通过流细胞学测定，测量自然获得的噬菌体诱导恶性疟Plasmodium falciparum原虫抗体

疟疾是一种病媒传播的疾病，在感染五种不同种类的疟原虫时，由人类引起。最常见的物种是恶性疟原虫，它也负责发病率和死亡率^1。疟疾临床表现从无症状或良性感染到复杂/严重疾病，后者主要发生在五岁以下儿童中。接触恶性疟原虫不会诱发无菌免疫，但生活在流行地区的个体对临床疾病的免疫力会慢慢发展。保护是年龄/暴露依赖和免疫力通常获得在生命的前5-10年^2。成年妇女是一个重要的例外，因为严重的疟疾可能发生在怀孕期间，在临床介绍称为胎儿素疟疾（PM）。PM 是流产、死产、早产、低出生体重、胎儿死亡和产妇贫血的重要原因。对PM的耐药性在连续怀孕时^{发展 3}。防止PM与获得抗体对VAR2CSA型PfEMP1^4，5，受感染的红细胞（IE）表面抗原，结合到软体素硫酸盐A（CSA），使国际在胎盘中固有。^4,抗体调解保护执行各种功能活动（^{审查在,6，7），}包括E的异化，以诱导吞噬。早期的体外研究表明，抗体可以通过^,噬菌体^8，9来限制单细胞的存在。⁹最近的研究表明，高浓度的噬菌体诱导抗体与更好的妊娠结果（在HIV共感染的情况下^{）10，11，,11}表明这种效应功能在自然获得的免疫反应的相关性。

在这里，我们提出了一个协议，测量存在于人类血浆/血清中的抗体的这一功能in vitro，使用体外培养的IES表达VAR2CSA与单细胞线THP-1。与早期的显微镜方案8相比^,,，该测定方法以前曾使用过^,,,11、12、13、14、15、16、17、18，被认为是一种改进^{12和更容易的方法，}因为它允许使用较小的抗体体积在一次运行中测试更多的抗体样本，并避免繁琐和偏颇的¹⁸显微镜计数。^{17,1113141516}尽管该测定方法已被多个实验室使用，而且执行过程非常简单，但它需要仔细规划和准备，因此，详细的协议将允许缺乏经验的实验室和研究人员应用该测定。例如，我们使用表示 VAR2CSA 的后期同步 IE 与从自然获得 PM 特异性免疫力的妇女收集的血清中存在的抗体进行结果化。然而，该协议可以很容易地修改，以检测抗体的功能，任何寄生虫抗原存在于国际化学品表面，无论是由自然接触或接种疫苗引起的。

用于此处结果的人体血清样本在另外一项研究^19中收集。馆藏由加纳大学野口医学研究所机构审查委员会（研究报告038/10-11）和丹麦首都大区区域研究伦理委员会（协议H-4-2013-083）批准。

1. 寄生虫文化

注:遵守当地有关人类病原体处理的规定。

1. 根据寄生虫培养基20前所述的标准协议维持恶性疟原虫（参见²⁰材料表）。
2. 保持寄生虫紧密同步使用索比托治疗，如前面描述^的21。
3. 为确保VAR2CSA在 IE 表面的表达，使用抗 VAR2CSA 抗体（例如 PAM1.4 抗体，一种交叉反应人单克隆 VAR2CSA 特异性 IgG^22）与蛋白质 G 磁珠²³耦合，进行反复的免疫磁选择。
   1. 简言之，用磁珠与抗VAR2CSA抗体耦合的晚期三磷酸盐-IE孵育，并使用磁铁进行正向选择。
   2. 将培养中的选定寄生虫扩展几个周期，直到寄生虫病至少为 5%。
   3. 或者，选择与塑料固定CSA（VAR2CSA的受体）结合的寄生虫，如前面描述^的24。
4. 要验证VAR2CSA表达对选定的寄生虫执行流细胞测量，如前面描述^的25。
   1. 简言之，用用于磁性选择的相同抗体（步骤1.3）标记晚期三磷酸盐-IE，然后是荧光标记的二级抗体。
   2. 通过流式细胞测量测量 IE 表面反应。成功的抗体选择通常导致寄生虫群体在大多数寄生虫中表达VAR2CSA（≈80%）。
5. 对于噬菌体测定，使用纯化的中晚期三磷酸盐。使用前面描述的磁分离进行纯^{化，如前面所述}。
   注:为了准确确定寄生虫的阶段，对血液涂片进行Giemsa染色，然后进行光显微镜观察。遵循标准程序和形态学指南，如^{27之前所述}。后期纯化也可以使用密度梯度介质进行。然而，在我们的经验中，IE的收率较低，因此，磁纯化是可取的。
   1. 对于磁性分离，在室温下以 500 x g 旋转寄生虫培养（5-10% 寄生虫）旋转 10 分钟。去除上一提液，在10mL的寄生虫培养培养培养中重新悬浮细胞颗粒。
   2. 将寄生虫悬浮液加入到与磁铁耦合的 CS 柱中（ 参见材料表），让它慢慢穿过该柱。特罗福佐石-IEs是顺磁的（由于血佐因的存在），并将留在柱网中。
   3. 用50 mL的寄生虫培养培养培养柱清洗柱，使用50mL的寄生虫培养培养培养，从磁柱中洗出一个。
6. 在室温下，在 500 x g 下将埃卢酸盐从 1.5.3 旋转 10 分钟。小心丢弃上那物，在1mL的寄生虫培养培养中重新悬浮。
7. 使用血细胞计，计算 IEs 的数量（通过光显微镜很容易识别为具有深色血佐素色素的红细胞）和总细胞数，以计算最终寄生虫（IEs 的百分比）。
   注:仅使用纯度至少为 80%（80% IEs）的寄生虫。
8. 根据计划用于测试的血清/抗体样本数量，估计所需的 IE 总量，并相应地扩大寄生虫培养物。一个75厘米² 培养瓶与25 mL的培养在5%血肿和5-10%寄生虫应产生足够的 IEs 运行一个完整的96井板。对于全板（42 个样品加上 6 个重复的控件），至少需要 1.5 mL 寄生虫悬浮液，在 3.3 x 10⁷ IEs/mL 时。

2. THP-1细胞

注:THP-1细胞系用于此测定。此单细胞细胞系来自单细胞白血病²⁸ 患者，可从 ATCC 购买。根据 THP-1 培养介质中的提供者说明维护单元系（ 参见材料表）。

1. 为定期维护，当细胞浓度达到8 x 10 5细胞/mL时，在2-4 x 10⁵细胞/mL下开始THP-1细胞培养和亚培养。⁵
   注:不要让细胞浓度超过1 x 10^{6 6} 细胞/mL，并跟踪通过编号。避免使用超出第 25 段的细胞。THP-1 细胞系的平均倍增时间在 19-50 小时之间变化。在开始吞噬实验之前，确定细胞批次的倍增时间。这将有助于大致估计要测试的确定数量的血清样本所需的培养量（例如，对于完整的96井板，需要5 x 10⁵ 细胞/mL的培养量10 mL）。
2. 定期检查THP-1细胞的Fc+受体III（CD64）、II（CD32）和III（CD16）的表面表达，如前面^所述的15。
   1. 简言之，在室温下用抗CD64、抗CD32和抗CD16荧光标记抗体（材料表）将THP-1细胞（单独）染色30分钟（PBS中2%FBS中准备的1:100稀释）。
   2. 在 PBS 中用 2% FBS 洗涤三次，通过流式细胞仪测量表面染色。
      注:THP-1细胞对CD16呈阴性，CD32和CD64为阳性，如先前^{报告的第29、30（,30}图1）。
3. 对于噬菌体测定，在实验前一天设置具有2.5 x 10⁵ 细胞/mL的THP-1细胞培养瓶，在测定当天产生约5 x 10⁵ 细胞/mL。
   注:确保测定当天存在4-6 x^{10 5} 个细胞/mL。

3. 噬菌体测定（图S1）

1. 在开始检测之前，块 （>1 h） 两个圆底 96 孔板（一个用于异化，另一个用于噬菌体病），使用 150 μL 每孔无菌 2% FBS 在 PBS 中。
   注:标签板1作为标的板，并使用它为溴化乙基（EtBr）染色和去松化。标签板2作为噬菌体板，并用于THP-1细胞电镀和噬菌体步骤。
2. 寄生虫染色和操作
   1. 以 1.6 中制备的 IE 悬浮液，通过添加寄生虫培养基和 EtBr 将细胞计数调整为 3.3 x^{10 7 7 7} ML，以达到 2.5 μg/mL 的最终浓度（1:40 稀释，从 0.1 mg/mL 库存）。
      注:EtBr染色寄生虫DNA，允许通过流式细胞学检测。
      注意:EtBr 是一种突变和皮肤、眼睛和呼吸刺激物。根据当地法规，采取适当措施保护和处理废物。
   2. 从 96 个孔板（气化板）之一中拆下阻塞溶液，轻拂板，并清除一块毛巾纸上多余的液体。
   3. 在上面的板的上半部分加入上面准备的 IE 悬浮液井 30 μL。留空一井，加入30μL的寄生虫培养培养（没有用于THP-1单独控制的ES）。（图 S2A） 。在室温下孵育10分钟，防止光线。
   4. 每井添加170μL的寄生虫培养培养。在室温下以 500 x g 旋转 板 3 分钟，然后将盘子轻拂到适当的废物容器上，去除上流水线。
   5. 使用每井200 μL的寄生虫培养介质将带 EtBr 标签的 IE 再次清洗两次，在室温下以 500 x g 旋转板 3 分钟。第一次洗涤的上一次洗涤可以通过轻拂板去除。使用多通道移液器小心地从第二次洗涤中去除上流液，以确保去除整个洗涤介质体积。请勿干扰颗粒。
   6. 在寄生虫培养基中以所需浓度制备的 30 μL 抗体/血浆/血清溶液中重新悬挂 EtBr 标记的 IE。
   7. 始终包括以下控制（图S2B）:没有 IEs/THP-1 细胞控制的对照（寄生虫培养培养本）;没有任何抗体或血浆/血清的对照（非对照控制）;使用市售的兔子抗人类红细胞抗体在1:100稀释的阳性对照（ 见材料表）;两个阴性血浆/血清对1:5稀释（疟疾天真池和疟疾暴露男性池）;和阳性血清控制在1:5稀释（从疟疾暴露的妇女，谁以前怀孕（最好是多重力）池）。
      注:阳性对照的1:100稀释似乎在不同批次购买的抗体之间一致工作（未显示数据）。但是，建议在每次使用新一批抗体时，通过测试几种稀释法来排除批次之间的变异。
   8. 在37°C的黑暗中孵育45分钟。
3. THP-1细胞制剂和吞噬
   1. 当 I 被评估 （3.2.8） 时，开始准备 THP-1 细胞。
   2. 从培养瓶中去除 THP-1 细胞，将其旋转下来（室温下为 500 x g 5 分钟），在 THP-1 细胞培养培养培养中去除上一提液并重新悬浮颗粒。
   3. 再次旋转（500 x g， 室温下5分钟），在THP-1细胞培养培养培养的1 mL中，将上一级液中下一个液位重新悬浮。
   4. 确定上述溶液中的细胞计数，并添加更多介质，以获得 5 x 10^{5 5 细胞} /mL 的最终浓度。
   5. 通过轻拂板并去除毛巾纸上多余的液体，从剩余的 96 井板（磷酸化板）中去除阻塞溶液。
   6. 在3.3.4中制备的THP-1细胞悬浮液每井添加100μL，并放回细胞培养箱中（图S2C）。
   7. 抗体/血浆/血清孵育时间结束后，每井添加170μL的寄生虫培养基。在室温下以 500 x g 旋转 板 3 分钟，然后将盘子轻拂到适当的废物容器上，去除上流水线。
   8. 使用每井200μL的寄生虫培养培养介质，将蛋白化的 IEs 再次清洗两次，在室温下以 500 x g 旋转板 3 分钟。第一次洗涤的上一次洗涤可以通过轻拂板去除。使用多通道移液器小心地从第二次洗涤中去除上流液，以确保去除整个洗涤介质体积。请勿干扰颗粒。
   9. 最后在预热的THP-1细胞培养培养培养的100μL中重新悬浮了蛋白化的ES。将 50 μL 的蛋白化 IE 悬浮液转移到噬菌体板中的每一个井中。由于总共有 100 μL 的 IE，因此每个抗体/血清稀释都可以在噬菌体板中重复运行 （图S2D）
      注:测定中使用的 I 和 THP-1 细胞量对应于 10:1 的比例。
   10. 在黑暗中37°C孵育40分钟_，CO25% 。
       注:不要让吞噬继续超过40分钟。
   11. 在4°C（500 x g，5分钟）下离心停止噬菌体，通过轻拂板丢弃上经剂。加入150μL的室温氯化铵解合溶液（材料表），通过移液混合，孵育整整3分钟。
       注:此步骤将解化尚未由 THP-1 细胞吞噬的红细胞。
   12. 在 PBS 中加入 100 μL 的冰冷 2% FBS，从而停止解笑。在 4 °C（500 x g 3 分钟）旋转板，然后通过轻拂板在适当的废物容器上去除上流水。
   13. 在 PBS 中，使用每井 200 μL 的 200 μL 在 4°C（500 x g 3 分钟）旋转板时洗涤三次。最后洗涤后，在PBS中重新悬浮200μL的冰冷2%FBS，并立即通过流量细胞测定进行分析。
       注:以前的出版物在流式细胞学³¹之前在2%的半形式醛中使用了细胞固定，但这里显示的结果是在测定完成后立即获得的。不建议通过将板存储在 4°C 时延迟流式细胞测量数据is not采集，因为 EtBr⁼ THP-1 细胞的百分比会迅速衰变（图 S3）。
4. 流式细胞测量采集和分析
   注:任何支持 96 井板格式且具有适当的激光/滤波器测量 EtBr 荧光的流式细胞计都可以使用。
   1. 对于采集，使用线性正向散射（FSC）与线性侧散（SSC）图（使用井）的THP-1单元上的栅极未添加任何一个（图2A），并在此门上获取10，000个事件。
   2. 使用直方图图测量 THP-1 门上的 EtBr （FL3-Log） 的荧光强度。
   3. 对于浇注，在FSC与SSC密度图中THP-1细胞上的第一个栅极，使用井没有添加一个，没有添加一个（图2A）。然后使用 THP-1 单元（未添加 IE）和未结果控制（图2B）在 FL3 （EtBr） 直方图中设置正门。
   4. 在同一个板中测试的所有其他样本中复制这些门，并确定 EtBr 阳性 THP-1 细胞（至少经过一个 IE 的 THP-1 细胞）的百分比。对于每个测试样本，吞噬菌体可以报告为绝对值（EtBr⁺ THP-1细胞的百分比）或相对吞噬症，使用正对照作为最大值计算为百分比。

在这里，我们详细介绍了一个协议，以前描述31，并使用11，12，13，14，15，16，17，18,14,15,16,17,1811,12,测量抗体的能力，目标为P.恶性疟原虫的表，诱导蛋白石化和吞噬的THP-1细胞。

该检测专门测量抗体中量的噬菌体，因此，需要与THP-1细胞表面的适当FC受体相互作用。因此，如协议所述，我们建议通过流式细胞仪定期检查THP-1细胞表面的Fc+受体的表达。细胞对于CD16（图1A）应该是阴性，对于CD32和CD64（图1B，C）为正数。

对于检测，纯化的晚期 IE 与 EtBr 标记，然后使用存在于疟疾天真或疟疾暴露个体的血浆/血清中的抗体进行结果化。通过流细胞学测量噬菌体，在与EtBr标记 和抗体-同源性E共同孵育40分钟后，量化EtBr+THP-1细胞的百分比。最初，THP-1细胞使用FSC与SSC密度图进行门控（图2A）。然后，使用 THP-1 单元上的 FL3 直方图和未结果的 IE 创建 EtBr+ 标记（图 2B）。然后，这些门用于分析所有其他控件和测试样本。

阴性对照（包括单例包括THP-1细胞、未结果的 IE 控制，以及疟疾和疟疾暴露的男性的对照）都应该在FL3通道中产生一个负峰（图3A），EtBr+标记中只有几个事件。因此，平均噬菌体值作为绝对的 EtBr+ THP-1 细胞和相对吞噬百分比应非常低（图 3B，C，通常低于 2%的所有病例）。相比之下，阳性对比（包括兔子抗人红细胞抗体和疟疾暴露的女性池）应产生两个峰值的痕迹（图3A）:负对（基本上与所有阴性对联产生的对联重叠）和位于EtBr+标记内的明显阳性和分离良好的光斑。正样本，如介绍的例子（来自疟疾暴露的多重力妇女/NF20的样本）应产生与阳性对数类似的轮廓。平均噬菌体值，以绝对 EtBr+ THP-1 细胞和相对噬菌体测量，通常为阳性控制最高（58%/100%），其次是疟疾暴露女性池（29%/53%），然后是疟疾暴露妇女（23%/40%）。如图3B，C所示，其中提出了三个独立的实验，实验之间有相当大的差异，因此，我们建议运行样本，以进行比较的同一实验。在我们手中，至少有四个完整的96孔板可以由一个有经验的研究人员处理。同时进行了两次相同的实验，对疟疾暴露妇女的几种血清样本进行了两次相同的实验，也清楚地观察到了测定之间的变异性。使用相同的寄生虫制剂（在后期 IE 的磁纯化后）和血清稀释。THP-1细胞保存在两个独立的烧瓶中，但从同一个初始烧瓶中播种，实验由两个不同的研究人员进行。尽管测定在单独执行时似乎会产生一致的结果，但两个实验中测量的邻苯三代值之间的线性相关性（绝对值和相对邻源数为 r>0.9），调整后的线的斜率系数与一个值不同，表明不同实验中生成的值并不相同。与相对值（斜率系数置信区间 0.68-1）相比，绝对值（斜率系数置信区间 0.55-0.72）的此偏差更为明显（图 4）。因此，我们建议使用相对值，特别是当由于某种原因（例如，纯化的 Ie 不够充分、超过 4 个完整板等）时，不可能在单个实验中运行所有样本。我们还建议在最短的时间内运行用于比较分析的实验，以避免由于PfEMP1表达（以及其他抗原）的漂移以及培养时间延长时THP-1细胞的细微差异而引入额外的变异。

图1:THP-1细胞表面表达的Fc受体。
（A） Fc+ 受体 III/CD16 （红色）。（B） Fc+ 受体 II/CD32 （绿色）。 C. Fc+ 受体 I/CD64（橙色）。未标记的单元格以蓝色显示。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:流式细胞仪浇注策略。
（A） THP-1细胞在FSC/SSC. （ B ）溴化铀阳性 （EtBr+）THP-1细胞在FL3直方图中。.显示仅 THP-1 细胞/未添加 IEs（蓝色）、使用未结果 IEs 孵育的 THP-1 细胞（绿色）和 THP-1 细胞，使用正对照（红色）对的 I 进行孵育的 THP-1 细胞。请单击此处查看此图的较大版本。

图3:IT4VAR04-IEs由THP-1细胞引起的噬菌体。
（A） B 中提出的一个实验的代表性流式细胞式直方图（由较大的符号标识）。（B） EtBr= THP-1 细胞的百分比（三个独立实验的平均值和标准偏差）。（C） 与 B 中的数据相同，对相应的正控进行规范化后。所有面板的颜色编码都相同:THP单独（黑色）、未结果/无抗体控制（蓝色）、疟疾天真控制（青色）、疟疾暴露的男性池（绿色）、疟疾暴露的女性池（橙色）、疟疾暴露的女性捐赠者（粉红色）和阳性控制/兔子抗人类红细胞（红色）。显示均值和标准偏差。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4:THP-1细胞与10名疟疾暴露妇女的血清进行手术后，IT4VAR04 IEs的噬菌体病。
这些图对当天进行的两项相同实验进行了线性回归分析，但由不同的研究人员进行。（A） 数据以绝对值和 （B） 相对噬菌体值表示.使用统计分析软件执行的分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

图S1:噬菌体测定流程图。 描述分析主要步骤的流程图。 请点击这里下载此图。

图S2:96井板实验布局。 （A） IES EtBr 标签的布局。（B） 供问题化布局;6 孔始终保留用于控制。（C） THP细胞电镀的布局。（D）吞噬的布局。 请点击这里下载此图。

图 S3:颜色编码，如图 3 所示。（A） 一个实验的流式细胞直方图覆盖，在4°C储存后立即和（B）储存12小时。（C） 储存前和储存后测量的EtBr +THP-1细胞的百分比。+NF#代表不同的疟疾暴露女性捐赠者。请点击这里下载此图。

作者没有什么可透露的。