小鼠模型中缺血再灌注损伤后延迟的心肌内干细胞递送

摘要

干细胞作为心肌损伤患者的潜在治疗方法正不断被研究，然而，其在受损组织中的存活率和滞留率降低可能影响其长期疗效。在本研究中，我们描述了一种在小鼠缺血再灌注损伤模型中递送干细胞的替代方法。

摘要

干细胞（SCs）在心肌损伤个体中恢复心脏功能方面的应用受到广泛关注。目前，心脏干细胞治疗的研究通常是在诱导心肌损伤的同时递送干细胞。然而，这种方法存在两个显著局限性：早期的促炎性缺血微环境可能影响移植干细胞的存活，且该模型无法模拟临床上干细胞更可能应用的亚急性梗死情况。本文介绍了一种分两阶段进行的手术操作流程，用于建立缺血-再灌注损伤模型并递送间充质干细胞（MSCs）。这种干细胞给药方式可通过避开初始免疫反应，延长干细胞在受损组织周围的存活时间和滞留能力。我们在小鼠体内建立了缺血-再灌注损伤模型，并在7天后将稳定表达报告基因——萤火虫荧光素酶（由组成型CMV启动子驱动）的间充质干细胞（3.0 × 10⁵）直接注射至心肌内。通过超声成像和生物发光成像分别确认心肌损伤和细胞注射的成功。重要的是，采用这种分阶段手术方式进行干细胞递送并未增加额外的并发症发生率。结合先进的报告基因技术，该干细胞递送方法有望在模拟临床常见慢性缺血状况下，实现对移植干细胞体内存活与滞留情况的动态研究，同时规避早期促炎反应的影响。综上所述，我们建立了一种延迟向心肌递送干细胞的实验方案，该方法可能为促进受损组织再生提供一种潜在的新策略。

引言

心血管疾病仍然是全球范围内发病率和死亡率的最常见原因。心脏缺血事件已被证实对心肌及其周围细胞的整体功能具有破坏性影响。¹。仅   ̴心肌损伤发生后，每年有0.45-1.0%的心肌细胞会再生²尽管对开发治疗方法的需求日益增长且备受关注，但促进受损组织再生的治疗手段仍难以建立，尚需进一步优化。^3,4,5干细胞疗法已被作为一种缺血事件后修复受损组织的替代途径；然而，这些疗法的发展受到细胞在损伤区域存活率和滞留率有限的制约。⁶.

缺血事件后心脏的微环境可表现为缺氧、促氧化和促炎状态，对治疗性干细胞的存活与适应构成了不利条件^7,8。损伤后引发免疫反应，初始T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞通过清除濒死细胞并调节组织重塑过程来尝试修复损伤^9,10,11。缺血后前3天内，炎症反应达到高峰，局部释放大量促炎性细胞因子，并聚集大量中性粒细胞和单核细胞^10,12。约7天后，大部分炎症已消退，开始向修复性细胞类型转变，此过程持续至重塑级联完成，在小鼠中大约需要14天¹³。我们的手术方法为将生物制剂递送至心肌提供了一种潜在的替代策略，可避开缺血-再灌注损伤后固有免疫反应的高峰期；同时，该方法还可在亚急性和慢性缺血条件下研究各类治疗手段，而此类情况与急性心肌梗死相比可能存在不同的影响因素。

方案

实验采用10至12周龄、体重20至25克的雌性C57BL/6小鼠进行。所有动物实验均符合《实验动物护理与使用指南》（美国国家科学院实验动物资源研究所，马里兰州贝塞斯达）中规定的要求，并经梅奥诊所医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 准备与插管

1. 手术前对所有外科器械进行高压灭菌。若同一时段需进行多次手术，每次动物手术后应清洁器械，并使用干热灭菌器重新灭菌。
2. 用 1 L/min 的氧气携带 3.5–4% 异氟烷对小鼠进行麻醉₂ 在诱导室中。
3. 皮下注射布托啡诺缓释剂（镇痛剂）1 mg/kg，称量动物体重，并将体重数值输入呼吸机。
4. 从胸骨至肩部水平剃除左侧胸部的毛发，并涂抹脱毛膏以去除多余毛发。
5. 在缺血再灌注操作过程中，将呼吸机的呼气末正压（PEEP）维持在2 cmH₂O₂O. 对于延迟注射细胞的操作，将呼气末正压（PEEP）调整为3 cmH₂O。₂O 以防止肺塌陷。
6. 使用20 G气管插管对动物进行插管，并转移至可控温加热垫以维持体温在35–37 °C。
7. 将小鼠侧卧置于呼吸机上，头端朝左，尾端朝右。
8. 以1 L/min的氧气流速维持2-2.5%异氟烷麻醉₂ 在后续步骤中。
9. 在手术区域交替使用聚维酮碘和酒精棉签擦拭三次，并在双眼涂抹眼膏。

2. 缺血再灌注损伤

1. 使用10号刀片手术刀，在视野中左侧乳头右侧2.5 mm处做一垂直切口。
2. 用剪刀剪开浅层肌肉，直至暴露出肋间肌和肋骨。
3. 抬起肋骨及周围组织时，剪开第4与第5肋骨之间的肋间间隙，随后将眼睑拉钩插入所形成的开放空间中。
4. 使用弯头镊子将心包膜向后牵拉，同时将肺组织向上推移并移出视野。
5. 可视化左前降支动脉，使用9-0尼龙缝线，在左耳下方2.5 mm远端的心肌组织处穿线，并打一个松散的方结。
6. 剪取1 cm聚乙烯管，置于松散的结内。
7. 将缝线固定在导管周围，确认缺血后，35分钟后松开。
   注意：通过苍白和心室心律失常确认缺血。
8. 结扎释放并移除导管后，等待5分钟以确认心肌再灌注。
9. 在切口右侧的一个肋间隙处，将24 G静脉导管插入胸腔。
10. 用6-0可吸收缝线以单纯间断缝合方式关闭肋间切口。
11. 使用6-0可吸收缝线以连续缝合方式关闭肌层。
12. 关闭浅层肌层后，使用1 mL结核菌素注射器抽出胸腔内气体，同时拔除胸腔引流管。
13. 使用6-0可吸收缝线，以连续水平褥式缝合方式关闭皮肤切口
    注：皮肤层缝合也可使用尼龙缝线及间断缝合方式。
14. 皮下注射1.5 mL温生理盐水，并在切口部位涂抹三联抗生素软膏以预防感染。
15. 关闭异氟烷，让动物通过呼吸机吸入100%氧气₂ 直到能够持续自主呼吸为止。
16. 将小鼠转移至无垫料的笼子，或在笼内垫有纸巾或布单以覆盖垫料，并置于35–37 °C的加热垫上，直至其完全恢复。

3. 小鼠间充质干细胞递送

注意：本实验所使用的小鼠品系为近交系，被视为遗传上完全相同。间充质干细胞取自相同品系的动物，根据实验方案设计，未诱导免疫抑制¹。

1. 按照之前第一次手术的方法完成准备和插管步骤。
2. 使用剪刀和镊子拆除皮肤层的缝线。
3. 用#10手术刀在前次手术相同位置做切口。
4. 继续使用手术刀切开瘢痕组织，直至可见肌肉层的缝线。
5. 使用剪刀和镊子拆除缝线，并切开肌肉层。
6. 观察并拆除固定肋骨的缝线，从前次切口处继续切开肋间肌。
   注意：肺部可能已与胸壁粘连，若发生此情况，应使用钝头或弯头镊子小心分离并松解。
7. 将眼睑拉钩置入肋间隙，定位前次结扎部位。
8. 将悬浮于20 µL PBS中的间充质干细胞（3.0 × 10⁵）吸入30 G胰岛素注射器中，根据需要轻微弯曲针头以获得合适的注射角度。
   注意：间充质干细胞（MSCs）来源于4–6周龄C56BL/6小鼠的脂肪组织。早期代次细胞（p3）通过携带CMV启动子驱动萤光素酶基因表达的载体进行转导，以便进行活体细胞存活率监测。脂肪来源的小鼠MSC通过流式细胞术鉴定，细胞对CD44、CD29、CD90和CD105呈阳性，而对造血标志物CD45呈阴性¹⁴。注射前，MSC至少再培养一代，以避免冻存复苏过程导致的细胞丢失。
9. 将注射器从心尖向心底方向推进，插入梗死周边区域，直至针尖完全进入心肌组织。
10. 进入心肌后缓慢注射细胞，等待3秒，然后拔出针头。
11. 密切观察心脏3分钟，确保无细胞注射引起的异常反应，如心室颤动等。
12. 将24 G静脉导管插入切口右侧一个肋间隙的胸腔内。
13. 按第一次手术相同方法逐层缝合肋间肌、肌肉层和皮肤层，并拔除胸腔引流管。
14. 皮下注射1.5 mL温热生理盐水，并在切口部位涂抹三重抗生素软膏以预防感染。
15. 关闭异氟烷麻醉，让动物在呼吸机辅助下吸入100% O₂，直至其能够持续自主呼吸。
16. 将小鼠转移至无垫料笼盒或铺有纸巾或手术单覆盖垫料的笼盒中，置于35–37 °C的加热垫上，直至完全恢复。

两种手术后的术后护理

1. 持续观察动物，直至其恢复自主呼吸、胸卧位及正常活动。
2. 手术当天至少在术后3小时内，每15-30分钟观察一次。
3. 术后5天内每天检查小鼠伤口是否裂开或出现异常疼痛，之后每周检查2-3次。
4. 若动物在术后72小时后仍出现疼痛症状（如弓背、活动减少、面部痛苦表情或毛发杂乱），应追加一次缓释型布托啡诺镇痛剂。

结果

在第0天对小鼠诱导缺血再灌注损伤，随后在干细胞移植前一天进行术后超声心动图和心电图检查。超声和心电图分析证实存在心肌梗死以及心室收缩功能下降（图1A-D）。进一步数据分析显示，接受缺血损伤的小鼠射血分数和缩短分数均降低，而舒张末期和收缩末期容积增加（表1）。与正常小鼠心脏（图2A）相比，损伤后7天的心肌组织Masson三色染色（图2B）显示胶原沉积增加且左心室壁变薄。第二次操作在损伤后7天进行；小鼠接受心肌内注射表达报告基因萤火虫荧光素酶的间充质干细胞（3.0 × 10⁵ 个细胞，溶于20 µL PBS中），该报告基因由组成型表达的CMV启动子驱动。在干细胞移植后的第二天对这些小鼠进行活体生物发光成像（BLI），以确认注射成功。与仅诱导缺血再灌注损伤但未接受间充质干细胞移植的小鼠相比，BLI信号的存在表明间充质干细胞成功递送（图3A,B）...

讨论

全球有超过8500万人受到心血管疾病的影响³这些缺血事件的高发率迫切需要进一步研发和拓展促进受损组织再生的替代疗法。传统方法是在急性期采用缺血再灌注操作，随后给予治疗干预¹炎症反应在心脏缺血事件发生后3至4天达到高峰，表现为中性粒细胞和巨噬细胞浸润，以及细胞因子信号增强^10,12。经过这段无活动期后 细胞去聚集，初级免疫反应开始减弱并转向重塑阶段¹³此外，必须在与临床实际情况相同的条件下研究治疗方案。在本文中，我们展示了从缺血小鼠获得的代表性结果，以证明双手术操作结合间充质干细胞延迟注射的可行性和安全性。我们认为，该方法不仅可用于心肌缺血动物模型，还可用于炎症可能发挥关键作用并影响细胞治疗或药物治疗等生物治疗策略效果的其他疾病动物模型。

因此，本文描述了一种在小鼠诱导缺血再灌注损伤后7-10天，将干细胞递送至亚急性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% NaCl 灌洗液，符合美国药典标准	Baxter	0338-0048-04
11x12" 可粘贴灭菌手术巾，可高压灭菌	SAI Infusion Technologies	PSS-SD
24G 3/4" 静脉导管管路	Jelco	4053
28G x 1/2" 1mL 过敏用注射器	BD	305500	镇痛药注射
30G x 1/2" 3/10cc 胰岛素注射器	Ulticare	08222.0933.56	干细胞注射
6-0 S-29，12" Vicryl 缝线	Ethicon	J556G	肋间肌、浅层肌肉及皮肤切口缝合
9-0 BV100-4，5" Ethilon 缝线	Ethicon	2829G	左前降支冠状动脉结扎
吸水垫	Thermo Fischer Scientific	14-206-64	置于动物身下使用
酒精消毒片，双层，中号	Coviden	6818
防雾面罩	Halyard	49235
Bonn 斜视剪，弯型，钝头	Fine Science Tools	14085-09
Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml，5 ml	ZooPharm Pharmacy		布托啡诺类镇痛药，采用缓释聚合物配方，可减缓吸收，延长作用时间（有效持续时间达72小时）。
Castroviejo 缝合针持，弯型	Fine Science Tools	12061-01
Curity 无菌纱布海绵	Coviden	397310
精细缝合打结镊，45度角弯曲	Fine Science Tools	11063-07
电动剃毛器	Wahl		去除毛发
异氟烷 100 ml	Cardinal Health	PI23238	麻醉剂
实验服
Monoject 1 mL 皮下注射器	Coviden	8881501400
Moria 虹膜镊，弯型，带齿（x2）	Fine Science Tools	11370-31
Moria 眼睑牵开器	Fine Science Tools	17370-53
小鼠经口气管插管套件	Kent Scientific
Nair 脱毛膏	Johnson & Johnson		去除毛发
Optixcare 眼部润滑凝胶 Plus	Aventix		无菌眼用润滑剂
Physiosuite 呼吸机	Kent Scientific
PolyE 聚乙烯导管	Harvard Apparatus	72-0191	用于暂时压迫左前降支冠状动脉
聚维酮碘棉签	PDI	S41125
手术刀，10号刀片	Bard-Parker	371610
无菌3" 棉签	Cardinal Health	C15055-003
无菌6" 锥形棉签	Puritan	25-826-5WC
无菌手套	Cardinal Health	N8830
灭菌袋	Medline	MPP100525GS
手术帽
手术显微镜	Leica	M125
缝合打结镊，直型（x2）	Fine Science Tools	10825-10
Transpore 外科胶带	3M	1527-1
三重抗生素软膏	G&W Laboratories	11-2683ILNC2	局部涂抹以预防感染
Vannas-Tübingen 弹簧剪，弯型	Fine Science Tools	15004-08
Vetflo 麻醉蒸发器	Kent Scientific