通过固定CD47衍生肽减少血液来源细胞在金属植入物上的黏附

摘要

本文介绍了一种利用聚双膦酸盐化学方法将肽CD47（pepCD47）偶联到金属支架上的实验方案。使用pepCD47对金属支架进行功能化修饰可防止炎性细胞的黏附与活化，从而提高其生物相容性。

摘要

金属裸支架和药物洗脱支架相关的主要并发症分别为支架内再狭窄和晚期支架内血栓形成。因此，提高金属支架的生物相容性仍然是一个重大挑战。本实验方案旨在介绍一种通过生物活性肽对金属表面进行修饰的可靠技术，以提高包括血管内支架在内的血液接触型医用植入物的生物相容性。CD47是一种具有种属特异性的“自我”免疫标志物，具有抗炎特性。研究表明，CD47胞外区免疫球蛋白结构域对应的22个氨基酸肽段（pepCD47）具有与全长蛋白相似的抗炎作用。本实验室在大鼠体内的研究以及在兔和人血液系统中的离体实验表明，将pepCD47固定于金属表面可通过抑制炎症细胞的黏附与活化来改善其生物相容性。本文详细描述了金属表面功能化及肽段固定的逐步操作流程。首先采用含潜伏性巯基的聚烯丙胺双磷酸酯（PABT）对金属表面进行修饰，随后脱保护释放巯基，并通过与含吡啶二硫基团的聚乙烯亚胺（PEI-PDT）反应，扩增巯基反应位点。最后，通过二硫键将含有终端半胱氨酸残基、并通过双8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基间隔臂连接至核心肽序列的pepCD47肽段共价连接至金属表面。该肽段固定方法高效且成本相对较低，因此可广泛应用于多种金属生物材料的生物相容性改良。

引言

经皮冠状动脉介入治疗是治疗冠状动脉疾病（CAD）的首选疗法，主要通过对病变动脉进行支架置入来实现。然而，支架内再狭窄（ISR）和支架内血栓形成是支架植入后常见的并发症¹血液与支架界面的相互作用表现为血浆蛋白几乎立即在金属表面吸附，随后血小板和炎症细胞发生黏附与活化²活化的炎性细胞释放炎性细胞因子和趋化因子，可导致血管中膜层的血管平滑肌细胞（VSMCs）发生表型改变，并触发其向内膜腔室的向心性迁移。活化的VSMC在内膜层中增殖，引起内膜增厚、管腔狭窄以及支架内再狭窄。³药物洗脱支架（DES）的研发旨在抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖；然而，这些药物对内皮细胞具有脱靶性的细胞毒性作用。^4,5因此，晚期支架内血栓形成是药物洗脱支架（DES）常见的并发症^6,7由可生物降解聚合物（如聚-L-丙交酯）制成的支架在动物实验和早期临床试验中显示出良好前景，但在“真实世界”临床应用中因其性能劣于第三代金属药物洗脱支架而最终被召回^rd 生成DES⁸因此，有必要提高金属裸支架的生物相容性，以改善患者的临床预后....

方案

本实验所用所有人源样本均按照费城儿童医院机构审查委员会（IRB）的规定获取。所有动物实验均经费城儿童医院动物护理与使用委员会（IACUC）批准后进行。

1. 使用 PEI-PDT 涂覆裸金属表面

1. 用异丙醇清洗不锈钢箔片试样（1 cm × 1 cm 或 0.65 cm × 1 cm）或不锈钢网片  在摇床中（60 °C，200 rpm）振荡 5 分钟。此步骤重复 2 次。随后用氯仿洗涤 2 次，每次 10 分钟（60 °C，200 rpm）。
2. 将清洗后的不锈钢样品置于 220 °C 的烘箱中加热 30 分钟。
3. 通过将25 mg含潜伏性巯基的聚烯丙基胺双膦酸盐（PABT）和5 mg碳酸氢钾（KHCO₃）溶解于5 mL溶液中，配制0.5% PABT溶液。₃在5 mL去离子水中溶解，并在72 °C、200 rpm条件下于摇床中孵育30分钟。
   注意：PABT 的合成请参考先前发表的文献¹⁸.
4. 将焙烧后的箔片或网状圆盘浸入0.5%的PABT水溶液中，在摇床中孵育1小时（72 °C，转速200 rpm）。
5. 用去离子蒸馏水（DDW）洗涤经PABT修饰的样品5次，将样品转移至新离心管中，再用DDW洗涤5次。
6. 将60 mg的三(2-羧乙基)膦盐酸盐....

结果

通过一系列化学修饰，使金属表面具有硫醇反应活性，从而实现多肽的固定，如图1所示。先用PABT孵育，再经PEI-PDT处理，使金属表面适合多肽的连接。含有C端半胱氨酸残基、并通过柔性双AEEAc连接臂与核心pepCD47序列相连的CD47多肽（pepCD47），可通过二硫键共价结合至具有硫醇反应活性的表面。采用该方案，我们已证明pepCD47可在金属表面稳定结合长达六个月，并能耐受正常的生理剪切力以及灭菌处理¹⁷。

通过将TAMRA标记的pepCD47肽连接至金属表面，随后进行充分洗涤以去除非共价结合的肽，再通过还原连接肽与表面的二硫键将TAMRA-pepCD47裂解，并采用荧光定量分析法进行分析，从而确定肽的最大保留量。具体而言，将不同浓度的TAMRA-conjugated pepD47（1 mL，10–200 µg/mL溶液）加入PEI-PDT包被的表面，多次洗涤以去除非共价结合的肽。通过使用还原剂TCEP释放共价结合的肽，并以其荧光强度对照标准品进行定量，从而确定共价结合.......

讨论

我们展示并描述了一种相对新颖的化学策略，旨在将治疗性肽片段连接到不锈钢表面，其总体目标是降低该表面与血液中炎症细胞的反应性。本文所述的双膦酸盐化学涉及PABT的金属氧化物与双膦酸盐基团之间形成配位键。在金属表面形成的聚双膦酸盐单层厚度不超过5 nm¹⁸，因此不会产生厚聚合物涂层可能引发的潜在促炎效应²⁰。PABT脂肪族侧链中潜伏的巯基去保护后，可使金属表面具备进一步与巯基反应性化合物进行化学修饰的条件。PEI-PDT是一种支化的聚乙烯亚胺（平均分子量Mw=25,000），其中约20%的乙烯亚胺连接位点被修饰为具有巯基反应性的吡啶二硫基团。由于在与PABT衍生的巯基反应过程中仅消耗了PEI-PDT中少数的PDT基团，因此在PEI-PDT接枝后，表面化学性质仍保持巯基反应性，从而能够连接含巯基的肽段¹⁸。该化学策略已在本实验室开发并广泛用于将多种生物分子（如重组蛋白¹⁴、肽段^14,<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M Tris-HCl	Invitrogen	15567-027	pH - 7.5
4% 戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16539-07
4% 柠檬酸钠	Sigma	S5770
ACK 裂解缓冲液	Quality Biologicals	118-156-721
抗 CD45RA 抗体（小鼠抗大鼠；克隆号 OX-19）	Biolegend	202301
抗 CD5 抗体（小鼠抗大鼠；克隆号 OX-19）	Biolegend	203501
抗 CD6 抗体（小鼠抗大鼠；克隆号 OX-52）	BD Biosciences	550979
抗 CD68 抗体（小鼠抗大鼠；克隆号 ED-1）	BioRad	MCA341
抗 CD8a 抗体（小鼠抗大鼠；克隆号 OX-8）	Biolegend	201701
氯仿，ACS 认证级	Fisher Chemical	C298-500
二甲基甲酰胺（DMF）	Alfa Aesar	39117
Embra 不锈钢载网	Electron Microscopy Sciences	E200-SS	不锈钢网状圆盘
Ficoll Hypaque	GE Healthcare	17-1440-02
冰乙酸	ACROS organic	148930025
Alexa Fluor 标记的山羊抗小鼠 IgG	ThermoFisher	A11030
肝素钠	Sagent Pharmaceuticals	402-01
人源 pepCD47	Bachem	4099101
异丙醇	Fisher Chemical	A426P-4
金属接头	Leur Fitting	6515IND	单通接头 316 不锈钢 1/4"-5/16" 水嘴端
甲醇	RICCA chemical company	4829-32
显微镜	Nikon Eclipse	TE300
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	14190-136
碳酸氢钾（KHCO3）	Fisher Chemical	P184-500
PVC 管	Terumo-CVS	60050	1/4" × 1/16 8'
含 0.1 M 氯化钠的二甲胂酸钠缓冲液	Electron Microscopy Sciences	11653
十二烷基硫酸钠（SDS）	Bio-Rad laboratories	161-0302
乙酸钠（C2H3NaO2）	Alfa Aesar	A13184
Src 肽段	Bachem	4092599
带管腔的圆柱形不锈钢（AISI 304）样品	Microgroup, Medway, MA	20097328	1 cm × 6 mm 外径
不锈钢箔片（AISI 316L）	Goodfellow, Coraopolis, PA		100 mm × 100 mm × 0.05 mm
TAMRA 标记的 pepCD47（TAMRA-pepCD47）	Bachem	4100277
TMB（3,3’ ,5,5’ -四甲基联苯胺）底物及三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）	Thermo Scientific	PG82089
吐温-20	Bio-Rad laboratories	170-6531
Vybrant CFDA SE 细胞示踪试剂盒	Invitrogen	V12883