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方法文章

C57BL/6小鼠中牛磺胆酸钠诱导的重度急性胰腺炎

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DOI：

10.3791/61547

⸱

2021年6月28日

 ,  ,  ,  , 
1Discipline of Clinical Emergencies, Department of Clinical Medicine, HCFMUSP / LIM 51, University of São Paulo Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

重症急性胰腺炎的动物模型可用于研究疾病初始阶段的病理生理变化，有助于观察炎症事件的发展过程。本文提供了一种通过逆行输注牛磺胆酸钠至麻醉C57BL/6小鼠胰管以诱导重症急性胆源性胰腺炎的实验方案。

摘要

通过输注牛磺胆酸钠诱导胆源性急性胰腺炎的方法已被科学界广泛使用，因其能够模拟人类临床状况，并再现与临床胆源性胰腺炎发病相对应的炎症事件。胰腺损伤的严重程度可通过输注胆汁酸的浓度、速度和体积进行评估。本研究提供了该实验方案重现过程中所用材料与方法的更新版清单，并展示了此急性胰腺炎（AP）模型的主要结果。以往大多数文献仅限于在大鼠中复制该模型。我们已将此方法应用于小鼠，这具有额外优势（例如，针对小鼠可获得大量试剂和抗体，且可使用基因修饰小鼠品系），对相关研究具有重要意义。针对小鼠急性胰腺炎的诱导，我们提出了一套系统化的操作流程：在C57BL/6小鼠中以10 µL/min的速度输注2.5%牛磺胆酸钠持续3分钟，可在诱导后12小时内达到最大损伤程度，并展示了验证该方法有效性的结果指标。通过熟练的操作技术，从麻醉诱导到输注完成的总耗时约为每只动物25分钟。

引言

在人类中，胆结石的存在是胰腺炎最常见的病因，这是因为胆结石阻塞了胆总管的末端部分，阻碍了胰液的流动，从而在胰腺内引发强烈的炎症反应，并导致血清中消化酶浓度升高以及炎性介质增加1,2。

已有两种不同的理论被提出，用于解释急性胰腺炎（AP）的发生发展机制。 "公共通道" 理论认为，胆囊中存在的结石会阻塞远端胆总管系统，导致胆汁分泌逆流进入胰管。第二种理论（ "导管阻塞" 理论认为，过多的胆结石阻塞胰管，导致胰液无法流入十二指肠，从而引起胰管内高压3尽管导致急性胆源性胰腺炎的机制尚未完全阐明，但其结果是一种强烈的炎症反应。消化酶的释放和胰腺的自我消化可引起组织病理学改变，腹水和血清中炎症性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平升高，以及急性期蛋白增加4,5,6.

重症急性胰腺炎是一种因累及多个器官且死亡风险较高而需要临床关注的疾病。用于复制急性胰腺炎（AP）的动物模型具有重要意义，因为这些模型能够阐明疾病的病理生理机制，并有助于监测从疾病早期阶段开始的炎症事件的演变过程，而这一点在临床实践中通常难以实现2,7。此外，在临床前研究中易于获取胰腺组织，有利于阐明与临床状况相关的改变8，同时还可以使用同基因型物种进行实验，消除不必要的变量，并使研究结果与人类疾病表现具有临床相似性9。

在科学文献中，常研究用于在大鼠和小鼠中诱导急性胰腺炎的胆源性和非胆源性模型。非胆源性诱导方法包括给予胆囊收缩素促泌剂或其类似物雨蛙素的超大剂量10；给予接近致死剂量的L-精氨酸；或给予胆碱缺乏并补充乙硫氨酸的饮食11。尽管这些方法易于复制并可导致胰腺炎症，但它们并不能模拟理论上引发急性胰腺炎（AP）的机制（即胆汁分泌物反流入胰管）。针对胆源性模型的技术基于将胆汁酸逆行灌注至胰管，该操作需要经过良好训练的研究人员来实施。已有若干研究报道了在大鼠中使用该方法（显然出于技术原因，因为这些实验涉及外科手术操作）12,13。然而，在小鼠中采用该方法可能在炎症研究中提供更有意义的结果3,14,15。在本研究中，我们将展示在C57BL/6麻醉小鼠中通过灌注牛磺胆酸钠诱导重度急性胰腺炎时需遵循的步骤清单。

对于涉及抗体实验以及基因和蛋白质表达分析的研究，使用小鼠更为理想，因为针对这些动物可用的实验材料更为丰富，并且可以使用同基因型和基因敲除品系等，适用于相关研究16。C57BL/6 小鼠是一种近交系小鼠，最初开发用于抗肿瘤活性和免疫学研究。由于该品系具有同基因型特性，能够提高实验结果的可重复性，从而可能减少实验所需的动物数量，并降低同一组内结果的变异性，因此正越来越受到研究人员的青睐17,18。

Perides 等人（2010）14 发表了一项通过牛磺胆酸钠输注在小鼠中诱导急性胰腺炎（AP）的实验方案。本文在此基础上进行了优化，采用更高浓度的牛磺胆酸钠（2.5%）在 C57BL/6 小鼠中进行输注，并明确了输注体积和速度（图 1）。小鼠在造模后 12 小时内达到最严重的病理程度。血清和腹腔内 IL-6 浓度的升高与 AP 的进展呈正相关。经过练习后，每只动物从麻醉诱导到输注完成的总耗时约为 25 分钟。本实验必须由经过培训的研究人员操作。为确保溶液准确注入胆总管，建议使用亚甲蓝代替牛磺胆酸钠进行多次预实验训练。

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方案

本方案已获得圣保罗大学医学院动物使用伦理委员会批准，项目编号：1343/2019-CEUA：FMUSP。本方案使用6周龄、体重为20 ± 2 g的C57BL/6小鼠（n = 9/组）。

1. 开腹手术

  1. 使用赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮溶液（80 mg/kg）进行皮下注射（0.1 mL/10g 体重），注射器规格为1 mL，针头规格为26G ½（13x0.45mm），以麻醉动物。通过夹捏脚趾检查麻醉深度是否足够。使用加热垫控制体温。确保所有手术器械均处于无菌状态。
  2. 用5%聚维酮碘溶液清洁腹部区域，并使用剃毛器去除胸部至下腹部之间的毛发（约2 cm2）。再用70%酒精清洁手术区域。
  3. 使用手术胶带将动物固定在手术板上。用剪刀在腹部上部、剑突下方约1 cm处横向剪开皮肤5 mm。在腹膜上重复相同切口。此操作将实现腹腔的小切口暴露。

2. 定位并暴露胰腺

  1. 借助拉钩，将肝脏向小鼠头部方向牵拉，使其距离肠道约 1 cm。
  2. 确定将注射牛磺胆酸钠的胰腺区域（胰头）。以肝脏为参照，十二指肠位于肝脏下方右侧（当观察小鼠时为左侧）。十二指肠是小肠的起始部分，与胃的末端相连。
  3. 借助镊子，将肝脏向动物头部方向提起，并轻轻牵拉小肠段。用 6-0 聚丙烯缝线固定小肠两侧端，以更好地显露胆总管的远端部分。

3. 重症急性胰腺炎诱导

  1. 使用微血管夹暂时阻断近端胆总管，以防止逆向灌注液渗漏至肝脏。胆总管位于十二指肠的肝脏侧，其与十二指肠连接处呈白色。将器官暴露于腹腔外。
  2. 用连接直径0.54 mm聚乙烯导管的0.4 mm针头穿刺壶腹周围区域（小肠壁的灰白色部分），进入胆总管。
  3. 用8-0缝线暂时阻断远端胆总管，防止牛磺胆酸钠溶液渗入十二指肠。
  4. 启动输液泵，以每10 g体重10 µL的速度，持续3分钟恒速灌注2.5%牛磺胆酸钠溶液（用0.9%生理盐水稀释）。
  5. 灌注结束后，移除微血管夹、临时8-0缝线以及胆胰管内的注射针头，以恢复胆汁的生理性流动。
  6. 最后，用6-0非吸收性单丝聚丙烯缝线缝合腹腔。从开腹至缝合结束的时间应控制在30分钟以内（见图1）。
  7. 术后将动物饲养于铺有木屑的聚乙烯箱中，并自由供应水和食物（ad libitum）。
  8. 对照组小鼠的处理方式与实验组相同，但确保灌注液仅为生理盐水。在对照组（假手术组，SHAM）中实施相同的手术操作并灌注生理盐水溶液（10 mL/min，持续3分钟），以消除手术和插管引起的炎症偏倚。
  9. 术后恢复后开始，每8小时皮下注射一次曲马多，剂量为12.5 mg/kg。

4. 分析方法

  1. 在诱导急性胰腺炎（AP）12小时后，使用赛拉嗪（xylazine，10 mg/kg）和氯胺酮（ketamine，80 mg/kg）对动物进行麻醉，通过眶后静脉丛采集约250 µL血液。
    1. 轻轻抓住背部皮肤，使眼球轻微突出，并将动物头部调整至眼睛朝上位置。
    2. 在动物眼睛中滴入一滴含局部麻醉剂的眼药膏。
    3. 将毛细管末端置于眼内角，以约30°–45°的角度轻轻插入眼球下方。旋转毛细管直至血液开始流出。注意：操作过程中无需施加力量。
    4. 采集完成后，用纱布轻压闭合眼睑以确保止血。将毛细管丢弃至锐器容器中19。
    5. 离心血清（700 × g，15分钟），收集上清液用于淀粉酶和IL-6检测（步骤4.7和4.8）。
  2. 采用CO2窒息法处死小鼠。
  3. 使用27 G针头向腹腔内注射4 mL预冷的1×PBS。拉紧腹部皮肤，确保针头缓慢进入腹膜腔，避免刺穿任何器官。注射后，轻轻按摩腹腔10秒，以释放黏附于腹膜的细胞。
  4. 使用剪刀和镊子在内层皮肤和肌肉上做一小切口（0.5 cm），暴露腹腔。将橡胶头吸管插入腹腔并收集液体。注意避免吸入脂肪组织或其他器官。
  5. 尽可能收集全部液体，并将所得细胞悬液转移至预冷的离心管中。将橡胶头吸管丢弃至锐器容器中 20。离心腹腔液（250 × g，5分钟），收集上清液用于IL-6检测（步骤4.9）。
  6. 采集邻近十二指肠的胰腺组织（<5 mm）。
  7. 将胰腺组织用10%福尔马林固定，随后进行石蜡包埋。
    1. 对切片进行苏木精-伊红（H&E）染色，于光学显微镜下进行组织病理学分析。采用Schmidt评分方案21（评估胰腺水肿、腺泡细胞损伤/坏死、胰腺炎症）来评估AP严重程度。
  8. 根据试剂盒说明书，使用市售试剂盒测定淀粉酶活性（U/dL）。
  9. 根据试剂盒说明书，使用Luminex检测法测定IL-6水平。
  10. 如需保存，将步骤4.1和4.4中获得的血清及腹腔液上清置于-80 °C冰箱中冻存。

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结果

根据Schmidt评分标准21，胰腺炎严重程度评分范围为0-3分，其中0分表示无病变，1分表示轻度存在（<25%），2分表示中度存在（25%至50%之间），3分表示重度存在（>50%）（表1）。检测指标包括血浆淀粉酶活性、胰腺水肿、腺泡细胞损伤/坏死、胰腺炎症（通过H&E染色切片的组织学分析）以及血清和腹腔灌洗液（PerC fluid）中IL-6细胞因子浓度。在重度急性胰腺炎（AP）发生12小时后，APTA组血清淀粉酶浓度较假手术组显著升高（分别为6194 ± 336.7 U/dL 和 3845 ± 135.7 U/dL）。同时，APTA组血清和腹腔灌洗液中的IL-6细胞因子浓度也升高（图2）。图3展示了假手术组与APTA组典型的苏木精-伊红（hematoxylin-eosin）染色结果。...

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讨论

通过逆行注入牛磺胆酸钠诱导急性胰腺炎的方法已在大鼠中得到证实22,23,24。2008年、2010年和2015年发表的三项类似研究为本实验方案提供了参考依据3,14,15。在本研究中，我们列出了在C57BL/6小鼠中重现该方法的全部关键步骤以及一些可能的验证方法。

该实验的关键步骤是在肝门水平使用微血管夹阻断胆管（步骤 3.1），以防止牛磺胆酸钠反流至肝脏。此步骤需格外小心，因为门静脉紧邻胆管（图 1D），必须注意避免同时夹闭门静脉。穿刺针应仅插入胆管最远端部分。若针头深入胆管内部，可能导致胆管破裂，使酸液溢出至腺体实质和/或其他胆管

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢圣保罗大学临床医学研究生项目、高等教育人员培训协调机构（CAPES）以及圣保罗大学医学院（FMUSP）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4 mm 针头INTRAG MEDICAL TECH9018321030G
 0.54 mm 聚乙烯管Tygon730010-
泡沫塑料块---
用于固定小鼠的遮蔽胶带Missner1236-
输注泵设定为 10µL / minHavard aparatus-Peristaltic Pump SeriesMA1 55-7766 Model 66 Small Peristaltic
剪刀和镊子
抗菌聚维酮碘Pfizer12086OR抗菌处理
70% 乙醇SIGMA459836将 700 mL 100% 乙醇与 300 mL dH2O 混合
剃刀刀片Lordbdk9a1ghk6用于脱毛
牛磺胆酸钠Sigma-Aldrich86339- 1GCAS 编号- 345909-26-4
微血管夹Medicon Surgical56.87.35吻合器，开口 4.0 mm，闭合压力 30 - 40 g
6-0 Prolene 缝线Bioline5162缝合线
Ketamin NP（右旋氯胺酮盐酸盐）50mg/mLCristália
赛拉嗪 2%Syntec
无菌生理盐水（0.9% (wt/vol) 盐水）Farmace105851
甲基蓝Sigma-Aldrich ChemicalsM5528
MILLIPLEX MAP 小鼠细胞因子/趋化因子磁珠检测试剂盒 - 免疫学多重检测MERCKMCYTOMAG-70K利用 Luminex 技术，通过基于磁珠的多重检测方法，同时分析小鼠血清、血浆和细胞培养样品中的多种细胞因子和趋化因子生物标志物。
淀粉酶检测Labtest11
Desmarres 拉钩 13-mm
宽度		ROBOZRS-6672

参考文献

  1. Li, X., et al. Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center. BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).
  2. Rechreche, H., Abbes, A., Iovanna, J. L. Induction of antioxidant mechanisms in lung during experimental pancreatitis in rats. Indian Journal of Experimental Biology. 58 (5), 297-305 (2020).
  3. T, L., et al. Intraductal infusion of taurocholate followed by distal common bile duct ligation leads to a severe necrotic model of pancreatitis in mice. Pancreas. 44 (3), (2015).
  4. Botoi, G., Andercou, A. Interleukin 17-prognostic marker of severe acute pancreatitis. Chirurgia. 104 (4), 431-438 (2009).
  5. Li, D., Li, J., Wang, L., Zhang, Q. Association between IL-1beta, IL-8, and IL-10 polymorphisms and risk of acute pancreatitis. Genetics and Molecular Research. 14 (2), 6635-6641 (2015).
  6. Feng, C., et al. Effect of peritoneal lavage with ulinastatin on the expression of NF-kappaB and TNF-alpha in multiple organs of rats with severe acute pancreatitis. Experimental and Therapeutic Medicine. 10 (6), 2029-2034 (2015).
  7. Fang, D. Z., et al. Effects of sildenafil on inflammatory injury of the lung in sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis rats. International Immunopharmacology. 80, (2020).
  8. Ceranowicz, P., Cieszkowski, J., Warzecha, Z., Dembinski, A. Experimental models of acute pancreatitis. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej(Online). 69, 264-269 (2015).
  9. Wan, M. H., et al. Review of experimental animal models of biliary acute pancreatitis and recent advances in basic research. HPB (Oxford). 14 (2), 73-81 (2012).
  10. Mayerle, J., Sendler, M., Lerch, M. M. Secretagogue (Caerulein) induced pancreatitis in rodents. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2013).
  11. Wang, N., et al. Resveratrol protects against L-arginine-induced acute necrotizing pancreatitis in mice by enhancing SIRT1-mediated deacetylation of p53 and heat shock factor 1. International Journal of Molecular Medicine. 40 (2), 427-437 (2017).
  12. Ma, Z. H., et al. Effect of resveratrol on peritoneal macrophages in rats with severe acute pancreatitis. Inflammation Research. 54 (12), 522-527 (2005).
  13. Souza, L. J., et al. Anti-inflammatory effects of peritoneal lavage in acute pancreatitis. Pancreas. 39 (8), 1180-1184 (2010).
  14. Perides, G., Acker, G. J. v, Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
  15. Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
  16. Tao, L., Reese, T. A. Making mouse models that reflect human immune responses. Trends Immunology. 38 (3), 181-193 (2017).
  17. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Science. 6 (1), 2-9 (2014).
  18. Song, H. K., Hwang, D. Y. Use of C57BL/6N mice on the variety of immunological researches. Laboratory Animal Research. 33 (2), 119-123 (2017).
  19. Bogdanske, J. J., Stelle, S. H. -V., Riley, M. V., Schiffman, B. M. Suturing Principles and Techniques in Laboratory Animal Surgery. 1st edition. (1), CRC Press. (2010).
  20. Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).
  21. Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals of Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
  22. Liu, D. L., et al. Resveratrol improves the therapeutic efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in rats with severe acute pancreatitis. International Immunopharmacology. 80, 106128(2020).
  23. Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125 (12), 110024(2020).
  24. Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, 110024(2020).
  25. Venglovecz, V., Z, R., Hegyi, P. The effects of bile acids on pancreatic ductal cells. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2019).
  26. Roberts, S. E., Akbari, A., Thorne, K., Atkinson, M., Evans, P. A. The incidence of acute pancreatitis: impact of social deprivation, alcohol consumption, seasonal and demographic factors. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 38 (5), 539-548 (2013).
  27. Lerch, M. M., Gorelick, F. S. Models of acute and chronic pancreatitis. Gastroenterology. 144 (6), 1180-1193 (2013).
  28. Nakamura, K., Fukatsu, K., Sasayama, A., Yamaji, T. An immune-modulating formula comprising whey peptides and fermented milk improves inflammation-related remote organ injuries in diet-induced acute pancreatitis in mice. Biosci Microbiota Food Health. 37 (1), 1-8 (2018).
  29. Kui, B., et al. New insights into the methodolgy of L-Arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 011758(2015).
  30. Xue, J., et al. Alternatively activated macrophages promote pancreatic fibrosis in chronic pancreatitis. Nature Communication. 6, 7158(2015).
  31. Lesina, M., Wormann, S. M., Neuhofer, P., Song, L., Algul, H. Interleukin-6 in inflammatory and malignant diseases of the pancreas. Seminars in Immunology. 26 (1), 80-87 (2014).
  32. Rao, S. A., Kunte, A. R. Interleukin-6: An early predictive marker for severity of acute pancreatitis. Indian Journal of Critical Care Medicine. 21 (7), 424-428 (2017).

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