重症急性胰腺炎的动物模型可用于研究疾病初始阶段的病理生理变化，有助于观察炎症事件的发展过程。本文提供了一种通过逆行输注牛磺胆酸钠至麻醉C57BL/6小鼠胰管以诱导重症急性胆源性胰腺炎的实验方案。
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方法文章
C57BL/6小鼠中牛磺胆酸钠诱导的重度急性胰腺炎
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
通过输注牛磺胆酸钠诱导胆源性急性胰腺炎的方法已被科学界广泛使用，因其能够模拟人类临床状况，并再现与临床胆源性胰腺炎发病相对应的炎症事件。胰腺损伤的严重程度可通过输注胆汁酸的浓度、速度和体积进行评估。本研究提供了该实验方案重现过程中所用材料与方法的更新版清单，并展示了此急性胰腺炎（AP）模型的主要结果。以往大多数文献仅限于在大鼠中复制该模型。我们已将此方法应用于小鼠，这具有额外优势（例如，针对小鼠可获得大量试剂和抗体，且可使用基因修饰小鼠品系），对相关研究具有重要意义。针对小鼠急性胰腺炎的诱导，我们提出了一套系统化的操作流程：在C57BL/6小鼠中以10 µL/min的速度输注2.5%牛磺胆酸钠持续3分钟，可在诱导后12小时内达到最大损伤程度，并展示了验证该方法有效性的结果指标。通过熟练的操作技术，从麻醉诱导到输注完成的总耗时约为每只动物25分钟。
引言
在人类中，胆结石的存在是胰腺炎最常见的病因，这是因为胆结石阻塞了胆总管的末端部分，阻碍了胰液的流动，从而在胰腺内引发强烈的炎症反应，并导致血清中消化酶浓度升高以及炎性介质增加1,2。
已有两种不同的理论被提出，用于解释急性胰腺炎（AP）的发生发展机制。 "公共通道" 理论认为，胆囊中存在的结石会阻塞远端胆总管系统，导致胆汁分泌逆流进入胰管。第二种理论（ "导管阻塞" 理论认为，过多的胆结石阻塞胰管，导致胰液无法流入十二指肠，从而引起胰管内高压3尽管导致急性胆源性胰腺炎的机制尚未完全阐明，但其结果是一种强烈的炎症反应。消化酶的释放和胰腺的自我消化可引起组织病理学改变，腹水和血清中炎症性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平升高，以及急性期蛋白增加4,5,6.
重症急性胰腺炎是一种因累及多个器官且死亡风险较高而需要临床关注的疾病。用于复制急性胰腺炎（AP）的动物模型具有重要意义，因为这些模型能够阐明疾病的病理生理机制，并有助于监测从疾病....
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方案
本方案已获得圣保罗大学医学院动物使用伦理委员会批准，项目编号：1343/2019-CEUA：FMUSP。本方案使用6周龄、体重为20 ± 2 g的C57BL/6小鼠（n = 9/组）。
1. 开腹手术
- 使用赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮溶液（80 mg/kg）进行皮下注射（0.1 mL/10g 体重），注射器规格为1 mL，针头规格为26G ½（13x0.45mm），以麻醉动物。通过夹捏脚趾检查麻醉深度是否足够。使用加热垫控制体温。确保所有手术器械均处于无菌状态。
- 用5%聚维酮碘溶液清洁腹部区域，并使用剃毛器去除胸部至下腹部之间的毛发（约2 cm2）。再用70%酒精清洁手术区域。
- 使用手术胶带将动物固定在手术板上。用剪刀在腹部上部、剑突下方约1 cm处横向剪开皮肤5 mm。在腹膜上重复相同切口。此操作将实现腹腔的小切口暴露。
2. 定位并暴露胰腺
- 借助拉钩，将肝脏向小鼠头部方向牵拉，使其距离肠道约 1 cm。
- 确定将注射牛磺胆酸钠的胰腺区域（胰头）。以肝脏为参照，十二指肠位于肝脏下方右侧（当观察小鼠时为左侧）。十二指肠是小肠的起始部分，与胃的末端相连。
- 借助镊子，将肝脏向动物头部方向提起，并轻轻牵拉小肠段。用 6-0 聚丙烯缝线固定小肠两侧端，以更好地显露....
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结果
根据Schmidt评分标准21，胰腺炎严重程度评分范围为0-3分，其中0分表示无病变，1分表示轻度存在（<25%），2分表示中度存在（25%至50%之间），3分表示重度存在（>50%）（表1）。检测指标包括血浆淀粉酶活性、胰腺水肿、腺泡细胞损伤/坏死、胰腺炎症（通过H&E染色切片的组织学分析）以及血清和腹腔灌洗液（PerC fluid）中IL-6细胞因子浓度。在重度急性胰腺炎（AP）发生12小时后，APTA组血清淀粉酶浓度较假手术组显著升高（分别为6194 ± 336.7 U/dL 和 3845 ± 135.7 U/dL）。同时，APTA组血清和腹腔灌洗液中的IL-6细胞因子浓度也升高（图2）。图3展示了假手术组与APTA组典型的苏木精-伊红（hematoxylin-eosin）染色结果。.......
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讨论
通过逆行注入牛磺胆酸钠诱导急性胰腺炎的方法已在大鼠中得到证实22,23,24。2008年、2010年和2015年发表的三项类似研究为本实验方案提供了参考依据3,14,15。在本研究中，我们列出了在C57BL/6小鼠中重现该方法的全部关键步骤以及一些可能的验证方法。
该实验的关键步骤是在肝门水平使用微血管夹阻断胆管（步骤 3.1），以防止牛磺胆酸钠反流至肝脏。此步骤需格外小心，因为门静脉紧邻胆管（图 1D），必须注意避免同时夹闭门静脉。穿刺针应仅插入胆管最远端部分。若针头深入胆管内部，可能导致胆管破裂，使酸液溢出至腺体实质和/或其他胆管
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢圣保罗大学临床医学研究生项目、高等教育人员培训协调机构（CAPES）以及圣保罗大学医学院（FMUSP）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.4 mm 针头 | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm 聚乙烯管 | Tygon | 730010 | - |
| 泡沫塑料块 | - | - | - |
| 用于固定小鼠的遮蔽胶带 | Missner | 1236 | - |
| 输注泵设定为 10µL / min | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| 剪刀和镊子 | |||
| 抗菌聚维酮碘 | Pfizer | 12086OR | 抗菌处理 |
| 70% 乙醇 | SIGMA | 459836 | 将 700 mL 100% 乙醇与 300 mL dH2O 混合 |
| 剃刀刀片 | Lord | bdk9a1ghk6 | 用于脱毛 |
| 牛磺胆酸钠 | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS 编号- 345909-26-4 |
| 微血管夹 | Medicon Surgical | 56.87.35 | 吻合器，开口 4.0 mm，闭合压力 30 - 40 g |
| 6-0 Prolene 缝线 | Bioline | 5162 | 缝合线 |
| Ketamin NP（右旋氯胺酮盐酸盐）50mg/mL | Cristália | ||
| 赛拉嗪 2% | Syntec | ||
| 无菌生理盐水（0.9% (wt/vol) 盐水） | Farmace | 105851 | |
| 甲基蓝 | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP 小鼠细胞因子/趋化因子磁珠检测试剂盒 - 免疫学多重检测 | MERCK | MCYTOMAG-70K | 利用 Luminex 技术，通过基于磁珠的多重检测方法，同时分析小鼠血清、血浆和细胞培养样品中的多种细胞因子和趋化因子生物标志物。 |
| 淀粉酶检测 | Labtest | 11 | |
| Desmarres 拉钩 13-mm 宽度 | ROBOZ | RS-6672 |
参考文献
- Li, X., et al. Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center. BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).
- Rechreche, H., Abbes, A., Iovanna, J. L.
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重印与许可
