本方案的总体目标是指导如何测定自然暴露于恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）感染的个体血清或血浆中抗体介导调理并诱导吞噬细胞吞噬寄生虫感染红细胞（IEs）的能力。
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本文内容
摘要
摘要
该方案描述了如何建立并运行基于流式细胞术的吞噬作用检测 恶性疟原虫-被自然获得的特异性针对VAR2CSA的IgG抗体调理的感染性红细胞（IEs）。VAR2CSA是介导IEs在胎盘中选择性滞留的疟原虫抗原，这种滞留可导致孕妇发生一种严重的疟疾形式，称为胎盘疟疾（PM）。对PM的保护作用由特异性针对VAR2CSA的抗体介导，这些抗体被认为通过抑制IEs在胎盘中的滞留和/或通过调理IEs以促进其被吞噬作用来发挥功能。该检测采用经过选择的晚期同步化IEs 体外 表达 VAR2CSA、来自具有天然获得性胎盘疟疾特异性免疫女性的血浆/血清抗体，以及吞噬细胞系 THP-1。然而，该方案可轻松修改，用于检测针对红细胞表面任何疟原虫抗原的抗体功能，无论该抗体是由自然感染还是疫苗接种所诱导。该检测方法操作简便、通量高，且具有良好的可重复性，可有效评估疟疾中抗体介导免疫的重要功能特征。因此，在评估临床免疫时具有重要应用价值。 P. falciparum 疟疾是热带地区发病和死亡的主要原因，尤其是在撒哈拉以南非洲地区。
引言
疟疾是一种由五种不同的疟原虫属（Plasmodium）感染人类后引起的虫媒传染病。其中最常见的是恶性疟原虫（P. falciparum），也是导致最多发病和死亡的病原体1。疟疾的临床表现从无症状或良性感染到复杂/重症疾病不等，后者主要发生在五岁以下儿童中。感染P. falciparum并不能诱导完全免疫，但生活在流行地区的人群会逐渐对临床疾病产生免疫力。这种保护作用依赖于年龄和暴露程度，通常在生命最初的5至10年内获得2。成年女性是一个重要的例外，在妊娠期间可能发生重症疟疾，其临床表现称为胎盘疟疾（PM）。胎盘疟疾是导致流产、死产、早产、低出生体重、胎儿死亡以及孕妇贫血的重要原因。对胎盘疟疾的抵抗力随着妊娠次数的增加而逐步增强3。对胎盘疟疾的保护作用与机体产生针对VAR2CSA型PfEMP1的抗体有关4,5，这是一种感染红细胞（IE）表面抗原，能够结合硫酸软骨素A（CSA），从而使感染红细胞滞留在胎盘中。抗体通过多种功能活性介导保护作用（综述见6,7），包括调理感染红细胞以促进吞噬作用。体外
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方案
本研究所用的人类血清样本来自另一项独立研究19。样本采集已获得加纳大学Noguchi纪念医学研究所机构审查委员会（研究编号038/10-11）以及丹麦首都大区地区研究伦理委员会（方案编号H-4-2013-083）的批准。
1. 寄生虫培养
注意：遵循当地关于人类病原体处理的法规。
- 按照先前所述的标准方案，在寄生虫培养基中维持 P. falciparum 寄生虫（见材料表）20。
- 使用山梨醇处理，按照先前描述的方法保持寄生虫的高度同步化21。
- 为确保感染红细胞（IE）表面表达 VAR2CSA，使用与蛋白G磁珠偶联的抗VAR2CSA抗体（例如PAM1.4抗体，一种交叉反应性人源单克隆VAR2CSA特异性IgG22）进行多轮免疫磁珠筛选23。
- 简而言之，将晚期滋养体期感染红细胞（trophozoite-IEs）与偶联了抗VAR2CSA抗体的磁珠孵育，并利用磁铁进行阳性筛选。
- 将筛选后的寄生虫在培养中扩增数个周期，直至寄生率至少达到5....
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结果
本文详细描述了一种先前已报道31并应用过11,12,13,14,15,16,17,18的实验方案，用于检测靶向P. falciparum感染红细胞表面的抗体诱导THP-1细胞产生调理作用及吞噬作用的能力。
该检测专门用于测量抗体介导的吞噬作用，因此需要与THP-1细胞表面相应的Fc受体发生相互作用。基于此原因，如实验方案中所述，我们建议定期通过流式细胞术检测THP-1细胞表面Fcγ受体的表.......
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讨论
本方案此前已有描述并被使用12,15,17,31，用于检测靶向P. falciparum感染红细胞（IEs）表面的抗体诱导THP-1细胞产生调理作用及吞噬作用的能力。本文展示的结果重点关注生活在P. falciparum流行地区女性血浆/血清中自然获得的特异性针对VAR2CSA的抗体。VAR2CSA是一种PfEMP1蛋白，参与感染红细胞在胎盘中的滞留，是妊娠期疟疾（PM）发病机制中的关键决定因素。
该检测可用于检测由免疫接种诱导和/或靶向其他PfEMP1变体或红细胞表面存在的任何其他疟原虫抗原的抗体，前提是所测试的抗体能够与THP-1细胞表达的人Fcγ受体（CD32和CD64）相互作用。该检测方法简单、通量高（可分析大量样本），且可在一天内完成。吞噬作用通过流式细胞术进行测量，定量分析EtBr.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Maiken Visti 提供出色的技术支持。本工作部分由丹麦外交部资助（MAVARECA II；17-02-KU），并由丹麦国际发展署奖学金中心管理。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔细胞培养板，圆底带盖 | Corning | 3799 | 可使用任何类似的板，确保其与拟使用的流式细胞仪兼容 |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037)，0.2 g/L 次黄嘌呤 (Sigma, H9377) 溶于RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| 抗红细胞抗体 | Abcam | ab34858 | 分装为每份2μL，-20°C 冻存。每次实验使用一份。 |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| 溴化乙锭溶液 | Sigma | E1510 | 用RPMI1640 (R5886) 配制0.1 mg/mL的储存液，避光保存 |
| FC500流式细胞仪 | Beckman Coulter | 可使用任何支持96孔板格式并具备合适激光器/滤光片以检测EtBr荧光的流式细胞仪 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Gibco | 10099-141 | 使用前需进行热灭活 |
| FITC标记的小鼠抗人CD16抗体 | BD Biosciences | 555406 或 556618 | |
| FITC标记的小鼠抗人CD32抗体 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC标记的小鼠抗人CD64抗体 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic软件 | Inivai Technologies | 可使用任何流式细胞术分析软件，例如FlowJo或Winlist | |
| 庆大霉素 (10 mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| 次黄嘌呤 | Sigma | H9377 | |
| L-谷氨酰胺 (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| 裂解液 | - | - | 15 mM NH4Cl，10 mM NaHCO3，1 mM EDTA |
| MACS CS柱及配件 | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| 寄生虫培养基 | - | - | 2 mM L-谷氨酰胺 (Sigma, G7513)，50µg/mL 庆大霉素 (Sigma, G1272)，0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) 溶于RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| 青霉素/链霉素 (10000 U 和 10 mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640培养基 | Sigma | R5886 | |
| THP-1细胞培养基 | - | - | 10% FBS (Gibco, 10099-141)，2 mM L-谷氨酰胺 (Sigma, G7513)，100 U/mL 青霉素，0.1 mg/mL 链霉素 (Sigma, P0781) 溶于RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS磁铁 | Miltenyi Biotec |
参考文献
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5....
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