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方法文章

测量自然获得性诱导吞噬作用的抗体 恶性疟原虫 基于流式细胞术的寄生虫检测方法

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DOI：

10.3791/61538

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2020年8月6日

 ,  , 
1Centre for Medical Parasitology, Department of Immunology and Microbiology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2West African Centre for Cell Biology of Infectious Pathogens, Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, University of Ghana, 3Department of Immunology, Noguchi Memorial Institute for Medical Research, 4Centre for Medical Parasitology, Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet

本文内容

摘要

本方案的总体目标是指导如何测定自然暴露于恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）感染的个体血清或血浆中抗体介导调理并诱导吞噬细胞吞噬寄生虫感染红细胞（IEs）的能力。

摘要

该方案描述了如何建立并运行基于流式细胞术的吞噬作用检测 恶性疟原虫-被自然获得的特异性针对VAR2CSA的IgG抗体调理的感染性红细胞（IEs）。VAR2CSA是介导IEs在胎盘中选择性滞留的疟原虫抗原，这种滞留可导致孕妇发生一种严重的疟疾形式，称为胎盘疟疾（PM）。对PM的保护作用由特异性针对VAR2CSA的抗体介导，这些抗体被认为通过抑制IEs在胎盘中的滞留和/或通过调理IEs以促进其被吞噬作用来发挥功能。该检测采用经过选择的晚期同步化IEs 体外 表达 VAR2CSA、来自具有天然获得性胎盘疟疾特异性免疫女性的血浆/血清抗体，以及吞噬细胞系 THP-1。然而，该方案可轻松修改，用于检测针对红细胞表面任何疟原虫抗原的抗体功能，无论该抗体是由自然感染还是疫苗接种所诱导。该检测方法操作简便、通量高，且具有良好的可重复性，可有效评估疟疾中抗体介导免疫的重要功能特征。因此，在评估临床免疫时具有重要应用价值。 P. falciparum 疟疾是热带地区发病和死亡的主要原因，尤其是在撒哈拉以南非洲地区。

引言

疟疾是一种由五种不同的疟原虫属（Plasmodium）感染人类后引起的虫媒传染病。其中最常见的是恶性疟原虫（P. falciparum），也是导致最多发病和死亡的病原体1。疟疾的临床表现从无症状或良性感染到复杂/重症疾病不等，后者主要发生在五岁以下儿童中。感染P. falciparum并不能诱导完全免疫，但生活在流行地区的人群会逐渐对临床疾病产生免疫力。这种保护作用依赖于年龄和暴露程度，通常在生命最初的5至10年内获得2。成年女性是一个重要的例外，在妊娠期间可能发生重症疟疾，其临床表现称为胎盘疟疾（PM）。胎盘疟疾是导致流产、死产、早产、低出生体重、胎儿死亡以及孕妇贫血的重要原因。对胎盘疟疾的抵抗力随着妊娠次数的增加而逐步增强3。对胎盘疟疾的保护作用与机体产生针对VAR2CSA型PfEMP1的抗体有关4,5，这是一种感染红细胞（IE）表面抗原，能够结合硫酸软骨素A（CSA），从而使感染红细胞滞留在胎盘中。抗体通过多种功能活性介导保护作用（综述见6,7），包括调理感染红细胞以促进吞噬作用。体外早期研究表明，抗体可通过单核细胞介导的吞噬作用限制P. falciparum的生长8,9。最近的研究表明，在合并HIV感染的情况下，诱导更高水平吞噬作用的抗体与更好的妊娠结局相关10,11，表明该效应功能在自然获得性免疫应答中的重要性。

在此，我们介绍一种利用人血浆/血清中抗体来检测其功能的实验方案。 体外 共培养表达VAR2CSA的IEs与单核细胞系THP-1。该检测方法此前已被使用11,12,13,14,15,16,17,18 与早期基于显微镜的实验方案相比，该方法被认为是一种改进且更简便的操作方式8因为它允许在单次实验中使用更少的抗体体积检测更多样本，同时避免了繁琐且易产生偏倚的显微镜计数。尽管该检测方法已被多个实验室采用，且操作相对简单，但仍需要周密的规划和准备，因此一份详细的实验方案将有助于缺乏相关经验的实验室和研究人员顺利开展该技术。我们以晚期同步化的表达VAR2CSA的感染红细胞（IEs）为例，将其与来自具有自然获得性妊娠相关疟疾（PM）特异性免疫妇女血清中的抗体进行调理处理。然而，该方案可轻松修改，用于检测针对感染红细胞表面任何寄生虫抗原的抗体功能，无论这些抗体是由自然感染还是疫苗接种所诱导产生。

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方案

本研究所用的人类血清样本来自另一项独立研究19。样本采集已获得加纳大学Noguchi纪念医学研究所机构审查委员会（研究编号038/10-11）以及丹麦首都大区地区研究伦理委员会（方案编号H-4-2013-083）的批准。

1. 寄生虫培养

注意：遵循当地关于人类病原体处理的法规。

  1. 按照先前所述的标准方案，在寄生虫培养基中维持 P. falciparum 寄生虫（见材料表）20。
  2. 使用山梨醇处理，按照先前描述的方法保持寄生虫的高度同步化21。
  3. 为确保感染红细胞（IE）表面表达 VAR2CSA，使用与蛋白G磁珠偶联的抗VAR2CSA抗体（例如PAM1.4抗体，一种交叉反应性人源单克隆VAR2CSA特异性IgG22）进行多轮免疫磁珠筛选23。
    1. 简而言之，将晚期滋养体期感染红细胞（trophozoite-IEs）与偶联了抗VAR2CSA抗体的磁珠孵育，并利用磁铁进行阳性筛选。
    2. 将筛选后的寄生虫在培养中扩增数个周期，直至寄生率至少达到5%。
    3. 或者，可按照先前描述的方法，选择能够结合固定于塑料表面的CSA（VAR2CSA的受体）的寄生虫24。
  4. 为验证筛选后寄生虫表面的VAR2CSA表达，按照先前描述的方法进行流式细胞术分析25。
    1. 简而言之，使用磁珠筛选所用的相同抗体（步骤1.3）标记晚期滋养体期感染红细胞，随后加入荧光标记的二抗。
    2. 通过流式细胞术检测感染红细胞表面的反应性。成功的抗体筛选通常可获得在大多数寄生虫中表达VAR2CSA的种群（≈80%）。
  5. 进行吞噬作用实验时，使用纯化的中期至晚期滋养体期感染红细胞。按照先前描述的方法，使用磁性分离法进行纯化26。
    注意：为准确判断寄生虫的发育阶段，需对血涂片进行吉姆萨染色，并通过光学显微镜观察。请遵循先前描述的标准操作流程和形态学判断标准27。也可使用密度梯度培养基进行晚期阶段的纯化，但据我们经验，其感染红细胞得率较低，因此更推荐使用磁性纯化方法。
    1. 进行磁性分离时，将寄生虫培养物（5–10% 寄生率）在室温下以 500 x g 离心 10 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 寄生虫培养基中。
    2. 将寄生虫悬液加入连接于磁铁的CS柱（见材料表）中，使其缓慢流过柱体。由于含有疟色素（hemozoin），滋养体期感染红细胞具有顺磁性，会滞留在柱网中。
    3. 用 50 mL 寄生虫培养基洗涤柱体，再用 50 mL 寄生虫培养基洗脱磁柱中的感染红细胞。
  6. 将步骤1.5.3中收集的洗脱液在室温下以 500 x g 离心 10 分钟。小心弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 寄生虫培养基中。
  7. 使用血细胞计数板，计数感染红细胞数量（可通过光学显微镜识别含有深色疟色素的红细胞）及总细胞数，以计算最终寄生率（感染红细胞百分比）。
    注意：仅使用纯度至少为 80%（即80% 为感染红细胞）的寄生虫。
  8. 根据计划检测的血清/抗体样本数量，估算所需感染红细胞的总量，并相应扩大寄生虫培养规模。一个容积为25 mL、红细胞压积为5%、寄生率为5–10%的75 cm2 培养瓶，通常可提供足够进行完整96孔板实验的感染红细胞。对于完整板实验（42个样本加6个对照，均设复孔），至少需要1.5 mL浓度为3.3 × 107 个感染红细胞/mL的悬液。

2. THP-1 细胞

注意：本实验使用 THP-1 细胞系。该单核细胞系来源于一名单核细胞白血病患者28，可从 ATCC 购买。请按照供应商说明，在 THP-1 培养基中培养该细胞系（参见材料表）。

  1. 常规维护时，将 THP-1 细胞培养起始密度设为 2–4 × 105 个细胞/mL，当细胞浓度达到 8 × 105 个细胞/mL 时进行传代。
    注意：细胞浓度不得超过 1 × 106 个细胞/mL，并记录传代次数。避免使用传代次数超过 25 代的细胞。THP-1 细胞系的平均倍增时间介于 19–50 小时之间。在开始吞噬实验前，应先测定该批细胞的倍增时间，以便粗略估算待测血清样本数量所需的培养物体积（例如，若需检测一整块 96 孔板，需要 10 mL 浓度为 5 × 105 个细胞/mL 的细胞培养物）。
  2. 定期检测 THP-1 细胞表面 Fcγ 受体 I（CD64）、II（CD32）和 III（CD16）的表达情况，方法如前所述15。
    1. 简言之，将 THP-1 细胞分别与荧光标记的抗 CD64、抗 CD32 和抗 CD16 抗体（材料表）在室温下避光孵育 30 分钟（用含 2% FBS 的 PBS 稀释至 1:100）。
    2. 用含 2% FBS 的 PBS 洗涤三次，通过流式细胞术检测表面染色情况。
      注意：如先前报道29,30，THP-1 细胞 CD16 表达为阴性，CD32 和 CD64 表达为阳性（图 1）。
  3. 进行吞噬实验时，于实验前一天接种 THP-1 细胞，起始密度为 2.5 × 105 个细胞/mL，以确保实验当天细胞密度约为 5 × 105 个细胞/mL。
    注意：实验当天细胞密度应维持在 4–6 × 105 个细胞/mL 范围内。

3. 吞噬作用检测（图S1）

  1. 在开始检测之前，封闭（>1 h）使用 PBS 中含 150 μL 每孔的无菌 2% FBS，将两块圆底 96 孔板（一块用于调理作用，另一块用于吞噬作用）进行处理。
    注意：将 1 号板标记为调理作用板，用于溴化乙锭（EtBr）染色和调理作用。将 2 号板标记为吞噬作用板，用于 THP-1 细胞铺板和吞噬作用步骤。
  2. 寄生虫染色与调理作用
    1. 取1.6中制备的IE悬液，调整细胞浓度至3.3 × 107 每毫升感染性虫体（IEs）通过添加寄生虫培养基和溴化乙锭（EtBr），使其终浓度达到2.5 μg/mL（从100 μg/mL原液按1:40比例稀释）。
      注意：溴化乙锭（EtBr）可染色寄生虫DNA，从而可通过流式细胞术进行检测。
      警告：溴化乙锭（EtBr）具有致突变性，对皮肤、眼睛和呼吸道有刺激性。操作时应采取适当的防护措施，并根据当地法规妥善处理废弃物。
    2. 从其中一个96孔板（调理素化板）中移除封闭液，轻弹平板，并在纸巾上除去多余的液体。
    3. 在板的上半部分每孔加入30 μL上述制备的IE悬液。留一孔为空白，仅加入30 µL寄生虫培养基（不含IE，作为THP-1单独对照）。图 S2A室温避光孵育10分钟。
    4. 每孔加入 170 µL 寄生虫培养基。将培养板在 500 × g 条件下离心 x g 室温下持续3分钟 将平板在合适的废液容器上方轻弹，弃去上清液。
    5. 用 200 µL 每孔的寄生虫培养基将溴化乙锭标记的 IEs 再洗涤两次，以 500 × g 离心培养板 x g 室温下静置3分钟。第一次洗涤后的上清液可通过轻弹酶标板去除。使用多通道移液器小心移除第二次洗涤的上清液，确保完全移除所有洗涤液，切勿扰动沉淀。
    6. 将溴化乙锭标记的IEs重悬于30 μL用寄生虫培养基配制的、含所需浓度抗体/血浆/血清的溶液中。
    7. 始终包括以下对照组（图S2B）：无IEs/THP-1细胞的对照（寄生虫培养基）；无任何抗体或血浆/血清的对照（非调理对照）；使用市售兔抗人红细胞抗体以1:100稀释度作为阳性对照（参见 材料表）；两个阴性血浆/血清对照（1:5稀释），分别为疟疾未暴露者混合样本和疟疾暴露男性混合样本；以及一个阳性血清对照（1:5稀释），为既往有妊娠史（ preferably multigravidae）的疟疾暴露女性混合样本。
      注意：对于阳性对照，1:100 稀释度在不同批次的外购抗体中均表现出稳定的效果（数据未示）。然而，建议每次使用新批次抗体时，通过测试多个稀释度来排除批次间的差异。
    8. 37 °C 避光孵育 45 分钟。
  3. THP-1 细胞制备与吞噬作用
    1. 在进行IEs的调理作用（3.2.8）的同时，开始准备THP-1细胞。
    2. 从培养瓶中取出 THP-1 细胞，离心沉淀（500 x g 室温孵育5分钟，倾去上清液，将沉淀重悬于THP-1细胞培养基中。
    3. 再次离心（500） x g 室温孵育5分钟后，倾去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL THP-1细胞培养基中。
    4. 确定上述制备溶液中的细胞数量，并加入更多培养基以获得终浓度为 5 x 105 cells/mL
    5. 从剩余的96孔板（吞噬作用板）中移除封闭液，方法是轻弹平板，并将多余液体在一张纸巾上吸除。
    6. 按每孔100 μL加入3.3.4中制备的THP-1细胞悬液，放回细胞培养孵箱中图 S2C).
    7. 抗体/血浆/血清孵育时间结束后，每孔加入 170 µL 寄生虫培养基。将培养板在 500 × g 条件下离心 x g 室温孵育3分钟，然后将平板在合适的废液容器上方轻弹以去除上清液。
    8. 用寄生虫培养基每孔200 µL将调理化的红细胞再洗涤两次，每次以500 × g离心平板 x g 室温下静置3分钟。第一次洗涤后的上清液可通过轻弹酶标板去除。第二次洗涤后，使用多通道移液器小心吸除上清液，确保完全移除所有洗涤液，切勿扰动沉淀。
    9. 最后，将调理化的IE重悬于100 µL预热的THP-1细胞培养基中。取50 µL调理化的IE悬液加入吞噬作用检测板的每个孔中。由于IE总体积为100 µL，每种抗体/血清稀释度可在吞噬作用检测板中设置两个复孔。图 S2D)
      注意：检测中使用的IEs和THP-1细胞的数量对应于10:1的比例。
    10. 37 °C、5% CO₂条件下避光孵育40分钟2.
      注意：吞噬作用持续时间不得超过 40 分钟。
    11. 通过在 4 °C 下离心（500）终止吞噬作用 x g，5 分钟），通过轻弹培养板弃去上清液。加入 150 µL 室温的氯化铵裂解液（材料表）并用移液器吹打混匀，准确孵育3分钟。
      注意：此步骤将裂解未被 THP-1 细胞吞噬的红细胞。
    12. 通过加入 100 µL 冰冷的含 2% FBS 的 PBS 终止裂解。在 4 °C 下以 500 x g 孵育3分钟，然后将平板在合适的废液容器上方轻弹以去除上清液。
    13. 用预冷的含2% FBS的PBS溶液，每孔200 µL，洗涤三次，4°C下以500 × g离心洗板 x g 孵育3分钟。最后一次洗涤后，用200 µL预冷的含2% FBS的PBS重悬细胞，并立即进行流式细胞术分析。
      注意：先前的研究在流式细胞术之前使用2%多聚甲醛固定细胞31，但此处展示的结果均在检测完成后立即获取。若将检测板置于4°C保存，延迟流式细胞术数据采集 不是 推荐，因为溴化乙锭（EtBr）的百分比+ THP-1 细胞衰变迅速（图 S3).
  4. 流式细胞术数据采集与分析
    ​注意：可使用任何支持96孔板格式且配备适当激光器/滤光片以检测溴化乙锭（EtBr）荧光的流式细胞仪。
    1. 采集时，使用未添加包涵体（IEs）的孔，通过线性前向散射（FSC）与线性侧向散射（SSC）图对 THP-1 细胞设门图2A并在此门控中采集10,000个事件。
    2. 使用直方图，在THP-1门控范围内检测EtBr（FL3-Log）的荧光强度。
    3. 设门时，首先在未添加IEs的孔中，通过FSC与SSC密度图对THP-1细胞进行设门图2A）。然后使用未添加IEs的THP-1细胞和非调理对照样本，在FL3（EtBr）直方图中设定阳性门控图 2B).
    4. 将这些门控复制到同一块板中测试的所有其他样本中，并确定溴化乙锭（EtBr）阳性THP-1细胞的百分比（即吞噬了至少一个子孢子的THP-1细胞）。对于每个测试样本，吞噬作用可报告为绝对值（EtBr阳性细胞百分比）+ THP-1细胞）或以阳性对照为最大值计算的相对吞噬率（百分比）。

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结果

本文详细描述了一种先前已报道31并应用过11,12,13,14,15,16,17,18的实验方案，用于检测靶向P. falciparum感染红细胞表面的抗体诱导THP-1细胞产生调理作用及吞噬作用的能力。

该检测专门用于测量抗体介导的吞噬作用，因此需要与THP-1细胞表面相应的Fc受体发生相互作用。基于此原因，如实验方案中所述，我们建议定期通过流式细胞术检测THP-1细胞表面Fcγ受体的表...

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讨论

本方案此前已有描述并被使用12,15,17,31，用于检测靶向P. falciparum感染红细胞（IEs）表面的抗体诱导THP-1细胞产生调理作用及吞噬作用的能力。本文展示的结果重点关注生活在P. falciparum流行地区女性血浆/血清中自然获得的特异性针对VAR2CSA的抗体。VAR2CSA是一种PfEMP1蛋白，参与感染红细胞在胎盘中的滞留，是妊娠期疟疾（PM）发病机制中的关键决定因素。

该检测可用于检测由免疫接种诱导和/或靶向其他PfEMP1变体或红细胞表面存在的任何其他疟原虫抗原的抗体，前提是所测试的抗体能够与THP-1细胞表达的人Fcγ受体（CD32和CD64）相互作用。该检测方法简单、通量高（可分析大量样本），且可在一天内完成。吞噬作用通过流式细胞术进行测量，定量分析EtBr...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Maiken Visti 提供出色的技术支持。本工作部分由丹麦外交部资助（MAVARECA II；17-02-KU），并由丹麦国际发展署奖学金中心管理。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔细胞培养板，圆底带盖Corning3799可使用任何类似的板，确保其与拟使用的流式细胞仪兼容
AlbuMAX-IIGibco11021-037
AlbuMAX-II (5%)--5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037)，0.2 g/L 次黄嘌呤 (Sigma, H9377) 溶于RPMI1640 (Sigma, R5886)
抗红细胞抗体Abcamab34858分装为每份2μL，-20°C 冻存。每次实验使用一份。
DPBSSigmaP8622
Dynabeads Protein GInvitrogen10003D
溴化乙锭溶液SigmaE1510用RPMI1640 (R5886) 配制0.1 mg/mL的储存液，避光保存
FC500流式细胞仪Beckman Coulter可使用任何支持96孔板格式并具备合适激光器/滤光片以检测EtBr荧光的流式细胞仪
胎牛血清 (FBS)Gibco10099-141使用前需进行热灭活
FITC标记的小鼠抗人CD16抗体BD Biosciences555406 或 556618
FITC标记的小鼠抗人CD32抗体BD Biosciences552883
FITC标记的小鼠抗人CD64抗体BD Biosciences555527
FlowLogic软件Inivai Technologies可使用任何流式细胞术分析软件，例如FlowJo或Winlist
庆大霉素 (10 mg/mL)SigmaG1272
次黄嘌呤SigmaH9377
L-谷氨酰胺 (200 mM)SigmaG7513
裂解液--15 mM NH4Cl，10 mM NaHCO3，1 mM EDTA
MACS CS柱及配件Miltenyi Biotec130-041-305
寄生虫培养基--2 mM L-谷氨酰胺 (Sigma, G7513)，50µg/mL 庆大霉素 (Sigma, G1272)，0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) 溶于RPMI1640 (Sigma, R5886)
青霉素/链霉素 (10000 U 和 10 mg/mL)SigmaP0781
RPMI-1640培养基SigmaR5886
THP-1细胞培养基--10% FBS (Gibco, 10099-141)，2 mM L-谷氨酰胺 (Sigma, G7513)，100 U/mL 青霉素，0.1 mg/mL 链霉素 (Sigma, P0781) 溶于RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS磁铁Miltenyi Biotec

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