扁形虫收缩行为作为有害刺激感知的定量行为读出

摘要

淡水涡虫表现出三种运动方式（滑行、收缩蠕动和蜷缩运动），可通过定量行为分析加以区分。我们描述了一种利用多种有害刺激诱导蜷缩运动的方法，对其定量分析，并与收缩蠕动和滑行相区分。通过基因敲降实验，我们证明了蜷缩运动作为定量表型读数的特异性。

摘要

淡水涡虫通常依靠腹侧纤毛的推动而平滑滑行。然而，某些环境条件可诱导其产生由肌肉驱动的运动方式：收缩运动（peristalsis）或蜷缩运动（scrunching）。虽然收缩运动是由纤毛功能缺陷引起的，但蜷缩运动与纤毛功能无关，是涡虫对特定刺激的一种特异性反应，这些刺激包括截肢、有害温度、极端pH值以及乙醇。因此，这两种由肌肉驱动的运动方式在机制上是不同的。然而，它们在定性上可能难以区分。本文提供了一种利用多种物理和化学刺激诱导蜷缩运动的实验方案，并详细描述了如何使用免费软件对蜷缩运动进行定量表征，从而将其与收缩运动和滑行运动区分开来。由于蜷缩运动是一种普遍存在于各类涡虫中的运动模式，尽管存在物种特异性的差异，本方案在适当考虑物种差异的前提下，可广泛适用于所有涡虫物种。为验证这一点，我们比较了行为学研究中最常用的两种涡虫——Dugesia japonica 和 Schmidtea mediterranea——对同一组物理和化学刺激的反应。此外，由于蜷缩运动具有高度特异性，本方案还可与RNA干扰技术或药理学处理相结合，用于解析参与该行为的分子靶点和神经回路，从而为伤害感受和神经肌肉通讯的重要机制提供深入见解。

引言

除了在干细胞和再生研究中广受欢迎^1,2,3之外，淡水涡虫长期以来也被用于行为学研究^4,5，这得益于其相对较大的体型（体长数毫米）、易于在实验室中低成本维持培养，以及可观测行为的广泛性。计算机视觉和自动追踪技术引入涡虫行为研究^{6,7,8,9,10,11}后，使得行为表型能够被定量区分。动物行为是神经功能的直接读出指标。由于涡虫的神经系统具有中等的大小和复杂性，同时与脊椎动物大脑共享保守的关键元件^12,13,14，因此研究涡虫行为有助于揭示在更复杂的生物体中难以....

方案

1. 涡虫定量行为检测

1. 实验装置
   1. 将一个可调光 LED 面板放置于平坦表面上。LED 面板具有两个作用：（1）提供均匀的白色背景；（2）作为可调节的光源以获得适当的对比度。将一个直径 100 mm 的培养皿置于 LED 面板上。
      注意：为了提高通量，可使用多孔板作为实验区域^23,24但较大的区域有助于自动化图像分析。
   2. 将相机安装在实验区域上方的环形支架上（图1A）。根据需要调整相机的位置、高度和焦距，确保整个实验区域位于视野中央且清晰对焦（图1B).
      注意：相机分辨率需足够高，以清晰区分涡虫与LED面板提供的均匀背景。
   3. 用适当的暴露介质（涡虫水或化学溶液）填充至培养皿最大容量的一半（此状态称为浴液状态）。对于直径100 mm的培养皿，这大约相当于25 mL。打开LED面板，并关闭任何可能影响录制质量的其他光源（例如在培养皿表面产生眩光的附近光源）。
      警告：操作危险化学品溶液时，须穿戴全套个人防护装备（PPE），必要时将实验装置移至通风橱内进行。废弃物处置应遵循联邦和州的相关法规。
   4. 使用移液管将一只涡虫滴加到实验区域的中心。开始记录。以Fiji原生格式....

结果

眼外近紫外光感知在 S. mediterranea 涡虫的TRPA1依赖性机制已被提出与H相关₂O₂ 释放¹⁷. 因为 H₂O₂ 暴露可诱导TRPA1依赖性收缩反应 S. mediterranea 和 D. japonica 涡虫²⁸，可采用第2.1.4节中的步骤来检测近紫外光照射是否在这两个物种中均诱导了scrunching现象。尽管 D. japonica 涡虫在暴露于近紫外光时会收缩（10/10） S. mediterranea 涡虫表现出尾部变细（7/10），与先前描述一致¹⁷ 或无反应（3/10）（图4A,4B）。按照第1.4节所述，对挤压参数进行定量分析 D. japonica 表现出至少3次连续直.......

讨论

利用本实验方案，可定量研究物理和化学刺激^7,28,29 或基因操作（RNAi）^28,29 对涡虫运动行为的影响。为最大限度提高空间分辨率，应将相机尽可能靠近实验区域，同时确保整个实验区域均位于视野范围内。为提高通量，可通过同时记录多只涡虫来一次性筛查其行为。当在同一实验区域内筛查多只涡虫时，可在Fiji中划定感兴趣区域以分离个体涡虫（如本文所述），或采用更先进的多目标追踪技术。在同一实验区域内放置多只涡虫的一个问题是它们可能发生路径交叉。该问题可通过使用多孔板将涡虫彼此隔离来解决，同时仍可实现对多个个体行为的同步记录与量化^23,24。然而，在较小的实验区域内，涡虫在边缘区域停留的时间相对较长，这需要对图像分析方法进行调整.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异硫氰酸烯丙酯，95%（AITC）	Sigma-Aldrich	377430-5G	注意：  易燃且急性毒性；须在通风橱中佩戴适当的个人防护装备操作。
镜头，2/3英寸 25mm F/1.4	Tamron	23FM25SP
细胞培养板，6孔，组织培养处理	Genesee Scientific	25-105
离心管，50 mL 聚丙烯，无菌	MedSupply Partners	62-1019-2
肉桂醛，>95%	Sigma-Aldrich	W228613-100G-K
可调光 A4 LED 追踪光源箱	Amazon	B07HD631RP
Flea3 USB3 相机	FLIR	FL3-U3-13E4M
耐热手套	Fisher Scientific	11-394-298
加热板	Fisher Scientific	HP88854200
Instant Ocean 海盐，用去离子水配制	Instant Ocean	SS15-10	用去离子水按 0.5 g/L 浓度配制。
Montjüic 盐溶液，用 Milli-Q 水配制	Sigma-Aldrich	various	用 Milli-Q 水配制，含 1.6 mM NaCl、1.0 mM CaCl2、1.0 mM MgSO4、0.1 mM MgCl2、0.1 mM KCl、1.2 mM NaHCO3；用 HCl 调节 pH 至 7.0。
培养皿，100 mm × 20 mm，无菌聚苯乙烯	Simport	D210-7
移液器，20–200 μL 量程	Rainin	17008652
PYREX 150 mL 烧杯	Sigma-Aldrich	CLS1000150
剃刀刀片，0.22 mm	VWR	55411-050
Roscolux 颜色滤光片：  金琥珀色	Rosco	R21	也可选购 Roscolux 设计师颜色选择器（Musson Theatrical 产品编号 SBLUX0306），其中包含全部三种颜色滤光片。
Roscolux 颜色滤光片：  中红色	Rosco	R27
Roscolux 颜色滤光片：  斯托拉罗红色	Rosco	R2001
Samco 转移移液管，62 µL 大孔径	Thermo Fisher	691TS
支撑架	Fisher Scientific	12-947-976
温度计	VWR	89095-600
紫外激光笔	Amazon	B082DGS86R	此为 II 类激光（405 nm ±10 nm），输出功率 <5 mW。