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方法文章

扁形虫收缩行为作为有害刺激感知的定量行为读出

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DOI：

10.3791/61549

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2020年7月30日

 ,  ,  ,  , 
1Biology Department, Swarthmore College, 2Physics Department, UC San Diego

本文内容

摘要

淡水涡虫表现出三种运动方式（滑行、收缩蠕动和蜷缩运动），可通过定量行为分析加以区分。我们描述了一种利用多种有害刺激诱导蜷缩运动的方法，对其定量分析，并与收缩蠕动和滑行相区分。通过基因敲降实验，我们证明了蜷缩运动作为定量表型读数的特异性。

摘要

淡水涡虫通常依靠腹侧纤毛的推动而平滑滑行。然而，某些环境条件可诱导其产生由肌肉驱动的运动方式：收缩运动（peristalsis）或蜷缩运动（scrunching）。虽然收缩运动是由纤毛功能缺陷引起的，但蜷缩运动与纤毛功能无关，是涡虫对特定刺激的一种特异性反应，这些刺激包括截肢、有害温度、极端pH值以及乙醇。因此，这两种由肌肉驱动的运动方式在机制上是不同的。然而，它们在定性上可能难以区分。本文提供了一种利用多种物理和化学刺激诱导蜷缩运动的实验方案，并详细描述了如何使用免费软件对蜷缩运动进行定量表征，从而将其与收缩运动和滑行运动区分开来。由于蜷缩运动是一种普遍存在于各类涡虫中的运动模式，尽管存在物种特异性的差异，本方案在适当考虑物种差异的前提下，可广泛适用于所有涡虫物种。为验证这一点，我们比较了行为学研究中最常用的两种涡虫——Dugesia japonica 和 Schmidtea mediterranea——对同一组物理和化学刺激的反应。此外，由于蜷缩运动具有高度特异性，本方案还可与RNA干扰技术或药理学处理相结合，用于解析参与该行为的分子靶点和神经回路，从而为伤害感受和神经肌肉通讯的重要机制提供深入见解。

引言

除了在干细胞和再生研究中广受欢迎1,2,3之外，淡水涡虫长期以来也被用于行为学研究4,5，这得益于其相对较大的体型（体长数毫米）、易于在实验室中低成本维持培养，以及可观测行为的广泛性。计算机视觉和自动追踪技术引入涡虫行为研究6,7,8,9,10,11后，使得行为表型能够被定量区分。动物行为是神经功能的直接读出指标。由于涡虫的神经系统具有中等的大小和复杂性，同时与脊椎动物大脑共享保守的关键元件12,13,14，因此研究涡虫行为有助于揭示在更复杂的生物体中难以直接探测的保守性神经活动机制。因此，涡虫是进行比较神经生物学研究的宝贵模型8,12,15,16,17,18,19,20,21。此外，水生环境使得化学物质能够快速且方便地暴露于涡虫，从而研究这些物质对成体及再生中涡虫脑功能的影响，使涡虫成为神经毒理学研究中常用的体系22,23,24,25,26。

涡虫具有三种不同的运动方式，分别称为滑行、收缩蠕动和蜷缩运动。每种运动方式在特定情况下出现：滑行是默认的运动方式，当纤毛功能受损时会发生收缩蠕动7,27，而蜷缩运动则是一种逃避行为——不依赖于纤毛功能——由某些有害刺激引发7。我们已证明，蜷缩运动是一种特异性反应，由某些化学或物理信号的感知所触发，包括极端温度或pH值、机械损伤或特定化学诱导剂，因此并非一般的应激反应7,28,29。

由于其具有特异性和典型的行为参数，且这些参数可通过本方案轻松量化，因此收缩行为是一种强大的行为表型，使研究人员能够开展机制性研究，以解析感觉通路及行为的神经元调控机制25,28。此外，已有研究表明，在神经毒理学研究中，收缩行为可作为敏感的终点指标，用于检测化学物质对神经系统发育和功能的不利影响22,24,25,30。由于多种不同的感觉通路似乎通过不同机制汇聚并诱导收缩行为28，因此与其他涡虫行为不同，研究人员可利用多种但特定的刺激来解析不同的神经回路，并研究不同信号如何整合以产生收缩表型。

重要的是，不同物种之间存在差异，同一种化学物质可能在一种涡虫物种中引发收缩运动，而在另一种涡虫中则引发不同的行为反应。例如，我们发现花生四烯酸乙醇胺（anandamide）可诱导日本三角涡虫（Dugesia japonica）产生收缩运动，但在地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）中却诱导出蠕动运动28。这一实例凸显了能够可靠区分不同运动步态的重要性，因为这些步态是不同分子机制的表型表现。然而，仅依靠定性的观察数据难以区分收缩运动与蠕动运动，因为这两种运动均由肌肉驱动，且在表现特征上具有相似性7,28。因此，有必要通过纤毛成像或定量行为学研究来区分这两种步态，这些方法可根据特征性参数进行判别7,28。由于纤毛成像在实验操作上具有挑战性，且需要高倍复合显微镜和高速相机等专用设备7,28，其在研究者中的普及程度不如定量行为分析。

本文介绍了一种实验方案，用于（1）通过多种物理（有害温度、截肢、近紫外光）和化学（烯丙基异硫氰酸酯（AITC）、肉桂醛）刺激诱导涡虫的收缩行为（scrunching），以及（2）利用免费软件对涡虫行为进行定量分析。通过量化四个参数（体长振荡频率、相对速度、最大振幅以及身体伸长与收缩的不对称性）7，可将收缩行为与滑行、蠕动以及其他文献中报道的行为状态（如蛇形运动15或癫痫样行为15）区分开来。此外，尽管收缩行为在不同涡虫物种间具有保守性7，但每个物种均有其特有的频率和速度；因此，一旦确定了某一物种的滑行与收缩速度，仅凭速度即可用于区分收缩、滑行和蠕动行为29。本方案无需事先具备计算图像分析或行为学研究的经验，因此也可适用于本科教学实验室中的涡虫行为实验。补充材料中提供了示例数据，以帮助用户调整和优化本实验方案。

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方案

1. 涡虫定量行为分析实验

  1. 实验装置
    1. 将一个可调光LED面板放置在平坦表面上。LED面板具有两个作用：（1）提供均匀的白色背景；（2）作为可调节的光源以获得适当的对比度。在LED面板上放置一个直径为100 mm的培养皿作为实验区域。
      注意：为提高通量，可使用多孔板作为实验区域23,24但较大的实验区域有助于实现自动化的图像分析。
    2. 将相机安装在竞技场上方的铁架台上（图1A）。根据需要调整相机的位置、高度和焦距，使整个实验区域位于视野中央并清晰对焦（图1B).
      注意：相机分辨率必须足够高，以清晰区分涡虫与LED面板提供的均匀背景。
    3. 用适当的暴露培养基（涡虫水或化学溶液）填充培养皿至半满体积（以下简称“浴”），对于100 mm培养皿，体积约为25 mL。打开LED面板，并关闭可能影响录制质量的其他光源（例如在培养皿表面产生眩光的附近光源）。
      警告：操作危险化学品溶液时，须穿戴全套个人防护装备（PPE），必要时将实验装置移至通风橱内进行。应遵守联邦及州级关于废弃物处理的相关法规。
    4. 使用移液管将一只涡虫滴入实验区域中央。开始记录。以 Fiji 原生格式将数据记录为图像序列31 格式（TIFF、GIF、JPEG、PNG、DICOM、BMP、PGM 或 FITS；参见图像分析部分 1.2）。
      注意：由于不同个体的涡虫在行为和对外部刺激的敏感性方面存在差异，除了进行技术重复外，还必须收集足够数量的生物学重复数据。我们曾在一个100 mm的培养皿中同时使用多达10只中等大小（4–7 mm）的涡虫。尽管这种方法在时间上较为高效，但培养皿中同时存在多只涡虫会使数据分析更加困难，因为涡虫的运动路径可能发生交叉。
      1. 进行滑行实验时，以每秒至少1帧（FPS）的速度进行记录。进行收缩/蠕动实验时，记录所用的帧率（FPS）应至少为该涡虫物种收缩/蠕动频率的两倍。若该涡虫物种的收缩/蠕动频率未知，可先以10 FPS为起点，并根据实际情况适当增加或减少。
      2. 使用化学溶液时，应尽量用最少的涡虫培养水转移涡虫，以免显著改变化学溶液的浓度。
    5. 滑行实验中，记录1至2分钟的滑行行为。收缩/蠕动实验中，需记录足够长时间，以捕获至少3次连续的、沿直线发生的振荡过程。实验完成后，停止录制。
      注意：在进行收缩/蠕动实验时，若涡虫在基于刺激经验确定且需在各重复间保持一致的固定时间内未达到终止标准，应终止记录并测试另一只涡虫。
      1. 如果涡虫到达了实验区域的边界但尚未满足终止条件，则用移液器将涡虫移回实验区域中心。
        注意：记录过程中应避免对同一个体进行重复移液操作，因为这可能会改变其行为。
    6. 将涡虫从实验区域中移出，并将涡虫培养用水或化学溶液倒入适当的废液容器中处理。曾置于涡虫培养用水中的涡虫可放回其原始培养容器中。
      注意：为避免交叉污染，不同培养基的实验应使用不同的实验区域（例如，涡虫在清水中的滑行实验，不应在之前用于化学暴露下收缩/蠕动实验的区域内进行）。
      1. 将暴露于化学溶液中的涡虫依次在3个盛有25 mL涡虫培养用水的洁净100 mm培养皿中进行冲洗，以充分稀释去除残留化学物质。若观察到涡虫出现皱缩或蠕动现象，应将其置于单独的容器中。一个月后可将涡虫放回原培养容器，因为此时大多数细胞已完成更新。1.
        注意：如果同一群体的涡虫需要进行多个不同的实验（例如，RNAi 实验群体），每次实验后应让涡虫恢复 24 小时，再进行下一个实验。实验顺序应安排为最不具侵入性的实验先进行，最具侵入性的实验（例如，截肢）最后进行。
      2. 若在同一实验区域进行多个实验，在每次实验之间需妥善处理浴液，并用纸巾擦拭实验区域以清除任何黏液痕迹。
        注意：此处可暂停本实验方案。
  2. 涡虫行为的定量分析
    1. 按照第1.1节所述进行涡虫行为实验。
    2. 在 Fiji 中打开某个实验的原始图像序列文件 > 导入 > 图像序列）并选择图像序列中的第一张图像。在“序列选项”窗口中，勾选“按数字顺序排序名称”选项，然后点击“确定”。图像序列加载完成后，将图像序列转换为8位（图像 > 类型 > 8位）并使用图像堆栈底部的箭头工具或滑块来观看或浏览图像序列。
      注意：对于滑行实验，只要在录制过程中能够清晰观察到涡虫，所有数据均可使用。但通常只需通过提取下述相关部分，分析在实验区域中央的自由运动即可。
    3. 为提取特定时间段和感兴趣区域，使用矩形工具绘制一个覆盖涡虫完整路径的感兴趣区域图2A，2B）。右键单击图像堆栈并选择 重复…，勾选该选项框 复制堆叠，输入感兴趣序列的起始帧和结束帧，然后单击 好的如果同时对多个涡虫进行成像，则需在 arena 中为每只涡虫重复此区域选择和复制步骤，使打开的图像堆栈数量与 arena 中的涡虫数量相等。以下步骤（步骤 1.2.4–1.2.10）应逐一对每个图像堆栈进行操作。
      1. 对于滑行实验，选取一段扁形动物移动距离至少为其体长两倍的滑行时段。
        注意：每只涡虫提取的滑行数据越多，数据的可靠性就越高。进行滑行分析时，涡虫无需沿直线运动。
      2. 对于收缩/蠕动实验，需选取涡虫在一条直线上完成至少三次连续（理想情况下更多）身体振荡的实例，确保每次振荡均为完整的伸长-收缩周期，因为完整的振荡周期对于准确测定频率至关重要。
        注意：能够提取的振荡次数越多，数据就越可靠。请勿使用涡虫正在转弯的序列，因为这将导致长度测量不准确。
    4. 对复制的图像堆栈应用阈值（图像 > 调节 > 阈值) 对图像进行二值化处理，并将涡虫从背景中提取出来。根据需要调整滑动条，使整个涡虫被红色高亮显示。具体数值取决于成像质量。保持勾选以下选项： 暗背景, 堆叠直方图，和 不要重置范围 未选中。滚动浏览图像堆栈，确保阈值范围合适（即在整个堆栈中，涡虫与背景分离良好），然后单击 应用.
    5. 在 将图像栈转换为二值图像 窗口，将方法设置为 默认 以及背景到 光取消勾选此窗口中的所有复选框，然后点击 好的一幅二值化图像将显示白色背景上的黑色涡虫图2C确保在图像序列的每一帧中都能看到完整的涡虫。
      注意：在后续分析中，可使用尺寸过滤器去除二值化图像序列中比涡虫更小或更大的非目标物体图 2Ciii).
    6. 通过点击设置测量 分析 > 设置测量参数. 勾选以下复选框 面积, 质心, 堆栈位置，以及 拟合椭圆 并点击 好的.
      注意：这些参数只需在每次 Fiji 会话中设置一次。
    7. 选择打开的图像堆栈并选择 分析 > 分析颗粒.
    8. 在 分析颗粒 窗口，选择 显示 > 口罩 打开一个新窗口，显示使用所选参数检测到的所有对象。这可用于直观检查是否仅对涡虫进行了测量。在此步骤中，可通过输入涡虫的近似面积（以像素为单位）设置尺寸过滤器，以去除不需要的噪声2 在指定位置填写单位。勾选相应的复选框 显示结果 和 清晰的结果 并点击 好的.
      注意：在以下步骤中 结果 窗口中，若索引（第一列）与所有行的切片编号不一致，则表明追踪的对象过多或过少。造成此差异的可能原因之一是存在除涡虫以外的其他物体，或涡虫在某些帧中未被追踪。
    9. 使用面板底部的滑块浏览掩膜图像序列。如果存在噪声或某些帧中没有涡虫，请关闭 结果 窗口和蒙版图像堆栈。通过调整面积滤波器以仅去除除涡虫以外的物体，重复步骤 1.2.7–1.2.8。
      注意：如果掩膜中缺失了涡虫，则表明面积滤波器的下限值设置过高。
    10. 在 结果 窗口，使用以下方法保存数据 文件>另存为将文件名添加 .csv 扩展名以逗号分隔值格式保存数据。保存图像堆栈的数据后，关闭相应的图像堆栈，并 结果 和 口罩 窗口
    11. 导入数据后，可使用任意电子表格软件或免费软件进行进一步分析。计算滑行速度请参考第1.3节，计算收缩/蠕动完整参数集请参考第1.4节。
      注：此处可暂停本实验方案。
    12. 为确定像素与实际长度的换算关系，使用Fiji打开一张带有参考长度的图像（例如，实验区域的直径）。选择直线工具，在已知长度上绘制一条直线。
    13. 单击以将像素单位转换为标准长度单位 分析 > 设置比例尺. 在图像上输入对应所画线条的长度 已知距离 盒子和更改 长度单位 从 像素 到选定的标准长度单位。转换因子写在其旁边。 比例尺.
      注意：在1.3和1.4节的滑行或收缩/蠕动分析中，无需像素转换值。
  3. 滑行速度的计算
    1. 使用第1.2节中保存的数据文件，加载质心（COM）的x和y坐标以及主轴数据。如果数据以逗号分隔值文件格式保存，则这些列表分别对应于“XM”、“YM”和“Major”列。
    2. 计算位移 (d) 基于“XM”和“YM”数据列，以像素为单位计算每帧与下一帧之间涡虫质心的位移 (d) 由以下给出：
      距离公式方程；计算两点间距离的示意图，数学教学概念。
      其中 x1 和 y1 参考某一帧的 COM 坐标（XM, YM）和 x2 和 y2 参考后续帧的质心坐标（XM, YM）。
    3. 将涡虫体长设定为95th “Major”列的百分位数。由于涡虫表现出趋壁行为32，这确保了所计算的涡虫体长能够代表涡虫处于伸展状态时的长度24.
    4. 通过将每帧的像素位移除以涡虫体长，使位移量相对于涡虫体长标准化 (l)归一化位移 (dn) 由以下给出：
      衍射方程，\( d_n = \frac{d}{l} \)，用于说明衍射分析。
    5. 通过将归一化位移除以每帧所经过的时间（记录的帧率FPS的倒数），生成一组归一化速度。归一化滑行速度 （sn) 由以下给出：
      静态平衡方程，Sn = dn/(FPS)^-1，数学公式，用于教学。
    6. 通过计算归一化速度列表的平均值，得出涡虫的归一化滑行速度 （sn)标准偏差可作为涡虫的不确定性度量。
    7. 对每个待分析的涡虫重复步骤 1.3.1–1.3.6。计算所有涡虫滑行速度的平均值及标准差，分别得到涡虫种群的滑行速度及其相关不确定性。
  4. 使用完整参数集区分收缩运动与蠕动运动步态
    1. 从第1.2节保存的数据文件中加载主轴数据列表。如果数据保存为逗号分隔值文件，则对应于 主要 柱
    2. 创建一个列表，为每个数据点编号 主要 柱，从开始 0将此列表除以记录的帧率（FPS），转换为每帧所经过的时间。
    3. 绘制 主要 随时间变化的柱状数据，以生成挤压/蠕动振荡图（图3A）。利用振荡图，将数据截取为至少三个连续的、呈直线的振荡。图 3Bi）。将数据裁剪至局部峰（振荡最大伸长）或谷（振荡最小伸长）处开始和结束。
      注意：如果局部极值不近似相等（峰或谷的高度差异显著），则表明振荡并非直线型图 3Bii）。再提取至少三个连续的直线振荡序列。参见第1.2节。
    4. 通过重新绘制已裁剪的振荡序列，确认目标振荡序列已正确提取并裁剪 主要 关于时间的数据。在所有后续计算中使用此截断后的数据列表。
    5. 计算振荡频率 (νm)，除以振荡次数 (On) 除以修整主轴数据列表中的数据点总数 (N)将 FPS 乘以该值即可得到每秒振荡频率。
      公式，vm = FPS × (On/N)，表示速率计算；用于教学目的的示意图。
    6. 计算最大伸长率 |Δε|最大值)，减去最小绝对体长 (l分钟) 从绝对最大体长 (l最大值)通过除以绝对最大体长来归一化至伸长体长。
      最大应变分析公式 |Δε|max=(lmax−lmin)/lmax；静力学平衡方程
    7. 计算每体长单位的速度（v*m），将计算出的最大伸长量乘以振荡频率。
      动态系统分析中描述实验数据最大变化的速率方程
      注意：仅凭运动速度即可区分收缩型与蠕动型步态7.
    8. 计算用于延伸的时间比例 (f延长)，对修剪后的主轴数据列表关于时间求导。将正数据点的数量（即导数为正值时）除以 >0 (np)，除以主轴数据列表中的数据点总数（nt)).
      聚合物伸长分数方程，f_elon = n_p/n_t，公式，科学分析。
      注意：收缩运动的涡虫在伸长阶段所花费的时间比例不对称，而进行蠕动运动的涡虫在伸长和收缩阶段所花费的时间相等7.
    9. 对每个待分析的涡虫重复步骤 1.4.1–1.4.8。通过计算各参数的平均值和标准差，得出涡虫种群参数集。
      注意：该参数集可用于判断运动行为是收缩移动、蠕动，还是其他具有周期性体形变化的运动方式。对于特定物种而言，收缩移动和蠕动均具有固定的参数。7，其收缩参数通常大于蠕动参数7. 尽管有可能出现某个参数超出物种特异性范围的情况，正如我们先前在化学诱导中所观察到的那样28观察到的行为必须与已发表的4个参数中至少3个相符，才能被归类为蠕动或收缩运动。

2. Scrunching 诱导

  1. 物理刺激（有害温度、紫外光、截断）
    1. 所有物理刺激实验，请参考第1.1节中的实验装置。
      注意：建议使用较大的实验区域，例如直径100 mm的培养皿，以便为移液器和/或剃刀片的操作留出更充足的空间。
    2. 通过有害温度诱导涡虫收缩反应时，将涡虫用水在玻璃烧杯中（每只待测涡虫至少100 µL）置于加热板上加热至65 °C。
      1. 将一只涡虫置于实验区域中央，待其调整为正向姿态并开始滑行后，开始录像。
      2. 使用P-200移液器，缓慢地将100 µL 65 °C的涡虫用水移液至涡虫咽后部的尾端，以诱导其发生收缩反应。
        注意：确保加热的涡虫用水始终保持在65 °C。必要时，在开始下一次实验前重新加热至65 °C。由于压力本身也可能诱导收缩反应，因此必须缓慢移液。以相同方式移液室温涡虫用水可作为对照实验或练习手段。
      3. 当收缩反应停止后，停止录像。将涡虫移至恢复容器中，并在继续进行后续实验时，更换培养皿中的液体为新鲜的室温涡虫用水。
    3. 通过截断诱导涡虫收缩反应时，将一只涡虫转移至实验区域中央，待其调整为正向姿态并开始滑行后，开始录像。
      1. 使用洁净的剃刀片对涡虫进行截断。截断位置可在涡虫身体任意部位进行，但各次实验中切口位置必须保持一致。
        注意：收缩参数从截断后的前段部分提取。因此，在切割时应从后端接近，避免遮挡摄像头对前段部分的观察。塑料盖玻片也可用于切割，且更为安全，尤其适用于教学环境。
      2. 当前段部分停止收缩后，停止录像。取出前后两段组织，置于独立容器中，并使其再生7天。再生完成后，可将涡虫重新放回原饲养容器中。
    4. 使用近紫外光（near-UV light）诱导涡虫收缩反应时，应在相机镜头上安装适当的滤光片（例如Roscolux滤光片），以减少相机接收到的反射近紫外光，避免干扰对涡虫反应的成像。不要使用LED面板从下方照明实验区域，而应采用涡虫不敏感的环境红光照明33。
      1. 在直径100 mm的培养皿中加入涡虫用水，并将一只涡虫（5–9 mm）置于实验区域中央，以10 FPS的帧率开始录像。
      2. 将一支II类紫外激光笔（405 ± 10 nm，输出功率 <5 mW）置于距实验区域约30 cm处，将其以45°角对准滑行中的涡虫，并在咽后端与尾尖之间的中点位置照射5–10秒，以诱导收缩反应。
        注意：可使用对近紫外光敏感的功率计测量激光笔的输出功率。
      3. 待涡虫重新开始滑行后，对同一只个体再进行两次刺激，以检验反应的可重复性。若涡虫持续表现出相同行为，则停止录像并将其放回原容器中。若刺激之间的行为发生变化，则可通过额外测试确定哪种反应占主导地位。
        注意：涡虫可能对近紫外光产生脱敏，从而停止反应。连续刺激之间需间隔8–10秒的休息时间。
  2. 化学刺激（AITC）
    1. 使用化学物质（如TRPA1激动剂AITC28）诱导涡虫收缩反应时，理想方式是将涡虫完全浸没于该化学物质溶液中。必要时，也可采用第2.1.2.3节所述的移液方式施加刺激。
      警告：AITC具有易燃性，急性毒性，可引起皮肤和眼睛刺激，导致呼吸系统和皮肤致敏，且对水生生物有害。AITC油状物应在通风橱中操作。配制AITC储备液前，应穿戴适当的个人防护装备（腈类手套和实验服），并设置合适的固体和液体危险废物收集容器。
    2. 在通风橱中，用50 mL离心管将AITC溶于涡虫用水，配制成10 mM的储备液。该储备液在4°C保存条件下最长可使用一个月。
      1. 取上述储备液，用50 mL离心管配制25 mL含100 µM AITC的涡虫用水工作液。该100 µM AITC溶液将用于诱导涡虫的收缩反应。
        注意：100 µM AITC可在D. japonica和S. mediterranea涡虫中诱导出稳定的收缩反应28。对于其他水生涡虫，100 µM可作为起始浓度，并根据实际情况进行调整。
      2. 设置实验装置（参考第1.1节）。将工作液注入实验区域，并将该区域置于次级容器中。次级容器的容积应至少为实验区域容积的两倍。
        注意：为提高安全性，实验可在通风橱内进行。
      3. 将最多10只涡虫转移至实验区域中央，开始录像。
      4. 当涡虫脱敏并停止收缩反应后，停止录像。将涡虫从AITC溶液中取出并清洗（参考第1.1节）。将含AITC的固体和液体废物分别投入指定的危险废物容器中处理。
      5. 按照标准实验流程，通过TRPA1的RNAi技术28验证涡虫对AITC反应的特异性。

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结果

眼外近紫外光感知在 S. mediterranea 涡虫的TRPA1依赖性机制已被提出与H相关2O2 释放17. 因为 H2O2 暴露会诱导TRPA1依赖性的收缩反应 S. mediterranea 和 D. japonica 涡虫28，可使用第2.1.4节中的步骤来检测近紫外光照射是否在这两个物种中均诱导了scrunching现象。尽管 D. japonica 涡虫在暴露于近紫外光时会收缩（10/10） S. mediterranea 涡虫如前所述表现出尾部变细（7/10）17 或无反应（3/10）（图4A,4B）。按照第1.4节所述，对挤压参数进行量化，以 D. japonica 表现出至少3次连续直线收缩...

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讨论

利用本实验方案，可定量研究物理和化学刺激7,28,29 或基因操作（RNAi）28,29 对涡虫运动行为的影响。为最大限度提高空间分辨率，应将相机尽可能靠近实验区域，同时确保整个实验区域均位于视野范围内。为提高通量，可通过同时记录多只涡虫来一次性筛查其行为。当在同一实验区域内筛查多只涡虫时，可在Fiji中划定感兴趣区域以分离个体涡虫（如本文所述），或采用更先进的多目标追踪技术。在同一实验区域内放置多只涡虫的一个问题是它们可能发生路径交叉。该问题可通过使用多孔板将涡虫彼此隔离来解决，同时仍可实现对多个个体行为的同步记录与量化23,24。然而，在较小的实验区域内，涡虫在边缘区域停留的时间相对较长，这需要对图像分析方法进行调整...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Tapan Goel 先生对稿件的评论。本工作由美国国家科学基金会职业奖 1555109 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异硫氰酸烯丙酯，95%（AITC）Sigma-Aldrich377430-5G注意：  易燃且急性毒性；须在通风橱中佩戴适当的个人防护装备操作。
镜头，2/3英寸 25mm F/1.4 Tamron23FM25SP
细胞培养板，6孔，组织培养处理Genesee Scientific 25-105
离心管，50 mL 聚丙烯，无菌MedSupply Partners62-1019-2
肉桂醛，>95%Sigma-AldrichW228613-100G-K
可调光 A4 LED 追踪光源箱AmazonB07HD631RP
Flea3 USB3 相机FLIRFL3-U3-13E4M
耐热手套Fisher Scientific11-394-298
加热板Fisher ScientificHP88854200
Instant Ocean 海盐，用去离子水配制Instant OceanSS15-10用去离子水按 0.5 g/L 浓度配制。
Montjüic 盐溶液，用 Milli-Q 水配制Sigma-Aldrichvarious用 Milli-Q 水配制，含 1.6 mM NaCl、1.0 mM CaCl2、1.0 mM MgSO4、0.1 mM MgCl2、0.1 mM KCl、1.2 mM NaHCO3；用 HCl 调节 pH 至 7.0。
培养皿，100 mm × 20 mm，无菌聚苯乙烯SimportD210-7
移液器，20–200 μL 量程Rainin17008652
PYREX 150 mL 烧杯Sigma-AldrichCLS1000150
剃刀刀片，0.22 mmVWR55411-050
Roscolux 颜色滤光片：  金琥珀色RoscoR21也可选购 Roscolux 设计师颜色选择器（Musson Theatrical 产品编号 SBLUX0306），其中包含全部三种颜色滤光片。
Roscolux 颜色滤光片：  中红色RoscoR27
Roscolux 颜色滤光片：  斯托拉罗红色RoscoR2001
Samco 转移移液管，62 µL 大孔径Thermo Fisher691TS
支撑架 Fisher Scientific12-947-976
温度计VWR89095-600
紫外激光笔AmazonB082DGS86R此为 II 类激光（405 nm ±10 nm），输出功率 <5 mW。

参考文献

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