方法文章

三维运动神经类器官的生成

DOI：

10.3791/61544

⸱

2020年9月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Industrial Science, The University of Tokyo, 2Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, The University of Tokyo, 3Faculty of Science and Engineering, Tecnologico de Monterrey, 4Jiksak Bioengineering, Inc.

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案提供了一种全面的流程，通过在组织培养芯片中由类球体自发组装延伸出强健的轴突束，从而构建人诱导多能干细胞来源的运动神经类器官。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

轴突束是神经系统中观察到的主要结构模式之一。轴突束的破坏可能导致发育性和神经退行性疾病。尽管已有大量关于轴突的研究，但由于缺乏可靠的三维体外模型，我们对轴突束形成及其功能障碍的理解仍然有限。本文中，我们描述了一种基于微流控组织培养芯片从人诱导多能干细胞（iPS细胞）快速生成运动神经类器官（MNO）的逐步实验方案。首先介绍了该方法所用芯片的制备过程。从人iPS细胞出发，形成运动神经元球体（MNS）。随后，将分化后的MNS转移至芯片中。此后，轴突会自发地从球体中生长出来，并在芯片内置的微通道内组装成束，从而形成携带从球体延伸出的轴突束的MNO组织。在后续分析中，可将MNO从芯片中取出，用于固定以进行形态学分析，或进行解剖以开展生化分析、钙成像以及多电极阵列记录。利用本方案生成的MNO有助于药物测试与筛选，并有助于揭示轴突束发育及其相关疾病机制。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脊髓运动神经元（MN）向骨骼肌发出轴突以控制身体运动。在发育过程中，这些轴突的走行具有高度有序性和调控性。尽管已有大量关于轴突延伸与导向的研究1，但轴突束有序形成的机制仍处于探索阶段。运动神经元的轴突常因神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症，ALS）2 而受损，然而轴突束损伤的病理生理机制尚不明确。因此，该领域迫切需要建立一种能够重现轴突束形成与退化的生理和病理模型。

由人类干细胞衍生的运动神经元是研究发育过程及肌萎缩侧索硬化症（ALS）等疾病的一种有前景的平台3。利用患者来源的细胞所获得的人类诱导性多能干细胞（iPS细胞），可用于建立疾病模型。迄今为止，已有多种从多能干细胞分化为运动神经元（MN）的方法被报道4,5,6。然而，在二维培养条件下，神经元的轴突呈随机取向，无法模拟发育中神经内轴突通过密集的轴突-轴突相互作用进行单向排列的真实微环境7。为解决这一问题，我们开发了一种利用人类iPS细胞生成类似运动神经的三维组织的技术8，并将该组织命名为运动神经类器官（MNO）。MNO由位于运动神经元球状体（MNS）内的胞体和从球状体延伸出的轴突束组成。该轴突束中的轴突呈单向排列，类似于发育中运动神经内的轴突结构。因此，MNO独特地提供了以往任何已建立的神经元培养方法均未能实现的生理性轴突微环境。

在本方案中，我们描述了用于组织培养芯片制备、快速运动神经元分化以及在已开发芯片中形成运动神经类器官的方法。我们的组织培养芯片结构非常简单，仅包含一个用于容纳球状体的腔室、一个用于形成轴突束的微通道，以及一个用于容纳轴突末端的腔室。该装置不包含复杂的结构，例如常用于根据尺寸分离轴突和细胞体的微沟槽或微孔滤膜9,10。因此，只要具备光刻设备，即可按照本方案中描述的步骤轻松制备此类装置。

通过优化诱导和模式化因子（SB431542、LDN-193189、视黄酸（RA）和smoothened激动剂（SAG））以及加速因子（SU5402和DAPT）的组合，可实现人iPS细胞的快速分化。已有报道表明，SU5402与DAPT的联用可加速外周神经元和神经嵴细胞的分化11。在本方案中，我们提供了三种不同的MNOs生成方法，以便读者根据自身需求选择最合适的方法。我们推荐在形成球状体后进行人iPS细胞的分化（即三维方法），因为分化的MNS可直接转移至组织培养芯片中。 alternatively，人iPS细胞也可在单层（二维）培养条件下分化为运动神经元，随后如我们先前报道的那样形成三维运动神经元球状体8。我们已对方案进行了更新，采用本方案中描述的三维分化方法，可避免从二维向三维的转换过程，且能够在更短的分化时间、更少的操作步骤以及无需解离步骤的情况下获得MNOs，从而降低技术风险。此外，也可使用 commercially available neurons 生成MNS，以缩短分化所需时间。

为了生成微神经束（MNO），我们在组织培养芯片中培养了微神经球（MNS）。轴突从球状体延伸出来，进入微通道，在微通道中轴突聚集并单向排列。这促进了轴突之间的相互作用，并自发形成紧密组装的单向轴突束组织，该特性为本方案所独有，而其他方案仅能实现自发成束或引导轴突定向排列中的一项12,13,14。在典型实验中，仅有少量细胞从球状体迁移至微通道，大多数细胞仍停留在球状体附近。该方法使轴突能够自发地从球状体中分离出来，无需使用依赖尺寸的物理屏障（例如微沟槽或微孔滤膜）将轴突与胞体分离。

所得的运动神经类器官（MNO）可进行多种检测，包括形态学、生物化学和物理分析。通过切割可将细胞体和延伸的轴突束在物理上分离，并可分别用于后续实验，例如生物化学分析。仅从少数几束轴突中即可分离出RNA和蛋白质等生物材料，用于常规生物化学实验，包括RT-PCR和蛋白质印迹（western blotting）。本文中，我们描述了一种由诱导多能干细胞（iPS细胞）生成运动神经类器官的实验方案，该模型为研究轴突束发育及其相关疾病机制提供了理想的生理与病理研究平台。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 通过光刻法制作SU-8模具

注意：该实验步骤涉及危险化学品。全程须在通风橱中操作，并穿戴个人防护装备。

  1. 用丙酮清洗硅片（直径4英寸，厚度1毫米，抛光），并用氮气吹干。然后在180 °C下烘烤3分钟以彻底干燥。
  2. 将3 mL SU-8 2100滴加到已清洁的硅片上。
  3. 使用旋涂仪以500 rpm转速旋涂10秒，随后以300 rpm/s的加速度升至1500 rpm继续旋涂30秒，使SU-8在硅片表面均匀成膜，厚度约为150 µm。
    注意：确保硅片位于旋涂仪中心，并通过真空牢固固定。
  4. 将硅片置于热板上进行前烘，依次在50 °C下加热10分钟、65 °C下7分钟、95 °C下45分钟。
  5. 将光掩模（图1）安装至掩模对准器，并用365 nm紫外光曝光60秒。
    注意：曝光时间需根据紫外光剂量进行优化。
  6. 曝光后，将硅片置于热板上，依次在65 °C下烘烤6分钟、95 °C下烘烤13分钟。
  7. 将硅片放入SU-8显影液中，在轨道摇床上震荡显影10–20分钟，过程中更换一次显影液。
    注意：若仍有SU-8残留物，可适当延长显影时间。
  8. 用异丙醇冲洗硅片，并用氮气轻轻吹干。
  9. 使用测量显微镜测定SU-8薄膜的高度，确认其厚度约为150 µm。样品可在室温下长期保存。

2. 基于PDMS微流控的组织培养芯片制备

  1. 用双面胶带将涂有SU-8的晶圆固定在容器中（例如，15 cm塑料培养皿）。
  2. 使用氮气吹去晶圆表面的灰尘。
  3. 进行硅烷化处理时，将涂有SU-8的晶圆与一个小容器（例如，35 mm培养皿）一同放入真空腔室中。在小容器内滴加10 µL的（十三氟-1,1,2,2-四氢辛基）-1-三氯硅烷。切勿将（十三氟-1,1,2,2-四氢辛基）-1-三氯硅烷直接施加到SU-8晶圆上。
  4. 紧密关闭真空腔室，并开启真空泵至少2小时。
  5. 取一个塑料杯，按10:1的质量比倒入硅弹性体（例如，Silpot 184或等效的Sylgard 184）和固化剂。然后用刮刀充分混合，并在真空腔室中脱气，直至完全去除气泡。
  6. 将PDMS混合物倒入装有SU-8晶圆的容器中，达到所需厚度（3–4 mm），并再次脱气以去除气泡。
  7. 将PDMS在60 °C烘箱中加热至少3小时，使其完全固化。
  8. 冷却后，使用解剖刀或剃刀片将固化的PDMS从晶圆上切下。
  9. 为构建组织培养芯片的两个腔室，使用直径为1.5 mm的活检打孔器在两个隔室位置打孔。
  10. 为制备培养基储液池，另配制一份PDMS混合物（硅弹性体与固化剂按10:1质量比混合），倒入一个新的10 cm培养皿中。调节倒入量，使PDMS厚度达到5 mm。
  11. 将PDMS在60 °C烘箱中加热至少3小时，使其完全固化。
  12. PDMS冷却后，用解剖刀将其切割成矩形环状。
  13. 通过在底层与储液池之间涂布未固化的PDMS，并对组装好的PDMS层进行烘烤，实现两者的键合。该键合结构即形成PDMS组织培养芯片。
  14. 使用透明胶带清洁PDMS组织培养芯片表面，以去除灰尘和微小颗粒。若避免灰尘和紫外光照射，PDMS组织培养芯片可在室温下保存。

3. 培养物的制备

  1. 培养基
    注意：以下所列所有培养基均应过滤除菌，除非另有说明。配制好的培养基可在 4 °C 保存，并在一个月内使用。
    1. 配制 mTeSR Plus 培养基：将一瓶 100 mL 的 mTeSR Plus 5x 添加剂与一瓶 400 mL 的 mTeSR Plus 基础培养基混合。
    2. 配制 100 mL KSR 培养基：在 85 mL DMEM/F12 中加入 15 mL Knockout 血清替代物（KSR，15%）、1 mL 商业谷氨酰胺添加剂（1%）和 1 mL 非必需氨基酸（NEAA，1%）。
    3. 配制 100 mL N2 培养基：在 100 mL Neurobasal 培养基中加入 1 mL N2（100x）、1 mL 商业谷氨酰胺添加剂和 1 mL NEAA。
    4. 配制 250 mL 成熟培养基：在 250 mL Neurobasal 培养基中加入 5 mL B27（2%）、2.5 mL 商业谷氨酰胺添加剂（1%）和 2.5 mL 青霉素/链霉素（1%）。
    5. 将化合物（视黄酸（RA）、SB431542、LDN-193189、SU5402、DAPT、SAG、Y-27632）用细胞培养级 DMSO 溶解至所需浓度。分装后于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。以下为所用储存液浓度：1 mM RA、10 mM SB431542、100 μM LDN-193189、10 mM SU5402、10 mM DAPT、1 mM SAG、10 mM Y-27632。
  2. 包被
    注意：为防止基底膜基质受热聚合，应避免反复冻融。尽可能使用预冷的移液枪头和离心管进行所有包被操作。基底膜基质应在 4 °C 过夜解冻，并使用预冷的移液枪头和离心管进行分装。分装后的基质可于 -20 °C 或 -80 °C 冻存。
    1. 在冰上于 4 °C 解冻冷冻分装的基质。包被过程中应始终保持低温。使用预冷的移液枪头，按 1:40 的比例用预冷的 DMEM/F12 稀释基底膜基质。未用完的稀释基质若未发生聚合，可在 4 °C 保存 2–3 天。
    2. 向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 基底膜基质/DMEM/F12 混合液以进行包被。
    3. 在室温下孵育至少 1 小时，或在 4 °C 过夜孵育。包被后的培养板可在 4 °C 最多保存一周。

4. iPS 细胞的维持

注意：在此方案中，未分化的iPS细胞在mTeSR Plus培养基中维持培养，当在6孔板中观察到细胞融合度≥90%时进行传代。对于在其他培养基中培养的iPS细胞，可能需要进行微小调整。

  1. 按照步骤 3.2 中所述方法制备包被基底膜基质的培养皿。
  2. 完全吸除 mTeSR Plus 培养基。用 PBS 洗涤一次，加入 0.5 mL 传代试剂（见材料表）。静置数秒后吸除溶液。
  3. 将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟，或直至细胞变圆。
    注意：不同 iPS 细胞系及不同汇合度下，孵育时间可能有所差异。请在孵育过程中定期在显微镜下观察，以确定合适的解离时间。
  4. 加入 1 mL mTeSR Plus 培养基，轻敲培养板 30–60 秒，使细胞集落脱落。
  5. 将 1 mL 细胞悬液轻柔混匀于 7 mL 新鲜 mTeSR Plus 培养基中。吹打次数不得超过 5 次。
  6. 按 1:8 的比例接种。通常取步骤 4.5 中的 1 mL 悬液，加入 1 mL 含 5–10 μM Y-27632（ROCK 抑制剂）的 mTeSR Plus 培养基。传代稀释比例取决于 iPSC 细胞系。
  7. 将细胞置于 5% CO2 / 37 °C 培养箱中培养。次日通过更换新鲜 mTeSR Plus 培养基去除 Y-27632。此后初期每隔一天换液一次，当细胞汇合度升高后改为每天换液。

5. 将iPS细胞分化为运动神经元

注意：以下所有选项（5.2、5.3 和 5.4）均可生成效率 > 90% 的 MNOs。

  1. 用于运动神经元分化的iPSC传代
    注意：分化可成功采用3D（5.2）或2D（5.3）方案进行。
    1. 在6孔板中，使用mTeSR Plus培养基培养未分化的iPS细胞，直至其汇合度达到约80%。
    2. 完全吸除培养基，立即用无菌PBS洗涤一次，并向细胞中加入0.5 mL细胞解离溶液。
    3. 将培养板置于37 °C培养箱中孵育约2-3分钟，或直至细胞分离并变圆但仍附着于孔底。
    4. 加入1 mL培养基，使用5 mL血清移液管轻轻吹打数次，将细胞悬液转移至含有4 mL培养基的15 mL离心管中。
    5. 以200 x g离心3分钟。
    6. 小心吸除上清液，保留细胞沉淀，并将细胞重悬于1 mL添加了10 µM Y-27632的培养基中。
    7. 使用血球计数板对细胞进行计数，随后进行5.2（3D分化）或5.3（2D分化）步骤。
  2. 3D分化中运动神经元类球体（MNS）的形成（“3D方案”）
    注意：从分化第0天至第12天，每天进行一次完全换液（图2）。
    1. 将步骤5.1.7获得的iPS细胞以每孔40,000个细胞接种至96孔U型底板中，体积为100 µL，培养基为添加了10 µM Y-27632的mTeSR Plus。
    2. 次日，每孔更换100 µL新鲜培养基。
    3. 第0和第1天：吸除培养基，更换为100 µL添加了10 µM SB431542和100 nM LDN-193189的KSR培养基（3.1.2）。
    4. 第2和第3天：吸除培养基，更换为100 µL添加了10 µM SB431542、100 nM LDN-193189、5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的KSR培养基。
    5. 第4和第5天：配制由75% KSR培养基和25% N2培养基（3.1.3）组成的混合培养基。吸除原培养基，更换为100 µL添加了10 µM SB431542、100 nM LDN-193189、5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的混合培养基。
    6. 第6和第7天：配制由50% KSR培养基和50% N2培养基组成的混合培养基。吸除原培养基，更换为100 µL添加了5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM视黄酸（retinoic acid）和1 µM SAG的混合培养基。
    7. 第8和第9天：配制由25% KSR培养基和75% N2培养基组成的混合培养基。吸除原培养基，更换为100 µL添加了5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的混合培养基。
    8. 第10和第11天：更换为100 µL添加了5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的N2培养基。
    9. 第12天：将MNS转移至组织培养芯片（步骤6），或更换为100 µL添加了20 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）的成熟培养基（3.1.4）。
      注意：MNS可在第12至第19天之间转移至组织培养芯片。未转移的类球体应继续在96孔U型底板中培养，使用添加了20 ng/mL BDNF的成熟培养基维持培养，直至转移。
  3. （替代方案）2D分化及向3D MNS的转化（“2D方案”）
    1. 从预包被的12孔板中吸除包被液。
    2. 将步骤5.1.7获得的iPS细胞以每孔100,000–200,000个细胞的密度接种至含10 µM Y-27632的mTeSR Plus培养基中。
      注意：若细胞密度过稀，无法满足下一步（5.3.3）要求，则继续在不含Y-27632的mTeSR Plus培养基中培养未分化的iPS细胞，直至细胞汇合度达到80%。
    3. 第0和第1天：吸除培养基，更换为1 mL添加了10 µM SB431542和100 nM LDN-193189的KSR培养基（3.1.2）。
    4. 第2和第3天：吸除培养基，更换为1 mL添加了10 µM SB431542、100 nM LDN-193189、5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的KSR培养基。
    5. 第4和第5天：配制由75% KSR培养基和25% N2培养基（3.1.3）组成的混合培养基。吸除原培养基，更换为1 mL添加了10 µM SB431542、100 nM LDN-193189、5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的混合培养基。
    6. 第6和第7天：配制由50% KSR培养基和50% N2培养基组成的混合培养基。吸除原培养基，更换为1 mL添加了5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM视黄酸和1 µM SAG的混合培养基。
    7. 第8和第9天：配制由25% KSR培养基和75% N2培养基组成的混合培养基。吸除原培养基，更换为1 mL添加了5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的混合培养基。
    8. 第10和第11天：更换为1 mL添加了5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的N2培养基。
    9. 第12天：吸除分化培养基，快速用PBS洗涤一次，加入0.5 mL细胞解离培养基。将培养板置于37 °C培养箱中孵育1-3分钟（如使用TrypLE Express）或20-30分钟（如使用Accutase）。
    10. 使用P1000移液器轻柔收集细胞，转移至含有新鲜成熟培养基的15 mL离心管中，以200 x g离心3分钟。若细胞成团，可轻柔吹打数次，但避免过度吹打以免损伤细胞。
    11. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL添加了20 ng/mL BDNF的成熟培养基（3.1.4）中。
    12. 使用血球计数板对细胞进行计数。将细胞以每孔10,000–40,000个细胞的密度接种至96孔U型底板中，使用添加了20 ng/mL BDNF的成熟培养基。初始接种密度应根据iPS细胞系及细胞状态进行优化，以确保类球体在进入组织培养芯片时直径达到800–900 μm。大多数情况下，可先以每孔20,000个细胞起始，再根据类球体大小调整细胞数量。
    13. 继续培养3–10天，直至细胞形成边缘光滑的类球体。
  4. （替代方案）：由运动神经元形成MNS
    注意：可使用市售的人iPS细胞来源的运动神经元（见材料表）生成MNOs，而非从人iPS细胞进行分化。
    1. 解冻运动神经元冻存管后，立即用9 mL运动神经元培养基重悬细胞。室温下以400 x g离心5分钟。
    2. 吸除上清液，用运动神经元培养基重悬细胞沉淀。
    3. 按照上述步骤（5.3.12–5.3.13）操作以生成MNS。

6. 运动神经类器官（MNO）形成的组织培养芯片制备

  1. 将已制备的PDMS（来自步骤2.13）浸入培养皿中的70%乙醇中，至少浸泡1小时以进行灭菌。
    注意：后续所有操作均应在生物安全柜中进行。
  2. 将显微镜载玻片（76 × 52 mm）浸入培养皿中的70%乙醇中进行灭菌。
  3. 在显微镜载玻片干燥过程中，将PDMS装置放置于半湿润的载玻片上，并静置过夜使其完全干燥。完全干燥后，PDMS装置应牢固粘附于玻片表面。
    注意：该粘附方式为非永久性，以便在培养结束后将PDMS装置从载玻片上剥离，用于组织采集。若采用氧等离子体进行永久性键合，可增强PDMS与玻璃之间的粘附力，但会阻碍芯片拆卸及组织回收。
  4. 使用DMEM/F12培养基按1:40稀释的基底膜基质溶液，取30 μL滴加至PDMS装置微通道及显微镜载玻片表面；将液滴置于通道入口一侧，再用移液器或抽吸泵从另一侧缓慢吸取溶液（图3A）。吸取时避免过度抽吸，以防引入气泡污染。
  5. 随后，将PDMS装置置于次级容器（例如培养皿）中，在室温下孵育1小时，或在4 °C下孵育过夜。

7. 运动神经类器官（MNO）的形成

  1. 使用前，将包被液更换为预热的150 µL成熟培养基，并添加20 ng/mL BDNF。
  2. 然后，使用带宽口吸头的移液器将步骤5.2.9或5.3.13中获得的MNS加入微通道入口。MNS可通过重力自然沉降到装置底部。注射MNS时切勿施加过大压力（图3B）。
    注意：若MNS卡在组织培养芯片孔的侧壁上，可从入口另一侧轻轻抽吸溶液。
  3. 用无菌水填充一个小储液池（例如15 mL离心管的管盖），并将其放置在组织培养芯片附近的次级容器中，以防止培养基蒸发。随后将装置置于5% CO2/37 °C培养箱中。
  4. 更换培养基时，从培养基储液池中央吸除废弃培养基（图3C）。切勿将培养基和组织全部吸除。
  5. 轻柔加入新鲜的成熟培养基（含BDNF）。每2–3天更换一次培养基。培养过程中任何时候均不得使培养基干燥。轴突将在2–3周内从MNS延伸进入通道，并自发组装成单一束状结构，从而形成MNO。MNO可在该装置中继续培养超过1个月。

8. MNO 的下游分析

  1. 整体免疫染色
    1. 将装置或培养皿移至化学通风橱中。通过向培养基中加入约等体积的8%多聚甲醛（PFA），使终浓度达到4% PFA，对MNO进行固定。将PDMS装置从玻璃上剥离，并在室温下孵育15–20分钟。
    2. 用PBS洗涤MNO，随后重复PBS洗涤2次。
    3. 使用含0.2% Triton X-100的PBS对MNO进行透化处理，在室温下孵育5分钟。
    4. 用PBS洗涤MNO，随后重复PBS洗涤2次。然后使用含1% BSA的PBS对MNO进行封闭，在室温下孵育1小时。
    5. 将一抗用含0.1% BSA的PBS稀释后，于4 °C下与MNO孵育过夜。用PBS洗涤MNO三次。
    6. 将二抗用含0.1% BSA的PBS稀释后，在室温下与MNO孵育2小时。随后用PBS洗涤MNO三次。
    7. 使用含0.2% Triton-X的PBS中加入Hoechst对MNO进行染色，在室温下孵育5分钟。
    8. 用PBS洗涤MNO三次。免疫染色完成的MNO即可用于荧光或共聚焦激光显微镜成像。
  2. 组织采集与轴突束分离
    1. 将10 mL HBSS溶液倒入10 cm培养皿中。随后将整个PDMS装置浸入HBSS溶液中。
    2. 在体视显微镜下小心地将PDMS从显微镜载玻片上剥离。当组织粘附在PDMS装置上时，使用移液器从孔的顶部轻轻加入1 mL HBSS溶液。
    3. 一旦组织从PDMS上脱落，轻轻在显微镜载玻片上加入1 mL HBSS，以彻底将PDMS从载玻片上分离。
    4. 为从类球体中分离轴突束，在显微镜下使用手术刀或镊子切断轴突束。切断位置应略远离类球体（> 1 mm），以避免迁移细胞的污染。
    5. 分离得到的轴突束和类球体可进一步用于多种下游分析，如RT-PCR、RNA-seq和蛋白质印迹（western blotting）。
    6. PDMS培养芯片可重复使用。清洁时，先将芯片置于蒸馏水中超声处理15分钟，随后在含1%去污剂的蒸馏水中再次超声处理。最后用蒸馏水洗涤芯片5次。
  3. 钙成像
    注意：可在从组织培养芯片（见8.2节）采集组织前后，使用钙离子指示剂检测神经元活性。本方案基于特定商用试剂盒（参见材料表），也可选用其他钙成像试剂盒或等效方法。
    1. 用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤MNO三次。
    2. 在记录培养基（20 mM HEPES、115 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.8 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、13.8 mM葡萄糖）中加入5 μM Fluo-4AM，与组织在37 °C下孵育30–60分钟。添加0.01–0.02% Pluronic F-127有助于Fluo-4 AM进入细胞。
    3. 随后用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤组织，并更换为记录培养基。
    4. 使用配备GFP/Cy2滤光片组的荧光显微镜采集延时图像。每帧曝光时间应小于20 ms。
    5. 使用Image J将采集的视频文件作为图像序列打开。
    6. 若使用彩色CCD或CMOS相机，需将RGB图像转换为16位单色图像。打开“分析 | 工具 | ROI管理器”，绘制感兴趣区域并点击“添加”。点击“多点测量”，多个感兴趣区域的平均荧光强度将显示在结果窗口中。
    7. 使用通用数据分析软件绘制信号强度变化曲线。
  4. 使用多电极阵列测量神经元活性
    注意：运动神经元的活性可通过多电极阵列（MEA）进行记录。
    1. 构建MNO后，将其转移至涂有基底膜基质的MEA探针上，并将组织置于电极位置。
    2. 加入200 µL成熟培养基，在37 °C下孵育1–2小时，使MNO附着于探针表面。
    3. 更换为记录培养基（8.3.2节）。可选地，在MNO上方放置网格和重物，以增强其与电极的接触。
    4. 将MEA探针安装至记录头阶段。用70%乙醇擦拭MEA探针与头阶段之间的接触面。
    5. 按照MEA设备制造商的操作说明开始记录神经元活性。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在三维分化程序中，运动神经元在12至14天内完成分化（图4 和 图5）。重要的是，在分化过程中，超过60%的细胞表达了运动神经元标志物HB9。免疫组织化学结果显示，MNS中约80%的细胞为SMI32阳性的运动神经元。HB9和SMI32是公认的早期运动神经元标志物15,16。HB9和SMI32的表达是确认运动神经元细胞身份所需验证的关键参数。将MNS引入培养芯片后，轴突延伸进入通道并形成轴突束。由于微通道起到物理引导作用，轴突从MNS延伸出来，并通过轴突-轴突相互作用形成束状结构（图6A）。必须通过显微观察确认轴突束的形成，以验证MNO的成功构建。一个成功的MNO应具有宽度超过50 μm的轴突束，且通道中束外孤立的轴突较少。在类球体接种后24小时即可观察到轴突的初始延伸。在接下来的3至4天内，轴突延伸至微通道的中心区域，并在随后的10天内进一步延伸至通道的另一端（图6A）。最终，轴突在芯片中于2至3周内组装形成笔直且单向的轴突束，之后可观察到神经元活动。

可通过将PDMS从显微镜玻璃上剥离，从芯片中收集运动神经类器官，用于生物学分析（图6B）。在显微镜下使用手术刀或镊子切割，可分离出轴突束和细胞体（图6B）。这些生物材料（包括RNA和蛋白质）可用于常规的生物化学检测，如RT-PCR和蛋白质印迹（western blotting）。在MNOs的轴突束中，蛋白质印迹检测不到细胞核或树突标志蛋白（图6C）。

结合钙离子指示剂（Fluo-4 AM），可在组织培养芯片中捕捉神经元活动。在MNO中观察到类球体及轴突束中运动神经元的自发性活动。此外，还通过多电极阵列系统观察到了神经活动。

用于流体分析和实验的微流控装置示意图，显示通道布局和尺寸。
图1：PDMS组织培养芯片的尺寸。
(A) 组织培养芯片的光刻掩模图。(B) 组织培养芯片中微通道的尺寸。用于容纳运动神经元球体的基底腔室直径为2 mm，PDMS在腔室上方的孔径为1.5 mm。连接两个腔室的微通道宽度和高度均为150 μm。请点击此处查看此图的放大版本。

iPS细胞向运动神经元类器官的分化；神经组织研究的2D/3D方案示意图。
图2：运动神经元分化的示意图。
(A) 分化过程包括神经诱导、定向分化为运动神经元谱系以及运动神经元的成熟阶段。(B) 从iPS细胞生成运动神经元球体（MNS）的两种方案：3D方案，以及包含运动神经元解离步骤的2D方案。两种方案均可获得运动神经类器官（MNO）。请点击此处查看该图的放大版本。

PDMS 装置包被和培养基流动示意图；步骤包括吸液、孵育和注射设置。
图 3：基底膜基质包被及运动神经元类球体引入的逐步操作流程。
(A) 在组织培养芯片的通道内进行基底膜基质包被。(B)) 将运动神经元类球体（MNS）引入芯片的孔中。(C) 通过吸除耗尽的培养基更换培养液。请点击此处查看该图的放大版本。

菌落形成过程，显微镜图像；细胞在12天内的生长阶段，从-D2到D12。
图4：二维和三维运动神经元分化。
(A) 典型的三维MNS分化时间进程（三维方案）。MNS的尺寸随时间逐渐增大。比例尺：500 μm。(B) 二维分化在-D2、D0、D1、D6、D12的时间进程（二维方案）。比例尺：500 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

三维和二维神经网络显微图像，颜色编码的免疫染色，SMI-32，Hoechst。
图 5：运动神经元的表征。
(A)（左）使用 SMI-32 抗体和 DAPI 染色的运动神经元球（MNS）冰冻切片。（中）重新接种在基底膜基质包被表面的 MNS 的相差图像，可见轴突延伸。（右）重新接种的 MNS 轴突经 Synapsin I 和 Tuj1 抗体染色。比例尺：500 μm（左和中）和 50 μm（右）。(B) 二维培养的运动神经元经 Tuj 和 HB9 抗体免疫染色的代表性图像。比例尺：200 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

神经元分离过程；微流控装置、轴突生长、细胞标记物分析、显微镜观察。
图6：在培养芯片中生成的运动神经类器官（MNO）的表征。
(A) 第32天轴突延伸及粗大轴突束形成的代表性图像。比例尺：500 μm。(B) 运动神经类器官（MNO）经SMI-32和DAPI免疫染色。可通过物理切割分离轴突与胞体。比例尺：1 mm。(C) 通过Western blot定量分析来自轴突和胞体的蛋白质纯度。树突标志物MAP2在轴突蛋白中未被检测到，而轴突标志物Tau1在轴突蛋白中富集。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种运动神经类器官（MNO）的构建方法，该类器官由人诱导多能干细胞（iPS细胞）分化生成的运动神经元球体延伸出轴突束。所形成的轴突束结构厚实、柔韧，并呈现良好的单向有序排列。通过分离轴突束，可获得足量且高纯度的轴突蛋白和RNA，适用于生化分析。利用钙成像技术，可在轴突束和神经元球体中检测神经元活性。Western blot检测未发现轴突裂解物中存在细胞核和树突蛋白的污染，表明本方法能高效地将轴突与胞体及树突分离。

该方案的一个优势在于能够快速分化并生成带有轴突束的运动神经元类器官（MNO），采用三维方案可在4周内完成全部过程，而二维方案则需5至6周。与其他方案相比，这一时间较短，因为其他方案通常仅将胚胎干细胞和诱导多能干细胞分化为运动神经元就需要3至4周。17 并且需要额外2-4周才能获得轴突延伸。由于分化时间更短、步骤更少，且与二维方案相比无需解离步骤，技术风险更低，因此通常优先采用三维方案。基于微流控的组织培养芯片设计为使运动神经元的轴突可通过微通道向另一腔室延伸，从而通过诱导轴突-轴突相互作用及轴突间的亲和性，促进轴突束的形成。由于实验装置简单，此处描述的所有方案不仅可由熟悉组织培养芯片操作的生物工程师完成，也适合不熟悉微流控和微加工技术的生物学家和神经科学家。需要注意的是，步骤1和步骤2也可通过外部加工服务完成。

完成该方案的关键步骤之一是培养基的顺序更换。建议在分化过程中的每一步都完全更换培养基，以避免耗尽的培养基中的因子干扰运动神经元的分化。该方案的另一个关键点是保持未分化iPS细胞的良好质量。初始iPS细胞培养的质量显著影响获得运动神经元和运动神经元球（MNO）的效率。此外，运动神经元球（MNS）的直径应小于芯片孔径（1.5 mm）。过大的类球体无法进入腔室，并可能在中心区域发生严重的缺氧性坏死。MNS的大小可通过调整初始接种的iPS细胞数量（在3D方案中）或运动神经元数量（在2D方案中）来控制。细胞的接种密度应针对每种iPS细胞系进行优化。

带有微沟槽和小孔径滤膜的分区微流控装置已被广泛用于将轴突与细胞体及树突分离开来。该技术还能实现轴突与细胞体及树突的分离，并在束状组织中获得更高丰度的轴突。与其它方法相比，该方法的一个主要局限在于，当前组织培养芯片的设计无法分离两种不同的培养基，从而限制了需要两种不同培养基的两类细胞共培养的应用。另一个局限是，PDMS芯片对组织尺寸施加了预先设定的限制：大于孔径的类球体无法进入腔室，且轴突束的生长厚度不能超过微流控通道的宽度。

该方法可应用于其他类型的神经元。本研究团队已证明，通过结合脑类器官技术并采用改进的方法，能够构建脑部神经束18。将皮层类球体引入两个腔室后，轴突会自发地相互向对方类球体延伸，并最终自发形成轴突束。结果表明，两个皮层类球体可通过轴突束连接，且该组织可作为一个整体被完整获取。这说明该方法在构建轴突束组织方面具有高度通用性，不受神经元细胞类型的限制。本方案中使用了人诱导多能干细胞（iPS细胞），但其他干细胞（如人胚胎干细胞和人神经干细胞）也可在对本方案进行适当修改后加以应用。神经元的三维类球体可通过多种不同方案生成19,20。未来，这种构建含轴突束组织的方法有望与其他用于生成三维运动神经元类球体的分化方案相结合。此外，通过简单调整组织培养芯片中微通道的宽度和高度，即可控制轴突束的厚度和长度，为后续发展提供可调控性。

我们认为，该方案可用于药物测试与筛选，并有助于理解轴突束发育及其相关疾病的发生机制。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本方案的部分内容中，一项专利已授权给由 Jiro Kawada 创立的 Jiksak Bioengineering, Inc.。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由日本科学促进会（JSPS）科学研究费补助金17H05661和18K19903、Core-to-Core计划以及Beyond AI研究所资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷Sigma440302
16% 甲醛（多聚甲醛）水溶液电子显微镜科学公司15710
200µ宽口移液器吸头BMBioBMT-200WRS
6孔板Violamo2-8588-01
AccutaseICTAT104
B-27添加剂（50倍浓缩）Gibco17504044
牛血清白蛋白SigmaA6003
脑源性神经营养因子（BDNF）和光020-12913
CO2培养箱松下MCO-18AIC
Cryostor CS10干细胞技术07959
DAPTSigmaD5942
DMEM/F12SigmaD8437
Fluo-4 AMDojindo LaboratoriesCS22
GlutaMAX 补充剂Gibco35050-061
生长因子减少型基质胶（基底膜基质）康宁354230
HB9 抗体Santa Cruzsc-22542
HBSS和光085-09355
Hoechst 33342Sigma14533
iCell 运动神经元（商品化的人iPS细胞来源的运动神经元）细胞动态R1051
异丙醇（IPA）和光166-04836
胎牛血清替代物（Knock Out Serum Replacement）Gibco10828028
LDN193189SigmaSML0559
MEA探针Alpha MED Scientific 公司MED-P5004A
MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）（NEAA）SigmaM7145
显微镜玻璃MatsunamiS9111
mTeSR Plus干细胞技术05825
N2 补充剂和光141-08941
Neurobasal 培养基Gibco21103049
青霉素-链霉素Gibco15140122
光刻胶 SU-8 2100微化学#SU-8 2100
96U 表面包被住友电木MS-9096U
ReLeSR（传代试剂）干细胞技术05872
视黄酸和光186-01114
SAGSigmaSML1314
SB431542和光192-16541
硅片SUMCOPW-100-100
Silpot 184 w/c 试剂盒Dow ToraySilpot 184 w/c 套件
Smi32 抗体Biolegend801701
SU5402SigmaSML0443
SU-8 显影液微化学Y020100
突触素 I 抗体默克密理博Ab1543
不含酚红的 TrypLE Express 液体（解离液）Gibco12604-021
Tuj1 抗体Biolegend801202
Y-27632和光030-24021

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raper, J., Mason, C. Cellular strategies of axonal pathfinding. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933(2010).
  2. Ito, Y., et al. RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS. Science. 353 (6299), 603-608 (2016).
  3. Fujimori, K., et al. Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent. Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).
  4. Chen, H., et al. Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons. Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).
  5. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
  6. Imamura, K., et al. The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis. Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).
  7. Wang, L., Marquardt, T. What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).
  8. Kawada, J., et al. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).
  9. Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. JoVE. (141), e58421(2018).
  10. Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. JoVE. (147), e59250(2019).
  11. Chambers, S. M., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).
  12. Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions. bioRxiv. , (2020).
  13. Cullen, D. K., et al. Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids. iScience. 21, 57-67 (2019).
  14. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).
  15. Egawa, N., et al. Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).
  16. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).
  17. Qu, Q., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5 (1), 3449(2014).
  18. Kirihara, T., et al. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions. iScience. 14, 301-311 (2019).
  19. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  20. Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

iPS PDMS BDNF

相关文章