防御性行为反应取决于威胁的强度、接近程度以及暴露的情境。基于这些因素，我们建立了一种经典条件反射范式，可在单个受试个体内引发条件性僵直与逃跑行为之间的明显转换。该模型对于理解焦虑症、恐慌症及创伤后应激障碍相关病理机制至关重要。
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摘要
摘要
恐惧和焦虑相关行为对生物体的生存具有重要意义。然而，对感知威胁产生过度的防御反应是多种焦虑障碍的典型特征，而这类障碍是美国最普遍的精神疾病形式。揭示介导防御行为的神经生物学机制，将有助于开发新型治疗干预手段。经典条件性恐惧训练是一种广泛使用的实验室范式，用于研究与恐惧相关的学习与记忆过程。传统经典条件性恐惧训练范式的一个主要局限在于，仅监测一种防御行为——僵直反应（freezing）。我们近期开发了一种改良的经典条件性恐惧训练范式，可在同一受试个体中同时研究条件性僵直和逃跑（亦称逃避）行为。该模型采用强度更高的足底电击，并增加条件刺激与非条件刺激之间的配对次数。此外，该条件性逃跑范式使用纯音和白噪声听觉刺激按序列呈现作为条件刺激。在此范式中完成条件训练后，小鼠在听到纯音刺激时表现出僵直行为，而在白噪声期间则出现逃跑反应。该条件化模型可用于研究为生存所必需的行为反应之间快速而灵活转换的机制。
引言
恐惧是对即时威胁的一种在进化上保守的适应性反应1,2。尽管生物体对威胁具有先天的防御反应，但通过学习形成的关联对于引发针对预示危险的刺激产生适当的防御反应至关重要3。调控防御反应的脑回路功能失调可能导致与多种致残性焦虑障碍相关的适应不良反应，例如创伤后应激障碍（PTSD）、惊恐障碍4和特定恐惧症5,6。在美国，焦虑障碍在成年人中的患病率为19.1%，在青少年中为31.9%7,8。这些疾病对个体的日常生活造成极大负担，并对其生活质量产生负面影响。
在过去的几十年中，经典条件化恐惧训练作为一种强大的模型系统，极大地增进了人们对恐惧相关学习与记忆背后神经机制的理解9,10,11。经典条件化恐惧训练包括将条件刺激（CS，例如听觉刺激）与厌恶的非条件刺激（US；例如足部电击）进行配对12。由于“僵直”（freezing）是标准经典条件化范式中主要诱发并被测量的行为，因此对逃逸/逃跑反应等主动防御行为的神经调控机制仍知之甚少。先前研究表明，不同形式的防御行为（如逃跑）的产生取决于威胁的强度、距离和所处情境13,14。研究大脑如何调控不同类型防御行为，可能显著促进我们对恐惧与焦虑障碍中异常神经过程的理解。
为应对这一关键需求，我们开发了一种改良的巴甫洛夫条件反射范式，该范式不仅能引发动物的僵直反应，还能引发逃跑和跳跃行为15。在此范式中，小鼠接受一种序列复合刺激（SCS），即先呈现纯音，随后呈现白噪声。在连续两天将该SCS与强烈的足部电击配对后，小鼠在听到纯音时表现出僵直反应，而在白噪声期间则表现出逃跑行为。条件化的僵直与逃跑行为之间的转换迅速且稳定。有趣的是，只有当白噪声条件刺激（CS）在先前施加电击的相同环境中（即条件化环境）呈现时，小鼠才会表现出逃跑行为；而在中性环境中则不会出现该行为。相反，在中性环境中，僵直反应占主导地位，且对白噪声的僵直反应显著高于对纯音的反应。这一现象与传统威胁条件反射范式中所发现的环境在调节防御反应强度以及恐惧相关学习与记忆中的调控作用一致16,17。该模型实现了在同一受试个体中对多种防御行为进行直接、基于环境特异性的比较。
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方案
以下步骤/操作均在获得机构动物护理和使用委员会批准后，依照机构指南进行。 &杜兰大学动物使用委员会
1. 小鼠的准备
- 使用3至5个月大的成年雄性和/或雌性小鼠。本研究中使用了来自杰克逊实验室（Jackson Laboratory）的雄性C57BL/6J小鼠，但也可选用其他可靠供应商提供的任何小鼠品系。
- 至少在实验开始前一周，将所有小鼠单独饲养，并在整个研究期间保持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。为小鼠提供 随意摄取 食物和水的获取
- 在光照周期内进行所有行为学实验。同一实验组的所有实验环节应在每天的相同时间进行。例如，若第1天的实验于上午9点开始，则此后应持续在该时间开始实验，直至实验结束。
2. 研究材料的准备
- 实验环境
- 选择两种不同的环境进行实验。
- 使用一个由透明有机玻璃制成的圆柱形实验箱作为环境A（直径30 cm），底部为光滑的有机玻璃平面。实验箱的高度应足够防止动物逃脱（至少30 cm高）。
- 环境B使用一个矩形围栏（25 cm × 30 cm），底部为通电网格，用于传递交流电足底电击。该实验箱的高度非常关键，应至少为35 cm。或者可使用透明顶盖（需确保视频可透过该材料正常记录）。
注意：应使用壁面光滑的实验箱，以便于清洁。 - 使用不同的清洁液清洁不同环境。例如，用1%乙酸清洁环境A，用70%乙醇清洁环境B。在开始第一次实验前、每只小鼠测试之间以及当天所有实验结束后均需清洁实验箱。这是为了彻底清除前一只小鼠留下的嗅觉线索。彻底清洁还有助于防止尿液在电击网格上结垢，以免影响条件化实验的效果。
注意：清洁液本身也构成嗅觉线索，因此每种特定环境应始终使用相同的清洁液。 - 在相应实验阶段，将环境A或环境B放置于隔音箱内。
- 声音发生器
- 在实验箱上方安装扬声器，以传递强度为75 dB的听觉刺激。
- 使用可编程声音发生器，按照预设时间程序生成听觉刺激。7.5 kHz纯音是一种正弦波形的声音，而白噪声则是在不同频率（范围为1–20,000 Hz）上具有相等强度的随机信号。
- 使用TTL脉冲精确控制听觉刺激和电击信号的时间传递。
注意：在开始实验前，应使用分贝计测量每个实验箱内安装扬声器的声音输出强度。
- 电击装置：将电击器连接至底部的电网，用于传递0.9 mA的交流电击。通过计算机程序设定电击的频率、起始时间和持续时间。每次条件刺激（SCS）结束时给予一次持续1秒的电击刺激，每个条件化训练阶段共进行五次条件刺激-电击配对。
3. 计算机程序与视频追踪的准备
- 使用软件编程生成行为学实验方案。
- 在程序中定义序列复合刺激（SCS）。该刺激由一个持续10秒的纯音（每个脉冲持续500毫秒，频率为7.5 kHz，刺激速率为1 Hz）和一个持续10秒的白噪声（脉冲持续500毫秒，刺激速率为1 Hz）依次呈现组成。
- 为每次试验后呈现的试验间间隔（ITI）设置伪随机序列。
- 在研究过程中，将所有小鼠行为录制为视频，以便后续分析。
注意：市售的恐惧条件反射实验箱可能未配备顶部摄像头用于记录动物行为。这一点非常重要，因为所录制的视频将用于计算动物的水平 运动、速度以及总移动距离。 - 设置软件追踪参数时，将测试小鼠放入各个相关环境中，调整轮廓追踪灵敏度，并定义重心位置，以确保获取可靠的相对位置数据。此外，需定义受试动物可进入的整个环境区域。
注意：在不同环境中调整轮廓大小至关重要，因为不同环境的亮度变化会影响轮廓的大小。 - 利用已知的实验箱尺寸和摄像头的像素分辨率，确定一个校准系数，用于 计算速度（cm/s）。
- 将数据采集计算机的时间戳事件与实际发生时间进行同步。
4. 行为实验
- 打开所有设备：计算机、恐惧条件反射箱控制器、刺激器、视频和时间戳记录软件。确保按照正确的顺序开启仪器。
- 检查所有功能，包括声音、白噪声和电击传递，并设置系统以进行数据采集。
- 将动物从饲养室转移至适应室，使其在该环境中适应至少10分钟。
- 将动物从饲养笼中取出，轻轻放入相应的环境中，然后立即启动计算机程序。
注意：可通过TTL脉冲介导的激活，同时同步启动恐惧条件化系统以及数据采集（时间戳、小鼠轨迹跟踪和视频记录）软件。 - 预处理/预先暴露
- 第1天，将受试对象放入情境A（中性情境）中，使其在实验箱内适应3分钟（基线期），随后给予4次条件性声音刺激（SCS），每次持续20秒（总共4次）图1A-1B).
- 保持 90 秒平均伪随机 ITI （范围为80-100秒）。每次预暴露阶段的总持续时间为590秒。
- 恐惧条件反射
- 第2天和第3天，将受试对象放入情境B中。经过3分钟的基础期后，给予受试对象5次条件性声音刺激（SCS）与1秒、0.9 mA交流足底电击同时终止的配对刺激。
- 保持平均120秒的伪随机刺激间间隔（ITI，范围90-150秒）。每次条件化训练持续总时长为820秒。图1A).
- 根据实验目的，在第4天对小鼠进行记忆召回测试（见步骤4.7）或恐惧消退实验（见步骤4.8）。
- 恐惧记忆的提取（用于测试情境依赖性）
- 第4天，将受试对象放入情境A中。在3分钟基线期后，于590秒内给予4次无足底电击的条件性刺激（SCS）试验。
- 保持90秒的平均伪随机ITI（范围80-100秒）。
- 恐惧消退
- 第4天，将受试对象放入情境B中。在3分钟基线期后，于1910秒内呈现16次条件性声音刺激（SCS）而不伴随足底电击。
- 保持90秒的平均伪随机刺激间间隔（ITI）（范围为60-120秒）。
- 将动物放回其饲养笼，并对所有动物重复该操作。
5. 行为的量化
- 由一名对实验条件设盲的观察者使用自动冻结检测器进行阈值设定，随后通过逐帧分析像素变化，对录制的视频中动物的冻结行为进行评分。
注意：也可使用其他软件包，结合双摄像头系统自动计算冻结行为。此外，观察者亦可手动对冻结行为进行评分。 - 将冻结定义为除呼吸所必需的运动外，身体完全停止活动至少持续 1 s。
- 当动物四肢全部离开地面，产生垂直和/或水平移动时，记为一次跳跃行为。
- 导出包含冻结、跳跃及事件标记的标注文件。
- 从指定时间段内（例如每次试验中的前 SCS 期、声音刺激期和白噪声期，各持续 10 s）提取相关事件（冻结和跳跃）。
- 利用电子表格中提取的事件起止时间，通过结束时间减去开始时间，计算各试验阶段中冻结的持续时间（单位：s）。
- 将各次试验的冻结持续时间汇总，按单次试验或每日为单位呈现数据。
注意：根据研究目的，飞行或冻结行为的评分和计算可基于实验会话中的任意试验或时间段进行。 - 统计特定试验时间段内的跳跃总次数。
- 从逐帧追踪小鼠重心在 X-Y 轴上的坐标变化所生成的文件中提取数据，并计算小鼠的运动速度（cm/s）。
注意：速度数据可能以 cm/s 或 pixel/s 形式存在。请根据该测试视频中定义的 inch/pixel 或 cm/pixel 值，将 pixel/s 转换为 cm/s（详见第 3.6 节）。 - 在提取动物逐帧运动的速度数据后，根据视频帧率（建议为 30 帧/s），计算特定帧区间内的平均速度（将起始和结束时间（s）乘以 30，得到起始和结束帧号）。
- 通过将每次 SCS 期间的平均速度除以前 SCS 期 10 s 内的平均速度（基线，BL），再为每次逃逸跳跃加 1 分，计算飞行得分（speedCS/speedBL + 跳跃次数）。因此，飞行得分为 1 表示与前 SCS 期相比，飞行行为无变化。
- 可选地，可对手动视频进行其他行为的评分，如直立（rearing）和理毛（grooming）。
6. 统计分析
- 使用统计分析软件分析数据的统计学显著性。对于所有检验，统计学显著性的定义为 P<0.05。
- 使用 Shapiro-Wilk 正态性检验（α=0.05）检查数据是否符合正态分布。
- 为检验线索效应，采用适当的参数检验（配对 t 检验）或非参数检验（Wilcoxon 符号秩检验）进行成对比较。
- 为评估因素间的双向交互作用（线索 × 试验），进行双向方差分析（ANOVA），随后进行事后检验（例如 Bonferroni 多重比较检验 / Tukey 检验）。
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结果
如图所示（图1A实验流程包括预暴露（第1天），随后进行恐惧条件化（第2天和第3天），接着进行消退或提取测试（第4天）。
在暴露前（第1天）阶段，条件性刺激（SCS）的呈现未引发小鼠的逃跑或僵直反应（图2A-2B）。条件化阶段（第2天和第3天）的行为分析显示，与SCS前相比，SCS中的声音成分显著增强了小鼠的僵直反应（图2B,2E）。各阶段间的逃跑评分发生显著变化（第1天至第3天，n = 20；图2A）。小鼠对白噪声提示表现出更高的运动速度和更多的跳跃行为，因此其逃跑评分高于对声音提示的反应（图2C-2D）。小鼠表现出明显的防御行为转变——在声音提示期间逃跑评分较低，而在白噪声提示期间逃跑...
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讨论
所述的声音和电击参数是本方案的重要组成部分。因此，在开始实验之前，必须对电击幅度和声压级进行测试。恐惧条件化研究通常采用70-80 dB的声压级和0.1-1 mA的电击强度18；因此，所描述的参数处于传统恐惧条件化范式的范围内。在之前一项仅使用条件刺激（无足底电击）的对照实验中，我们未观察到小鼠出现逃跑或僵直反应，表明当按照所述方式呈现时，听觉刺激本身并不具有厌恶性15。将白噪声的dB水平提高至80 dB以上可能会引发先天性厌恶反应。然而，以75 dB强度呈现的噪声刺激不会引起小鼠行为活动受抑制形式的应激反应19。
构成序列条件刺激（SCS）的听觉刺激必须经过仔细选择。在我们之前的研究中，我们发现与纯音刺激相比，使用白噪声进行单次条件刺激能诱导出更高的飞行得分15。这说明了刺激显著性在本实验方案中的重要性20。然而，最近一项研究表明，当采用相反顺...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由路易斯安那州校董会通过校董会支持基金（LEQSF(2018-21)-RD-A-17）资助 美国国家心理健康研究所 美国国立卫生研究院资助项目编号R01MH122561。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 中性环境 | Plexiglass 圆柱体 30 X 30 cm | ||
| 恐惧条件反射箱 | Med Associates, Inc. | VFC-008 | 尺寸为 25 X 30 X 35 cm |
| 音频发生器 | Med Associates, Inc. | ANL-926 | |
| 电击装置 | Med Associates Inc. | ENV-414S | 不锈钢栅格 |
| 扬声器 | Med Associates, Inc. | ENV-224AM | 适用于纯音和白噪声 |
| C57/BL6J 小鼠 | Jackson 实验室，美国 | 664 | 年龄为 3–5 个月 |
| Cineplex 软件（Editor/Studio） | Plexon | CinePlex Studio v3.8.0 | 用于视频追踪和行为评分分析 |
| MedPC 软件 V | Med Associates, Inc. | SOF-736 | |
| Neuroexplorer | Plexon | 用于提取在 PlexonEditor 中评分的僵直数据 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software, Inc. | 版本 8 | 统计分析软件 |
参考文献
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