肿瘤内异质性是包括胶质瘤在内的各种肿瘤的固有特征。我们开发了一种简单高效的实验方案，通过结合使用多种缓冲液和梯度离心方法，从新鲜冷冻的胶质瘤组织中分离单个细胞核，用于单细胞核RNA测序和ATAC测序研究。
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摘要
摘要
成人弥漫性胶质瘤表现出肿瘤间和肿瘤内的异质性。直到最近，大多数大规模分子谱分析研究主要集中在基于组织块的分析方法上，这些方法推动了脑肿瘤的分子分类。在过去五年中，单细胞测序技术揭示了胶质瘤的多个重要特征。这些研究大多使用新鲜脑肿瘤标本，通过流式细胞术或基于抗体的分离方法来获取单个细胞。未来，利用生物样本库中的新鲜冷冻组织样本将为单细胞应用提供更大的灵活性。此外，随着单细胞研究领域的不断发展，下一步的挑战将是通过单个细胞或同一样本制备获得多组学数据，以更深入地解析肿瘤的复杂性。因此，建立简单且灵活的实验流程，以支持单细胞核RNA测序（snRNA-seq）和单细胞核染色质可及性高通量测序（snATAC-seq）等多种技术的数据生成，将对该领域具有重要意义。
单细胞技术领域的最新进展，结合10x Genomics平台等易于获取的微流控仪器，已推动了单细胞技术在科研实验室中的广泛应用。为了研究脑肿瘤的异质性，我们开发了一种改进的实验方案，用于从新鲜冷冻的胶质瘤组织中分离单个细胞核。该方案整合了现有的单细胞实验方法，结合组织匀浆步骤，随后进行过滤及缓冲液介导的梯度离心。最终获得的样品为高纯度的单细胞核悬液，可用于从同一批细胞核制备物中生成单细胞核基因表达和染色质可及性数据。
引言
弥漫性低级别胶质瘤（LGG）是成人中最常见的原发性脑肿瘤，属于浸润性肿瘤，常发生于大脑半球。LGG表现出明显的肿瘤间和肿瘤内异质性，这种异质性不仅由肿瘤细胞群体驱动，还受到在肿瘤发生和进展过程中复杂参与的非恶性细胞的影响1,2,3,4,5。
在过去十年中，胶质瘤领域积累了大量的基因组学数据。这些数据主要来自肿瘤组织的大规模测序研究，极大地推动了脑肿瘤的分子特征解析及当前的分类体系5,6,7,8,9,10,11。然而，尽管这些研究揭示了与胶质瘤相关的主要分子图谱，但在治疗干预方面仍进展甚微。脑肿瘤治疗耐药的障碍之一是肿瘤内的异质性。为解决这一问题，多项研究已聚焦于肿瘤在单细胞水平上的基因组、转录组、蛋白质组以及表观遗传异质性12,13,14,15,16,17。
尽管近年来单细胞领域取得了显著的技术进步，但主要的限制因素之一是缺乏用于分离细胞并开展这些实验所需的新鲜样本。为克服这一限制，已有多种成功尝试利用冷冻组织中的细胞核而非完整细胞进行检测，例如snRNA-seq和snATAC-seq18,19。这些方法大多依赖于荧光激活细胞分选（FACS）或过滤策略。单细胞和单细胞核方法各有优势与局限。单细胞方法可保留线粒体转录本，这些转录本虽然可能提供有用信息，但因其丰度较高，也可能降低转录组的覆盖深度。而单细胞核分离方法则去除了大部分线粒体成分，从而实现了对细胞核转录本更深入的覆盖20。
近年来，已有多种市售平台被用于检测单细胞基因组学数据，包括RNA-seq和ATAC-seq。其中最突出的平台之一是10x Genomics Chromium平台，可用于单细胞基因表达和单细胞ATAC分析。由于该平台依赖微流控腔室工作，任何碎片或聚集体都可能堵塞系统，导致数据、试剂和宝贵的临床样本丢失。因此，单细胞研究的成功在很大程度上取决于单细胞/细胞核的准确分离。
本文所演示的实验方案是对 DroNc-seq 和 Omni-ATAC-seq 方案进行轻微修改后的结合体，其原理与近期利用单核RNA测序（snRNA-seq）研究人类大脑神经系统疾病及神经元细胞类型的研究相似18,19,21,22,23,24。该方案结合了对冷冻样本的酶解/机械解离、过滤及梯度离心步骤，能够快速且准确地从新鲜冷冻的胶质瘤组织中分离出单个细胞核。我们已成功应用此方案，从脑肿瘤样本的同一批细胞核制备物中获得了单核RNA测序（snRNA-seq）和单核ATAC测序（snATAC-seq）数据。
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方案
新鲜冷冻的胶质瘤样本来自德国海德堡国家肿瘤疾病中心（NCT）组织库。使用患者材料已获得海德堡大学医学院伦理审查委员会的批准，所有参与研究的患者均签署了知情同意书。
1. 实验准备
- 所有步骤均需在冰上或 4 °C 下进行。
- 将离心管、培养皿、剃须刀片、Douncer 匀浆器及研杵预先冷却至 4 °C。
- 提前配制所有缓冲液。这些缓冲液在室温下稳定。建议进行无菌过滤，尤其是蔗糖溶液。储备液的配制方法参考自 Corces 等人19。详见表 1-7。
- 从液氮或 -80 °C 冰箱中取出样品，并在干冰上保存，直至步骤 2.1。
2. 组织解剖与解离
- 将新鲜冷冻组织样本（10–60 mg）转移至预冷的培养皿中。在冰上用剃须刀片将新鲜冷冻组织切成小块。
- 向预冷的1.5 mL离心管中加入500 µL预冷的细胞核裂解缓冲液。将组织小块放入含有细胞核裂解缓冲液的1.5 mL离心管中，并转移至Douncer匀浆器（材料表）。
注意：Dounce匀浆器有两种研杵：“松”或“A”型研杵用于初步破碎样本，“紧”或“B”型研杵用于完全匀浆化样本。 - 使用“松”型研杵匀浆组织约20次，直至摩擦阻力减小。若存在碎片，可用100 µm滤网过滤预清除样本。
- 使用“紧”型研杵再匀浆20次，以实现组织的完全匀浆化。
- 将匀浆液（约500 µL）转移至预冷的2 mL离心管中。加入1 mL预冷裂解缓冲液，轻轻混匀后冰上孵育5分钟。孵育期间使用宽口移液枪头轻柔吹打混匀1–2次。
- 使用30 µm滤网过滤全部匀浆液，收集滤液至15 mL Falcon 管中，再转移至新的预冷2 mL离心管。通常一个滤网即可完成全部匀浆液的过滤。
- 在光学显微镜下检查，确认大块碎片已被去除且核膜完整。细胞核应呈圆形，核膜无变形。若仍有碎片，可对细胞核再次过滤。
- 在台式离心机上以500 × g、4 °C离心5分钟。弃去上清液，保留约50 µL液体与含有细胞核的沉淀。用另1 mL细胞核裂解缓冲液轻柔重悬沉淀，冰上孵育5分钟。
- 再次以500 × g、4 °C离心5分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀，加入500 µL 1×匀浆缓冲液（HB）（表4），冰上孵育5分钟，期间不重悬。随后用另1.0 mL 1× HB重悬细胞核。
- 以500 × g、4 °C离心5分钟。弃去上清液，将细胞核轻柔重悬于200 µL 1× HB中，转移至新的2.0 mL离心管。
3. 梯度离心
- 加入 200 µL 的 50% 碘克沙醇溶液（表 5），使碘克沙醇的终浓度为 25%。用移液器在 300 mL 档位反复吹打 10 次，充分混匀。
- 将 300 µL 的 29% 碘克沙醇溶液（表 6）沿管壁缓慢加入至 25% 混合液下方。使用 P1000 细尖移液枪，避免液体层混合。
- 将 300 µL 的 35% 碘克沙醇溶液（表 7）沿管壁缓慢加入至 29% 混合液下方。使用 P1000 细尖移液枪，避免液体层混合。
注意：此步骤在移液过程中需逐渐抽出移液枪尖端，以避免产生过大的体积位移。 - 将样品置于水平转子离心机中，在 4°C 条件下以 3,500 × g 离心 20 分钟，离心时关闭刹车。
- 轻柔取出样品，避免振荡，并在光线下观察。在第二层与第三层之间应可见一条清晰的白色条带，其中含有纯度达 95% 的细胞核（图 1）。
4. 细胞核的分离
- 吸去上层液体，直至留下位于29%-35%界面处的白色细胞核条带。
- 收集该细胞核条带，总体积为200 mL，转移至新离心管中，并使用20 µm滤膜过滤（材料表）。
注意：过滤前无需重悬细胞核。 - 在光学显微镜下检查，确认已去除大块碎片且核膜完整。细胞核应呈圆形，核膜无变形。
- 使用台盼蓝染色法在血细胞计数板上计数细胞核，并分装用于单核RNA测序（snRNA-seq）或单核ATAC测序（snATAC-seq）。
5. 单细胞核 RNA 和 ATAC 测序
- 使用单细胞基因表达和单细胞ATAC试剂盒（材料表）立即处理细胞核。
注意：10x Genomics 系统的细胞核样本浓度，snRNA-seq 为每 µL 1500–3000 个细胞核，snATAC-seq 为每 µL 3500–7000 个细胞核。可使用 1x PBS 稀释细胞核。 - 在基因组核心设施对接产生的文库进行测序。
- 对数据进行质量控制分析。若细胞核的唯一分子标识符（UMI）数量>1000、基因数>500、线粒体基因占比<5%，且UMI数和基因数处于均值加三个标准差范围内，则纳入后续分析。
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结果
单细胞核基因组学是一个数据和方案均有限的新兴领域。影响单细胞核检测结果的关键因素之一是纯且完整的细胞核的分离。我们结合了两种已发表的方案（DroNc-seq 和 Omni-ATAC-seq 方案），在相对较短的时间内从新鲜冷冻的胶质瘤组织块中分离出高质量且高纯度的细胞核，从而保持转录本的稳定性（图1）。
通过结合多种过滤步骤以及使用碘克沙醇/蔗糖梯度进行梯度离心，可实现细胞核的纯化，同时去除大部分碎片（图2）。同一批分离得到的细胞核可用于单核RNA测序（snRNA-seq）和单核ATAC-seq（snATAC-seq）。重要的是，由于所用细胞核来自同一样本，因此生成的数据可通过Seurat等分析包进行联合嵌入分析，以获得聚类结果并提供多组学视角25（图3）。
为了确定本方案是否可与已发表的单核RNA测序...
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讨论
肿瘤内异质性领域正处于一个令人振奋的发展阶段，新型检测方法和平台不断涌现，推动并拓展了现有认知。在胶质瘤中，肿瘤内异质性是导致疾病进展以及对当前治疗手段产生耐药性的关键因素28。近年来，针对脑肿瘤的研究重点关注这一重要特性，采用单细胞转录组学和表观基因组学检测技术，以更精确地刻画同一肿瘤内部的细胞异质性29,30,31,32。目前在脑肿瘤及其他实体瘤的单细胞检测中面临的一个主要瓶颈是新鲜临床样本的可获得性。为解决这一问题，多项研究已表明，使用新鲜冷冻组织中的细胞核可作为新鲜样本的替代方案，并能成功用于解析细胞异质性18,33。
在此，我们改进了以往的单细胞核分离方法...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢德国癌症研究中心（DKFZ）单细胞开放实验室（scOpenLab）提供的有益讨论。本研究由德国癌症援助基金会Max-Eder项目资助，资助编号70111964（S.T.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| 邓氏匀浆器 | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 15 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 352096 | |
| 碘克沙醇（又称 Optiprep） | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers（30 µm） | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers（100 µm） | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| 细胞核分离试剂盒：Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Sigma | P7626 | |
| 预分离滤器（20 µm） | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| 防漏管 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 防漏管 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| 单细胞ATAC | 10x Genomics | ||
| 单细胞基因表达 | 10x Genomics | ||
| 蔗糖 | Sigma | S0389 | |
| 宽口移液器吸头（1000 µL） | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| 宽口移液器吸头（200 µL） | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
参考文献
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