟，随后用 PBS 洗涤细胞。
   7. 加入油红 O 染色液对细胞进行染色，并在 37 °C 孵育约 3 分钟。
   8. 移除染色液，用蒸馏水洗涤各孔。
   9. 在光学显微镜下观察成脂分化情况。
3. 小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）的成软骨诱导
   1. 以 5 × 10⁵/cm² 的密度将第 2 代（P2）mBMSCs 接种于 15 mL 离心管中。
   2. 在 300 x g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液。
   3. 用 0.5 mL 成软骨分化培养基重悬细胞，在 300 x g 条件下再次离心 5 分钟。
   4. 松开离心管盖子，置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育。每 2 天更换一次培养基。
      注：细胞在 24 小时后开始形成细胞团。建议在前 48 小时内不要移动离心管。换液时注意避免吸走细胞团。
   5. 诱导 21 天后，用 4% 多聚甲醛固定细胞团，随后进行脱水、石蜡包埋和切片。
   6. 切片经脱蜡和水化后，浸入阿利新蓝染色液中染色至少 15 分钟^18,19,20,21，然后用蒸馏水洗涤以终止反应。在光学显微镜下拍照记录。
   7. 进行 II 型胶原免疫荧光染色时，请按以下步骤操作：
      1. 脱蜡和水化后，将切片在 37 °C 下与 5 µg/mL 蛋白酶 K 孵育 15 分钟。
      2. 将切片在封闭缓冲液中 37 °C 孵育 1 小时。
      3. 在 200 µL 封闭缓冲液中加入 1 µL II 型胶原抗体，滴加至切片上，并在 4 °C 下孵育过夜。
      4. 次日，用 PBS 洗涤切片两次，然后在 37 °C 下与二抗孵育 1 小时。
      5. 将切片与 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育 10 分钟。
   8. 在荧光显微镜下对每张切片拍照观察。

5. 实时荧光定量 PCR

1. 使用基于异硫氰酸胍的市售试剂从mBMSCs中提取总RNA。
2. 利用市售试剂盒将RNA逆转录为互补DNA。逆转录反应条件如下：65 °C 反应5 min，37 °C 反应15 min，85 °C 反应15 s。
3. 采用表3中所列引物进行实时PCR，检测成骨和成脂特异性基因。PCR扩增程序如下：95 °C 预变性5 min，随后进行40个循环：95 °C 变性5 s，60 °C 退火30 s。

结果

采用本方案，在初次培养后的第三天，大部分细胞已贴壁。通常在额外培养3至4天后，细胞融合度达到70%至80%（图1B）。通过荧光细胞分选，分离出DAPI^-CD29⁺CD90⁺CD45⁻的小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）^18,22，其在P0代细胞中约占81.1%（图1C）。

将P2代mBMSCs以每孔100个细胞的密度接种于6孔板中培养一周后，观察到大量集落形成单位，表明mBMSCs具有显著的集落形成能力（图1D）。

为评估多向分化能力，将小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）分别在12孔板中诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。mBMSCs表现出...

讨论

本方案描述了一种通过结合全骨髓贴壁法和荧光细胞分选技术从大鼠下颌骨体外分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法，该方法简单可靠，可获得具有强增殖能力和分化潜能的mBMSCs。该方法可通过流式细胞分选对mBMSCs进行初步纯化，但如果对细胞均一性有更高要求，则可能需要采用更精确的纯化方法。

目前，分离小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）主要有四种技术，包括全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、荧光细胞分选法和磁珠激活细胞分选法²²。全骨髓贴壁法和密度梯度离心法是最常用且操作简便的方法，可在较短时间内获得mBMSCs，但其主要缺点是所获得的细胞纯度较低。后两种方法可通过免疫学技术分离出高纯度的mBMSCs，但存在成本高、耗时长以及细胞活性受损等不足。本研究结合了全骨髓贴壁法与荧光细胞分选法的优点，以期在较短时间内获得足量且具有增殖能力的mBMSCs。

毫无疑问，本方案中最关键的步骤之一是大鼠下颌骨的解剖，这与中轴骨和附肢骨的解剖有显著不同。要获得完整的样本，必须充分了解大鼠下颌骨的解剖结构。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA(1X)	Gibco	25200072
10 cm 培养皿	Corning
acutenaculum
成脂分化培养基	Cyagen Biosciences Inc.	MUBMX-90031
阿利新蓝	碧云天生物技术
茜素红	Sigma-Aldrich	A5533
碱性磷酸酶显色试剂盒	碧云天生物技术	C3206
α-最低必需培养基	GE Healthcare HyClone 细胞培养	SH30265.01B
抗胶原蛋白II兔多克隆抗体	Abcam	ab34712
抗CD16/CD32抗体
含DAPI的抗荧光淬灭封片剂	碧云天生物技术	P0131
APC标记抗小鼠/大鼠CD29抗体	biolegend inc	102215
生物安全柜	Esco	AC2-4S8-CN
CD45单克隆抗体（OX1），PE，eBioscience	Invitrogen	12-0461-82
CD90.1（Thy-1.1）单克隆抗体（HIS51），FITC，eBioscience	Invitrogen	11-0900-85
离心机	cence	L500
成软骨分化培养基	cyagen biosciences inc.
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	LSM880
Countess II FL 自动细胞计数仪	Invitrogen	AMQAF1000
结晶紫染色液	碧云天生物技术	C0121
胎牛血清	GE Healthcare HyClone 细胞培养	SH30084.03
山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488）	abcam	ab150077
培养箱	Esco	CCL-170B-8
倒置显微镜	olympus	CKX53
Magzol试剂（Trizol试剂）	Magen
微量移液器	Eppendorf
油红O
成骨分化培养基	cyagen biosciences inc.	MUBMX-90021
青霉素-链霉素	Gibco	15070063
磷酸盐缓冲液(1X)	Gibco	20012027
PrimeScript RT 主混合液	TakaRa Bio Inc	RR036A
蛋白酶K	Sigma-Aldrich	P6556
QuickBlock 封闭缓冲液	碧云天生物技术	P0260
剪刀
SYBR1 预混液	TakaRa Bio Inc
甲苯胺蓝	碧云天生物技术
台盼蓝溶液，0.4%	Gibco	15250061